郝一銘,楊子慧,劉 潔,王子元,王 靜
(北京工商大學(xué) 中加食品營養(yǎng)與健康聯(lián)合實驗室,北京 100048)
肥胖伴隨的慢性低度炎癥加速巨噬細胞對脂肪組織的浸潤,加速脂肪組織脂質(zhì)分解,導(dǎo)致機體胰島素抵抗[1]。肥胖人群脂肪組織中的脂肪細胞和巨噬細胞相互作用,促進巨噬細胞活化為炎性巨噬細胞(M1),進而提高促炎細胞因子分泌,如白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)等[2]。炎性巨噬細胞分泌的促炎性細胞因子會導(dǎo)致胰島素受體底物-1(IRS-1)發(fā)生降解,從而損傷脂肪細胞的胰島素敏感性[3]。胰島素受體底物-1/磷酸肌醇3-激酶/Akt(IRS-1/PI3K/Akt)是受胰島素調(diào)節(jié)的一條重要分子信號通路,IRS-1的降解可能影響IRS-1/PI3K/Akt通路下游葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)的表達[2-3]。作為調(diào)控葡萄糖吸收的關(guān)鍵蛋白,GLUT4表達的下調(diào)最終導(dǎo)致脂肪細胞葡萄糖攝取的阻斷[4]。此外,脂肪組織在炎癥環(huán)境下發(fā)生脂質(zhì)分解,釋放更多游離脂肪酸,導(dǎo)致肥胖人群的血漿游離脂肪酸水平普遍較高[5-6],而血漿中游離脂肪酸含量的升高會進一步引發(fā)機體的胰島素抵抗[7]。
流行病學(xué)研究表明,全谷物膳食可降低肥胖、2型糖尿病、心血管疾病的病發(fā)和死亡風(fēng)險[8-11]。全谷物的健康功效歸因于其麩皮中含有的功能活性成分,例如膳食纖維及多酚等植物化學(xué)素。烷基間苯二酚(alkylresorcinols,ARs)是存在于小麥和黑麥中一種酚類類脂,在每克小麥麩皮中約含有300~1 500 μg[12]。已有研究表明,60%的ARs進入人體后會被小腸吸收,因此常被作為全谷物膳食的重要生物標志物[13]。近年來,ARs作為重要的全谷物活性功能成分,被報道具有抗氧化[14]、抗炎[15]、神經(jīng)保護[16]等多種生物活性。Zhu等[13,17]發(fā)現(xiàn),ARs可以有效抑制結(jié)腸癌細胞的生長,并且不同烷基鏈長度的ARs之間的抑制活性具有差異;Oishi等[18]的研究表明,高脂飼料中添加質(zhì)量分數(shù)為0.4%的ARs,能夠改善高脂飲食導(dǎo)致的小鼠胰島素抵抗。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn),ARs通過抑制NF-κB和JNK/MAPK信號通路,可以抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞炎癥因子表達[15];ARs通過Akt依賴的Nrf2/HO-1信號通路,可以保護ARPE-19細胞免受氧化應(yīng)激損傷[14];ARs主要活性單體AR-C17可以通過調(diào)節(jié)SIRT3/SOD2信號通路改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的認知障礙和神經(jīng)炎癥[16]。
近年來的研究表明,人體脂肪組織中的ARs含量可達到883~1 142 pmol/g,因此ARs在人體脂肪中的含量被作為檢測人們長時間進食全谷物膳食的生物標志物[19]。目前,關(guān)于ARs對于脂肪細胞的健康效應(yīng)尚不清楚,ARs是否可以改善肥胖導(dǎo)致的脂肪細胞胰島素抵抗作用的機制尚未見報道。本研究擬通過建立體外模擬炎癥誘導(dǎo)的脂肪細胞胰島素抵抗模型,評價小麥ARs對于脂肪細胞脂質(zhì)分解和葡萄糖利用的改善作用,進一步解析其改善脂肪細胞胰島素抵抗的分子作用機制并明確其活性單體,希望為全谷物膳食抑制肥胖及由肥胖導(dǎo)致的胰島素抵抗提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。
十七烷基間苯二酚(AR-C17)、十九烷基間苯二酚(AR-C19)、二十一烷基間苯二酚(AR-C21)、二十三烷基間苯二酚(AR-C23)和二十五烷基間苯二酚(AR-C25)標準品,購自美國Sigma-Aldrich公司;濟麥22號小麥麩皮中ARs制備方法及含量測定參考文獻[15]中方法,其中ARs各主要組成單體質(zhì)量分數(shù)依次為:AR-C17,1.5%;AR-C19,20.8%;AR-C21,58.2%;AR-C23,9.0%和AR-C25,10.5%。3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰島素、LPS、噻唑藍(MTT)、PI3K抑制劑(LY294002),購自美國Sigma-Aldrich公司;Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)高糖培養(yǎng)基、小牛血清(NBCS)、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素、0.25% 胰蛋白酶,購自美國Gibco公司;甘油含量檢測試劑盒,購自南京建成生物工程研究所;葡萄糖吸收轉(zhuǎn)運熒光探針(2-NBDG)吸收試劑盒,購自美國BioVision公司;磷酸化Akt(Ser473)多克隆抗體、Akt多克隆抗體、GLUT4多克隆抗體、β-actin多克隆抗體,購自武漢ABclonal公司;3T3-L1和RAW 264.7細胞系,購自美國ATCC。所有其他化學(xué)品和溶劑均為分析純。
GEN5型多功能酶標儀,美國Bio-Tek公司;IX73型熒光顯微鏡,日本奧林巴斯公司;HF90型二氧化碳生化培養(yǎng)箱,上海力康公司;ChemiDoc成像系統(tǒng)、Mini-Trans-Blot全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng),美國Bio-Rad公司;YJ-VS-1型超凈工作臺,濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司;5427R型低溫高速離心機,德國Eppendorf公司;Mini-Protean型蛋白電泳儀,美國伯樂公司。
1.3.1炎癥誘導(dǎo)培養(yǎng)基制備
RAW 264.7巨噬細胞采用DMEM與體積分數(shù)為10%的FBS培養(yǎng)基,并置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2環(huán)境中培養(yǎng)。將RAW 264.7細胞按照2×105個/mL接種于細胞培養(yǎng)皿上,培養(yǎng)24 h后進行分組。設(shè)置對照組和LPS炎癥誘導(dǎo)組。對照組:更換新鮮的正常培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h;炎癥模型組:更換含有1 μg/mL LPS的正常培養(yǎng)基,誘導(dǎo)細胞炎癥反應(yīng)24 h[20]。收集巨噬細胞上清液培養(yǎng)基,分別作為空白培養(yǎng)基和炎癥誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
1.3.23T3-L1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化與處理
細胞分化流程參照文獻[21],具體操作方法:3T3-L1細胞采用DMEM與體積分數(shù)為10%的NBCS培養(yǎng)基,置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2環(huán)境中培養(yǎng)。按照融合度60%將3T3-L1細胞接種到培養(yǎng)板中,用生長培養(yǎng)基(DMEM+10% NBCS)培養(yǎng)至細胞完全融合,繼續(xù)培養(yǎng)2 d讓細胞產(chǎn)生接觸抑制。加入誘導(dǎo)液Ⅰ(高糖DMEM+10% FBS,10 μg/mL胰島素,1 μmol/L地塞米松,0.5 mmol/L IBMX 的培養(yǎng)液)培養(yǎng)2 d后,替換為誘導(dǎo)液 Ⅱ(高糖DMEM+10% FBS,10 μg/mL胰島素培養(yǎng)液),繼續(xù)培養(yǎng)2 d,最終換成高糖培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS)培養(yǎng)2 d,即得到分化成熟的脂肪細胞。分化成熟的脂肪細胞分別加入5、10、20 μmol/L的ARs及20 μmol/L ARs各單體化合物(AR-C17、AR-C19、AR-C21、AR-C23、AR-C25)處理24 h,換炎癥誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理24 h,再分別檢測各指標。細胞模型及分組情況見表1。
表1 脂肪細胞模型的構(gòu)建Tab.1 Construction of adipocyte model
1.3.3細胞活力檢測
分化成熟的3T3-L1脂肪細胞加入終濃度為5、10、20 μmol/L的ARs培養(yǎng)基作用24 h;更換等體積的含0.5 mg/mL MTT的新鮮培養(yǎng)基,并在37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)4 h;去除上清液后,用1 000 μL二甲基亞砜溶解沉淀結(jié)晶紫,使用酶標儀在490 nm處測量吸光值。
1.3.4PI3K抑制劑干擾處理
3T3-L1前脂肪細胞分化成熟后,加入ARs處理24 h,換含有1 μmol/L LY294002的新鮮培養(yǎng)基處理24 h,吸取上清液后,PBS清洗2次,換炎癥誘導(dǎo)培養(yǎng)基CM處理24 h,檢測脂質(zhì)分解及葡萄糖吸收指標。
1.3.5脂肪細胞葡萄糖吸收與脂質(zhì)分解檢測
通過檢測2-NBDG熒光強度評價細胞葡萄糖吸收水平。3T3-L1成熟脂肪細胞經(jīng)過不同處理后,收集細胞上清培養(yǎng)液,通過檢測甘油含量測試脂質(zhì)分解程度。根據(jù)2-NBDG吸收試劑盒操作說明,將葡萄糖攝取增強劑按照體積比1∶100加入到DMEM培養(yǎng)基中,細胞繼續(xù)更換含有100 μg/mL 2-NBDG的DMEM(含葡萄糖攝取增強劑)培養(yǎng)基,培養(yǎng)30 min,吸取上清液,PBS清洗2遍后,采用質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛溶液固定細胞0.5 h,并用DAPI溶液染色5 min。脂肪細胞葡萄糖吸收能力用脂肪細胞在激發(fā)/發(fā)射波長465/540 nm (2-NBDG)與358/461 nm (DAPI)處的熒光強度比值表示,并與NC組進行歸一化。
1.3.6油紅O染色
3T3-L1成熟脂肪細胞經(jīng)過不同處理后,移除上清液,并用PBS洗滌3次。采用體積分數(shù)為4%的多聚甲醛溶液固定細胞1 h,移除甲醛溶液并用PBS再次清洗兩遍。采用體積分數(shù)為60%的異丙醇媒染15 s,油紅O試劑染色30 min。終止染色后移除染液,用體積分數(shù)為60%的異丙醇洗滌15 s去除多余的油紅O試劑。用PBS清洗3次后顯微鏡觀察并拍照,每孔加入1 000 μL異丙醇,震蕩5 min洗出油紅O。每孔取200 μL洗出油紅的異丙醇溶液,轉(zhuǎn)移至96孔板中,于490 nm處測定吸光值。
1.3.7蛋白質(zhì)印跡實驗
3T3-L1脂肪細胞經(jīng)過不同處理后,采用RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液[含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)]抽提脂肪細胞總蛋白,12 000 r·min-1離心20 min,收集細胞裂解上清液。BCA法測定細胞裂解液總蛋白濃度,95 ℃變性蛋白。采用質(zhì)量分數(shù)為12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白各個條帶,每個泳道蛋白樣品上樣量為60 μg。SDS-PAGE分離結(jié)束后,將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC)分離,采用質(zhì)量分數(shù)為5%脫脂奶粉的Western洗滌緩沖液(TBST)室溫封閉1 h,4 ℃過夜孵育目的蛋白抗體(按體積比例1∶1 000稀釋anti-GLUT4、anti-p-Akt、anti-Akt和anti-β-actin)。將NC膜用TBST清洗3次,采用Alexa 488 標記的山羊抗兔IgG(按體積比例1∶10 000稀釋)二抗,室溫孵育1 h。采用成像系統(tǒng)分析蛋白條帶熒光值。
實驗均重復(fù)3次,采用Graphpad Prism 8.0和SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。實驗結(jié)果以平均值±標準偏差表示,組間比較采用One-way ANOVA和Duncan后比較分析,不同字母表示不同樣本同一指標差異顯著(P<0.05)。
ARs對炎癥誘導(dǎo)的脂肪細胞糖脂代謝的影響,實驗結(jié)果見圖1。由圖1(a)可知,5~20 μmol/L ARs未對脂肪細胞產(chǎn)生毒性影響。進一步建立脂肪細胞胰島素抵抗模型,研究5~20 μmol/L ARs對脂肪細胞葡萄糖吸收與利用的保護作用。由圖1(b)可知,與空白組相比,炎癥誘導(dǎo)下3T3-L1脂肪細胞2-NBDG攝取水平顯著降低了43.0%(P<0.05);同時,ARs(5~20 μmol/L)可以劑量依賴性地提高3T3-L1脂肪細胞糖吸收水平。用5、10、20 μmol/L ARs處理的3T3-L1脂肪細胞,顯著增加了炎癥誘導(dǎo)下的2-NBDG攝取量,分別較CM炎癥誘導(dǎo)組提高了4.3%、10.2% 和24.0%,表明ARs對炎癥誘導(dǎo)的脂肪細胞糖脂代謝紊亂具有保護作用。脂肪細胞脂質(zhì)過度分解通常被視為機體產(chǎn)生胰島素抵抗性的主要原因[22]。有研究表明,炎癥引發(fā)的脂解作用會誘導(dǎo)大量的游離脂肪酸的產(chǎn)生,從而進一步破壞細胞胰島素信號,最終導(dǎo)致胰島素抵抗性的發(fā)生[23-25]。由圖1(c)和(d)可知:炎癥誘導(dǎo)的脂肪細胞脂質(zhì)含量與NC組相比降低了32.3%,而甘油釋放量顯著增加了86.5%,表明炎癥導(dǎo)致脂肪細胞脂質(zhì)分解;20 μmol/L ARs 顯著逆轉(zhuǎn)了炎癥造成的脂肪細胞脂質(zhì)含量和甘油釋放紊亂(P<0.05),進而抑制了脂肪細胞脂質(zhì)分解。
不同字母表示不同樣本同一指標差異顯著(P<0.05)。圖1 ARs對炎癥誘導(dǎo)的脂肪細胞糖脂代謝的影響Fig.1 Effect of ARs on glucose and lipid metabolism of adipocytes under inflammatory stress
顯微鏡觀察脂肪細胞油紅O染色結(jié)果見圖2。由圖2可知,經(jīng)炎癥誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理后,3T3-L1脂肪細胞中的脂滴形態(tài)出現(xiàn)明顯減小,而AH組脂肪細胞中的脂滴形態(tài)恢復(fù)至正常情況。3T3-L1脂肪細胞中的油紅O觀察結(jié)果與圖1中的細胞脂質(zhì)含量和甘油釋放量結(jié)果相一致,說明ARs顯著改善了炎癥導(dǎo)致的3T3-L1脂肪細胞脂解作用。研究結(jié)果表明,ARs是通過改善炎癥引發(fā)的脂肪細胞脂解,來緩解胰島素抵抗,進而維持脂肪細胞正常生理功能的[23]。
不同字母表示不同樣本同一指標差異顯著(P<0.05)。圖3 ARs對脂肪細胞糖吸收關(guān)鍵蛋白Akt及GLTU4表達水平的影響Fig.3 Effect of ARs on expression level of glucose uptake related protein Akt and GLUT 4 from adipocytes under inflammatory stress
進一步解析ARs在改善炎癥引發(fā)的脂肪細胞胰島素抵抗中的保護作用機制,采用Western Blot對胰島素調(diào)控糖吸收相關(guān)通路蛋白進行定量分析,實驗結(jié)果見圖3。由圖3可知,當炎癥培養(yǎng)基誘導(dǎo)脂肪細胞胰島素抵抗后,細胞內(nèi)GLUT4和p-Akt蛋白表達水平與NC組相比顯著降低了39.7%和46.1% (P<0.05)。GLUT4和p-Akt是胰島素信號通路調(diào)節(jié)糖吸收的主要蛋白[26-28],其中p-Akt調(diào)控GLUT4向細胞膜轉(zhuǎn)移并提高葡萄糖吸收利用[26];同時,PI3K/Akt是多種活性物質(zhì)改善胰島素抵抗作用和提高糖吸收的重要信號通路[25]。有報道證實,富含酚類物質(zhì)的小麥粉可以通過p-Akt途徑顯著改善肥胖大鼠的胰島素抵抗[29];同樣,本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過20 μmol/L的ARs處理后的脂肪細胞內(nèi)GLUT4和p-Akt蛋白表達水平與CM組相比顯著提高了35.9%和42.6%(P<0.05)。本研究結(jié)果顯示,ARs可能是通過激活p-Akt/GLUT4 信號通路而提高糖吸收水平,改善胰島素抵抗的。
蛋白條帶圖和油紅O染色圖中的A、B、C、D、E、F分別為NC、CM、AH、NC+LY294002、CM+LY294002、AH+LY294002組。不同字母表示不同樣本同一指標差異顯著(P<0.05)。圖4 LY294002抑制ARs保護脂肪細胞糖脂代謝作用分析Fig.4 Analysis of LY294002 inhibition on protective effects of ARs on glucose and lipid metabolism
為了探討ARs對于脂肪細胞胰島素抵抗保護作用是否特異性激活A(yù)kt信號通路,本研究采用LY294002作為PI3K抑制劑,通過抑制PI3K活性以降低p-Akt的蛋白表達水平來進行驗證,實驗結(jié)果見圖4。由圖4(a)至圖(c)可知,采用PI3K抑制劑(LY294002)預(yù)處理脂肪細胞后,細胞內(nèi)p-Akt的表達水平及其下游GLUT4蛋白表達受到顯著抑制。ARs對于細胞p-Akt及GLUT4的表達提高被顯著逆轉(zhuǎn);同時,有研究表明,p-Akt表達受到抑制后,胰島素改善的脂解作用也被削弱[30]。本研究對LY294002干預(yù)后的脂肪細胞脂質(zhì)積累進行分析,探討ARs激活的p-Akt/GLUT4通路是否參與到ARs對脂肪細胞脂質(zhì)積累紊亂的保護作用。
圖4(d)結(jié)果顯示,LY294002干擾下AH組脂肪細胞中的脂質(zhì)積累低于AH組。研究結(jié)果說明,隨著p-Akt/GLUT4通路表達的降低,ARs改善的脂肪細胞脂質(zhì)積累保護效果受到限制。抑制劑對于脂肪細胞葡萄糖吸收的影響結(jié)果表明,ARs提高3T3-L1脂肪細胞的2-NBDG攝取水平也受到LY294002的顯著抑制[圖4(e),P<0.05]。本研究發(fā)現(xiàn),ARs除了通過抑制脂肪細胞脂解改善糖吸收能力,還能夠通過激活p-Akt/GLUT4介導(dǎo)的糖吸收抑制脂解。谷物中的多種植物化學(xué)素已被證實可以通過激活PI3K/Akt/GLUT4信號通路提高糖吸收水平,改善胰島素抵抗[31-34]。Oishi等[18]發(fā)現(xiàn),ARs可以提高肝臟中的p-Akt表達,這可能與ARs維持血糖平衡相關(guān)。ARs還被證實可以激活PI3K/Akt,發(fā)揮細胞保護活性[14]。本研究表明,ARs能夠通過特異性激活PI3K/Akt發(fā)揮生物活性。
不同字母表示不同樣本同一指標差異顯著(P<0.05)。圖5 ARs單體同系物對于炎癥誘導(dǎo)的脂肪細胞糖吸收水平改善作用分析Fig.5 Analysis of protective effect of ARs monomers on glucose uptake from adipocytes under inflammatory stress
進一步研究了小麥ARs的5種主要單體成分對于脂肪細胞胰島素抵抗改善作用,實驗結(jié)果見圖5。由圖5可知,在同等濃度下,與其余單體相比,十七烷基間苯二酚(AR-C17)能夠改善脂肪細胞胰島素抵抗,增加細胞對于葡萄糖吸收的效果最強,說明AR-C17為小麥ARs 主要活性物質(zhì),該結(jié)論與前人和本課題組先前研究結(jié)果一致。本研究團隊通過建立LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型,比較了5種單體抗炎效果,發(fā)現(xiàn)AR-C17具有最佳抗炎能力[15],其原因可能是,相比于其余同系物,AR-C17的烷基鏈長度最短,使得其具有更高的溶解性[35];同樣,F(xiàn)an等[36]也發(fā)現(xiàn),AR-C17是小麥ARs神經(jīng)保護作用中的主要活性物質(zhì)。
本研究發(fā)現(xiàn),濃度為5、10、20 μmol/L的小麥ARs可以有效改善炎癥導(dǎo)致的脂肪細胞胰島素抵抗,2-NBDG吸收率隨ARs濃度增加而提高,證明小麥ARs具有一定的肥胖相關(guān)胰島素抵抗改善作用,且AR-C17能夠比其余4種同系物單體更有效地改善胰島素抵抗性。脂肪細胞脂解分析結(jié)果表明,ARs能夠顯著改善炎癥導(dǎo)致的脂肪細胞脂質(zhì)分解;蛋白表達量結(jié)果表明,小麥ARs提高了p-Akt和GLUT4的蛋白表達水平,但是LY294002干擾ARs對脂肪細胞胰島素抵抗性的改善作用。本研究表明,小麥ARs通過激活p-Akt/GLUT4信號通路,可以改善炎癥導(dǎo)致的脂肪細胞脂質(zhì)積累紊亂和胰島素抵抗。希望本研究結(jié)果能夠為全谷物食品健康功效的進一步研究提供理論參考。