郝思雯，馬力通,2*

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.生物煤化工綜合利用內(nèi)蒙古自治區(qū)工程研究中心，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

泥炭地是有泥炭賦存的地段，由于自然及人為因素的影響導(dǎo)致泥炭地退化，泥炭分解加劇，因此，搶救性開發(fā)退化泥炭地的泥炭資源具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。泥炭是未完全腐敗分解的沼澤動(dòng)植物殘?bào)w，在潮濕偏酸環(huán)境中經(jīng)時(shí)間與壓力積累形成有機(jī)質(zhì)礦體[1]，主要用于育苗基質(zhì)和有機(jī)肥生產(chǎn)。泥炭通過厭氧發(fā)酵可直接轉(zhuǎn)化為生物甲烷[2-3]，實(shí)現(xiàn)泥炭資源就地轉(zhuǎn)化。但泥炭轉(zhuǎn)化存在甲烷產(chǎn)量較低的問題，高效穩(wěn)定的微生物生態(tài)系統(tǒng)是厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的保證，是甲烷轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系穩(wěn)定運(yùn)行的關(guān)鍵，而微生物群落結(jié)構(gòu)決定其生態(tài)系統(tǒng)功能，因此，深入解析微生物群落結(jié)構(gòu)特征，是指導(dǎo)泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷的關(guān)鍵。楊秀清等[4]研究了褐煤厭氧發(fā)酵過程中乙醇對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷古菌主要為甲烷桿菌屬(Methanobacterium)和甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)，其中甲烷八疊球菌屬相對豐度達(dá)60%，為褐煤厭氧發(fā)酵體系優(yōu)勢古菌菌屬。賈璇等[5]研究了蘆葦厭氧聯(lián)產(chǎn)氫氣-甲烷過程中古菌群落結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氫階段優(yōu)勢古菌為unculturedMethanosarcinalesarchaeon，產(chǎn)甲烷階段優(yōu)勢古菌為Methanoculleusbourgensis。Han等[6]研究了青海高原沼氣池微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷古菌分屬于10個(gè)屬，其中產(chǎn)甲烷菌屬(Methanogenium，38.5%)為優(yōu)勢菌屬。Ciccoli等[7]研究了菊芋厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的產(chǎn)量和微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)風(fēng)干菊芋發(fā)酵產(chǎn)甲烷的產(chǎn)量較高，優(yōu)勢菌屬為甲烷囊菌屬(Methanoculleus)。以上關(guān)于發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程微生物群落結(jié)構(gòu)演替的文獻(xiàn)報(bào)道涉及不同原料，但目前未見涉及泥炭的研究。鑒于此，作者以草本泥炭為原料進(jìn)行厭氧發(fā)酵，利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)-變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)對泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中古菌群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，為進(jìn)一步改進(jìn)泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷工藝、提高甲烷產(chǎn)量、促進(jìn)泥炭生物轉(zhuǎn)化提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

活性污泥，采自包頭市南郊污水處理廠，經(jīng)厭氧馴化后儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中；草本泥炭，購自吉林省敦化市。

1.2 方法

1.2.1 泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷

采用AMPTS Ⅱ型全自動(dòng)甲烷潛力測試系統(tǒng)進(jìn)行泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷實(shí)驗(yàn)。將40 g粉碎至粒徑為150 μm(100目)的草本泥炭和200 mL活性污泥置于發(fā)酵瓶中，調(diào)節(jié)初始pH值為7.0，加蒸餾水至發(fā)酵總體積為400 mL，充氮?dú)?20 s(提供厭氧條件)，發(fā)酵溫度35 ℃。在發(fā)酵過程中，通過電機(jī)自動(dòng)控制攪拌時(shí)間1 min，每次間隔30 min。在發(fā)酵第1 d、第6 d、第12 d、第18 d、第24 d取樣，編號分別為S-1、S-6、S-12、S-18、S-24。

1.2.2 DNA提取

采用改良CTAB法提取樣品基因組DNA。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

以樣品基因組DNA為模板，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增：首先采用引物Arch21F：5′-TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3′，1492r：5′-GGCTACCTTGTTACGA CTT-3′對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增；然后采用引物1106f-GC/1378r對產(chǎn)甲烷古菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE分析

取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。變性梯度為32%～62%，采用8%聚丙烯酰胺凝膠，在1×TAE緩沖液中于85 V、60 ℃下電泳16 h。

1.2.5 DGGE優(yōu)勢條帶的回收、測序與分析

用滅菌的手術(shù)刀切下DGGE優(yōu)勢條帶，回收后，以2 μL回收產(chǎn)物為模板、1106f-GC/1378r為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

將重新擴(kuò)增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到pMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆，進(jìn)行序列測定。

采用Quantity One軟件對DGGE圖譜中條帶數(shù)目、條帶灰度進(jìn)行數(shù)字化分析，采用Canoco軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)。采用DNAstar和Cluster軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，下載最相似的菌株序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列。采用MEGA軟件，通過Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)(bootstrap)為1 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以樣品基因組DNA為模板，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，5種樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE圖譜(圖1)均顯示得到約350 bp的DNA片段，擴(kuò)增效果良好，可進(jìn)行DGGE分析。

圖1 5種樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE圖譜Fig.1 DGGE profile of PCR amplification products of five samples

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE分析及多樣性分析

DGGE只能對菌群數(shù)量大于1%的微生物群落進(jìn)行分析，DGGE圖譜中的條帶灰度、數(shù)目和位置代表微生物群落菌群的豐度及多樣性，條帶的出現(xiàn)或消失說明相應(yīng)的菌群可能發(fā)生變化[8]。對5種樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析，利用Quantity One軟件繪制對應(yīng)的模式圖，結(jié)果如圖2所示。

圖2 5種樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE圖譜及其對應(yīng)的模式圖Fig.2 DGGE profile of PCR amplification products of five samples and corresponding pattern diagram

由圖2可知，DGGE圖譜條帶清晰，表明PCR擴(kuò)增結(jié)果得到預(yù)期效果。5種樣品(不同發(fā)酵時(shí)期)產(chǎn)甲烷古菌菌群條帶數(shù)目、位置及灰度存在差異：發(fā)酵初期條帶數(shù)目較多，但條帶灰度較低，表明發(fā)酵初期古菌菌群豐富，具有多樣性，但菌群豐度較低；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，條帶3、4、11、13的灰度逐漸升高，而條帶1、2、7、12的灰度逐漸降低甚至消失，其余條帶則始終維持較高灰度，未受發(fā)酵進(jìn)程影響。不同發(fā)酵時(shí)期DGGE圖譜有許多相同條帶，如條帶2、4、6、8、9、10，這些條帶對應(yīng)的古菌為整個(gè)發(fā)酵進(jìn)程共有，而一些條帶只在特定時(shí)期出現(xiàn)，為某發(fā)酵時(shí)期特征條帶，如條帶1、5、7為發(fā)酵初期特征條帶，條帶14為發(fā)酵末期特征條帶。以上表明，隨著泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷的進(jìn)行，產(chǎn)甲烷古菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了演替。

DGGE圖譜中的條帶灰度代表微生物豐度。從5種樣品DGGE圖譜條帶灰度(表1)可知，在發(fā)酵初期，條帶8的灰度最高(232.93)，表明此古菌豐度最高，為產(chǎn)甲烷優(yōu)勢古菌；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，優(yōu)勢古菌及其豐度發(fā)生改變，發(fā)酵6 d時(shí)條帶9的灰度最高(235.37)，發(fā)酵18 d時(shí)條帶8的灰度又達(dá)到最高(236.70)，發(fā)酵末期條帶8的灰度仍維持最高。表明在泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷進(jìn)程中優(yōu)勢古菌發(fā)生了演替。

表1 5種樣品DGGE圖譜條帶灰度

對5種樣品DGGE圖譜進(jìn)行分析，得到泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中古菌群落結(jié)構(gòu)特征指數(shù)，見表2。

表2 泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中古菌群落結(jié)構(gòu)特征指數(shù)

由表2可知，泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中，古菌群落結(jié)構(gòu)特征指數(shù)(香農(nóng)指數(shù)、均一度指數(shù)和豐富度指數(shù))雖有差異，但變化趨勢相同，均在發(fā)酵18 d時(shí)達(dá)到最大值，香農(nóng)指數(shù)為2.393 4，均一度指數(shù)為0.998 1，豐富度指數(shù)為11。5種樣品(不同發(fā)酵時(shí)期)的豐富度指數(shù)均達(dá)到或超過9，表明泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中古菌菌群豐富，其中樣品S-18(發(fā)酵第18 d)的豐富度指數(shù)達(dá)到11，表明發(fā)酵18 d時(shí)古菌群落含有11種產(chǎn)甲烷古菌，其群落多樣性高于其它時(shí)期[9]。

2.3 不同發(fā)酵時(shí)期泥炭產(chǎn)甲烷古菌群落結(jié)構(gòu)相似性分析

依據(jù)PCR-DGGE圖譜，分析5種樣品(不同發(fā)酵時(shí)期)古菌群落結(jié)構(gòu)的相似性，結(jié)果見表3。

表3 5種樣品古菌群落結(jié)構(gòu)的相似性

由表3可知，泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷初期與其它時(shí)期產(chǎn)甲烷古菌群落結(jié)構(gòu)存在較大差異，其中發(fā)酵初期(第1 d)與發(fā)酵末期(第24 d)時(shí)的古菌群落結(jié)構(gòu)差異最大，相似性最低，僅為0.50；發(fā)酵第6 d與第12 d時(shí)的古菌群落結(jié)構(gòu)基本相似，相似性達(dá)0.88；發(fā)酵第18 d與第12 d時(shí)的古菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高，達(dá)0.85；發(fā)酵第24 d與第18 d時(shí)的古菌群落結(jié)構(gòu)相似性達(dá)0.80。

泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷古菌的聚類分析(圖3)表明：發(fā)酵第6 d與第12 d時(shí)的古菌群落結(jié)構(gòu)相似度高達(dá)0.88；而發(fā)酵第18 d與第12 d、第6 d時(shí)的古菌群落結(jié)構(gòu)相似度降為0.81；發(fā)酵第24 d與第18 d、第12 d、第6 d時(shí)的古菌群落結(jié)構(gòu)相似度又有所下降，降至0.77；發(fā)酵第1 d與其它發(fā)酵時(shí)期的古菌群落結(jié)構(gòu)相似度最低，為0.65。泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷古菌的主成分分析(圖4)表明：發(fā)酵第12 d和第24 d時(shí)的古菌群落結(jié)構(gòu)相似，發(fā)酵初期與其它發(fā)酵時(shí)期的古菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯。以上表明，隨著泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷的進(jìn)行，產(chǎn)甲烷古菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了演替。

圖3 泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷古菌的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of archaea in methanogenesis with peat

圖4 泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷古菌的主成分分析Fig.4 PCA of archaea in methanogenesis with peat

2.4 DGGE圖譜條帶的序列比對

對圖2中具代表性的14個(gè)條帶進(jìn)行克隆測序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已有序列進(jìn)行比對分析，得到泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中古菌群落結(jié)構(gòu)的同源性信息(表4)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。

由表4和圖5可知，泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中古菌群落結(jié)構(gòu)具有多樣性，各條帶序列與近緣種的相似度為0.84～1.00，條帶4、9最相似菌株為Methanosaetaharundinacea，條帶7、8、11最相似菌株為Methanosaetaconcilii，條帶10、12、13、14最相似菌株為Methanolineatarda，條帶3最相似菌株為Methanobacteriumbeijingense，條帶6最相似菌株為Methanobacteriumsubterraneum，條帶1、2、5最相似菌株為Methanobrevibacterruminantium。 產(chǎn)甲烷古菌均屬于廣古菌門(Euryarchaeota)，分屬于3個(gè)古菌菌目，包括甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)、甲烷桿菌目(Methanobacteriales)和甲烷微菌目(Methanomicrobiales)，分屬于4個(gè)古菌菌屬，包括甲烷鬃菌屬(Methanosaeta)、甲烷繩菌屬(Methanolinea)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)和甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)，其中甲烷鬃菌屬為泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中的優(yōu)勢菌屬。

表4 泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中古菌群落結(jié)構(gòu)的同源性信息

圖5 泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷古菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of archaea in methanogenesis with peat

2.5 泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中古菌群落結(jié)構(gòu)演替

從泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中的古菌菌群相對豐度(圖6)可知，隨著泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷的進(jìn)行，古菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其中甲烷鬃菌屬(Methanosaeta)的相對豐度呈先升高后降低的趨勢，維持在36.37%～50.00%之間，是泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中的優(yōu)勢菌屬；甲烷繩菌屬(Methanolinea)的相對豐度由20.00%逐漸升至30.00%；甲烷桿菌屬(Methanobacterium)的相對豐度先升高后趨于穩(wěn)定，發(fā)酵末期相對豐度為20.00%；而甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)的相對豐度由30.00%降至10.00%。表明泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中古菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了演替。

圖6 泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中的古菌菌群相對豐度Fig.6 Relative abundance of archaea in methanogenesis with peat

泥炭富含有機(jī)質(zhì)，有機(jī)質(zhì)厭氧降解產(chǎn)生短鏈脂肪酸(VFA)、H2/CO2和各種醇類化合物，產(chǎn)甲烷古菌可以利用系統(tǒng)中的乙酸及H2/CO2轉(zhuǎn)化產(chǎn)甲烷，保證有機(jī)質(zhì)厭氧降解持續(xù)穩(wěn)定進(jìn)行[10-11]。其中優(yōu)勢菌屬甲烷鬃菌屬只利用乙酸產(chǎn)甲烷，是專性乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，常見于厭氧反應(yīng)器和湖底沉積物微生物群落中[12-13]；甲烷繩菌屬和甲烷桿菌屬均利用H2/CO2生長，為氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，常見于厭氧反應(yīng)器、水稻田、凍土層、淡水和海洋沉積物微生物群落中[14-17]；甲烷短桿菌屬利用H2/CO2生長，為氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，常見于哺乳動(dòng)物糞便、白蟻腸道和厭氧反應(yīng)器中[18-19]。

2.6 不同原料發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中的優(yōu)勢古菌分析(表5)

表5 不同原料發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中的優(yōu)勢古菌分析

由表5可知，發(fā)酵原料不同，產(chǎn)甲烷過程中的優(yōu)勢菌屬不同，產(chǎn)甲烷途徑也存在差異。當(dāng)發(fā)酵原料為秸稈[20]時(shí)，優(yōu)勢菌屬為甲烷八疊球菌屬，屬于氫營養(yǎng)型、甲基營養(yǎng)型和乙酸營養(yǎng)型混合古菌，可利用H2/CO2、甲基類化合物、乙酸底物轉(zhuǎn)化生成甲烷[11]；當(dāng)發(fā)酵原料為牛糞[21]時(shí)，優(yōu)勢菌屬為甲烷囊菌屬，屬于氫營養(yǎng)型古菌，可利用H2/CO2、甲酸轉(zhuǎn)化生成甲烷[11]；當(dāng)發(fā)酵原料為雞糞[22]時(shí)，優(yōu)勢菌屬為產(chǎn)甲烷菌屬，屬于氫營養(yǎng)型古菌；當(dāng)發(fā)酵原料為褐煤[23]時(shí)，優(yōu)勢菌屬為甲烷卵圓形菌屬(Methanocalculus)，屬于氫營養(yǎng)型古菌，可利用H2/CO2、甲酸轉(zhuǎn)化生成甲烷；本研究以泥炭為發(fā)酵原料，優(yōu)勢菌屬為甲烷鬃菌屬，是專性乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，只能利用乙酸產(chǎn)甲烷，將乙酸分子的甲基轉(zhuǎn)化為甲烷[24]。甲烷繩菌屬、甲烷桿菌屬和甲烷短桿菌屬屬于氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，通過CO2還原途徑產(chǎn)甲烷，以H2作為電子供體，通過氫酶作用還原CO2，進(jìn)而轉(zhuǎn)化生成甲烷[25]。泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中的優(yōu)勢菌屬為甲烷鬃菌屬，與其它發(fā)酵基質(zhì)產(chǎn)甲烷古菌優(yōu)勢菌屬不同，泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷的途徑主要為乙酸營養(yǎng)型代謝類型，同時(shí)伴隨氫營養(yǎng)型代謝類型。

3 結(jié)論

泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中的古菌菌群均屬于廣古菌門，包括甲烷鬃菌屬、甲烷繩菌屬、甲烷桿菌屬和甲烷短桿菌屬，其中甲烷鬃菌屬為優(yōu)勢菌屬；研究泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程古菌群落結(jié)構(gòu)有利于進(jìn)一步改進(jìn)泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷工藝，提高甲烷產(chǎn)量，促進(jìn)泥炭就地轉(zhuǎn)化。

在泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中，古菌菌群的豐度發(fā)生波動(dòng)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，甲烷鬃菌屬的相對豐度最高，維持在36.37%～50.00%之間，甲烷繩菌屬和甲烷桿菌屬的相對豐度分別升至30.00%和20.00%，而甲烷短桿菌屬的相對豐度逐漸降低，發(fā)酵末期僅為10.00%。泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程實(shí)質(zhì)上是多種古菌菌群的物質(zhì)代謝和能量代謝過程，對古菌群落結(jié)構(gòu)演替的認(rèn)知有助于構(gòu)建出可以服務(wù)于生物甲烷工業(yè)生產(chǎn)的人工混合菌群，通過調(diào)節(jié)環(huán)境條件中的溫度、pH值等參數(shù)，有效協(xié)調(diào)菌群間的關(guān)系，使其達(dá)最佳生態(tài)水平，發(fā)揮泥炭轉(zhuǎn)化甲烷最大效應(yīng)。

泥炭發(fā)酵產(chǎn)甲烷途徑主要為乙酸營養(yǎng)型代謝類型，同時(shí)伴隨氫營養(yǎng)型代謝類型。甲烷鬃菌屬為優(yōu)勢古菌，是專性乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，只利用乙酸產(chǎn)甲烷；甲烷繩菌屬、甲烷桿菌屬和甲烷短桿菌屬屬于氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，利用H2/CO2轉(zhuǎn)化生成甲烷。不產(chǎn)甲烷微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)演替及其與產(chǎn)甲烷古菌群落之間的協(xié)同作用機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。