馮云子，周 婷，吳偉宇，蔡 宇，趙謀明

(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641)

醬油是一種傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)味品，其起源可追溯到我國周朝時期，距今已有2 000多年的歷史，是我國及東南亞各國飲食文化的重要代表[1]。近年來，歐美等國家的醬油消費量也逐年增加，醬油已成為世界性的大宗調(diào)味品，年產(chǎn)量約為1 000多萬t。醬油主要以大豆、豆粕等植物蛋白為原料，輔以面粉或小麥粉等淀粉質(zhì)原料，在一定鹽濃度條件下，利用微生物(如霉菌、酵母菌、細菌、乳酸菌等)的發(fā)酵作用，水解原料生成多種氨基酸、肽、有機酸、糖醇和糖類物質(zhì)，并以此為基礎，經(jīng)過復雜的生物化學變化，形成具有特殊色澤、香氣、滋味和狀態(tài)的調(diào)味液[1-2]。

作為調(diào)味品，醬油的風味是其品質(zhì)組成的重要指標，更是影響消費者嗜好性選擇的關鍵因素。醬油中香氣物質(zhì)的貢獻可分為以下幾個維度，如酸香、醇香、麥芽香、花果香、焦糖香、煙熏香、烘烤香和蔬菜類香(或烤土豆香)等，不同香型的化合物以一定比例組合形成了醬油濃郁的醬香和酯香[2-3]。在滋味上，醬油具有酸、甜、苦、咸、鮮和濃厚味的綜合味感，其中咸、鮮味較為突出[4]。醬油的風味復雜而平衡，其中揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分是構成醬油獨特風味的物質(zhì)基礎，如何全面地解析這些成分和確定關鍵風味化合物并對其進行有效的調(diào)控一直是調(diào)味品行業(yè)的研究熱點。而在“健康中國2030”規(guī)劃綱要的引領下，人們對食品的營養(yǎng)與健康也提出了更高的要求。有研究表明，除具有獨特的風味外，醬油還富含功能活性物質(zhì)，具有一定的生理功能，如抗氧化[5-6]、抗癌[7-8]、降血壓[9]和提高免疫力[10]等。

本文依據(jù)風味和生理功能屬性，分別總結了醬油中檢出的香氣、滋味以及功能性化合物，并系統(tǒng)闡述了風味研究方法的進展，探討了研究中存在的問題，并對今后的研究方向提出建議。

1 醬油的風味物質(zhì)研究進展

早期醬油風味研究多以傳統(tǒng)感官描述結合基礎理化指標為主，但隨著精密儀器和相關檢測技術的發(fā)展，分析風味物質(zhì)的能力得到了顯著提升，進一步帶動了風味研究的數(shù)據(jù)信息化，包括定量感官分析、氣(液)相及質(zhì)譜技術的應用等；近年來，精密儀器與感官分析的有機結合，更是推動了關鍵風味活性化合物的鑒定，其中代表性的研究體系是分子感官組學，包括GC-O/MS、重組缺失實驗等技術，幫助科研工作者從龐大的數(shù)據(jù)系統(tǒng)中關注到具有代表性的風味化合物，明確風味調(diào)控的核心目標。

1.1 醬油香氣的分析方法研究

香氣物質(zhì)的分析主要分為感官分析和揮發(fā)性物質(zhì)分析兩個部分，揮發(fā)性化合物的分析則包括了提取、分離、鑒定、定量以及關鍵香氣物質(zhì)的分析，見圖1。

圖1 醬油風味物質(zhì)的檢測技術Fig.1 Detection technology of flavor substances in soy sauce

根據(jù)GB 2717—2018《食品安全國家標準 醬油》的規(guī)定，優(yōu)質(zhì)醬油的香氣描述為濃郁的醬香及酯香。因此，早期的感官評估多以醬香、酯香強度來進行評價?，F(xiàn)階段定量描述分析(quantitative descriptive analysis，QDA)技術[11-12]在研究中使用更為廣泛，醬油常用的香氣標度為酸香、醇香、麥芽香、花香、果香、焦糖香、煙熏香、烘烤香和烤土豆香等[2-3,12]。QDA方法執(zhí)行期間，需要感官人員提前熟悉每個香氣特征對應標準品的香氣，如4-乙基愈創(chuàng)木酚(煙熏香)、4-羥基-2-乙基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮或4-羥基-2-甲基-5-乙基-3(2H)-呋喃酮(HEMF，焦糖香)，然后對樣品的特征香氣強度進行評估。QDA適用于樣品間差異細節(jié)的挖掘，以及感官與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)數(shù)據(jù)的結合分析，但該方法對感官人員要求相對較高，需要經(jīng)過一定時長的訓練。

揮發(fā)性化合物的提取是香氣檢測的重要前提，醬油香氣的提取方法主要包括液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)、同時蒸餾萃取(simultaneous distillation and extraction，SDE)、固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)、溶劑輔助蒸餾萃取(solvent assisted flavor evaporation，SAFE)和大孔樹脂吸附等[2-3,13-14]。本研究團隊對比了LLE、SDE、SPME 3種方法對醬油香氣分析的影響[2]，發(fā)現(xiàn)LLE適用于半揮發(fā)性化合物的分析，特別是對呋喃酮和酸類物質(zhì)萃取效率較高；SDE分析結果中醛類物質(zhì)含量較高，其提取過程需要保持樣品沸騰，高溫促使了醬油中的氨基酸、肽與糖類物質(zhì)的熱反應，生成大量的Strecker醛類化合物等[15]，導致分析結果與醬油真實的揮發(fā)性物質(zhì)組成差異較大，因此SDE并不適合于醬油這一類具有較高氨基酸和糖類物質(zhì)的食品。無溶劑萃取技術SPME近年來使用越來越廣泛[12,16]。該方法無需有機溶劑，上樣操作簡單，能有效地萃取揮發(fā)性化合物。但有兩點局限，一是由于目標化合物在樣品、頂空和萃取頭中處于三相平衡狀態(tài)，其絕對定量的準確度容易受到競爭性吸附及基質(zhì)效應影響；二是SPME法不適于低揮發(fā)性化合物的分析，比如醬油中的3-羥基-4,5-二甲基-2(5H)-呋喃酮(sotolone)等；為了改善SPME的局限性，新開發(fā)的SPME-Arrow萃取技術[17]，可有效改善萃取頭對低揮發(fā)性化合物的提取效率，值得在醬油中進行應用嘗試。此外，SAFE[3]采用高真空、液氮冷凝，可以避免SDE的熱效應，較好地還原樣品的實際香氣特征，同時避免一些難揮發(fā)性成分進入GC-MS影響分離效果。然而，SAFE提取過程涉及液氮和真空裝置，實驗成本高、設備操作相對煩瑣，對于醬油樣品來說，因其體系以水為主，難揮發(fā)性雜質(zhì)如油脂等含量相對較低，常規(guī)LLE法也可基本滿足分析測定。整體而言，不同的方法提取效果和針對的物質(zhì)各有差異，實驗過程應根據(jù)分析的目標不同擇優(yōu)選用方法，采用不同方法結合來全面分析醬油的香氣化合物也是一個較為實用的策略，如采用SPME法和LLE法結合等。

揮發(fā)性化合物分離和鑒定技術中，最常用的是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(GC-MS)。在分離上，近年來多維氣相色譜(GC×GC)的應用使得檢出化合物的數(shù)量大大提高，如醬油中可分離的揮發(fā)性化合物從百來種增加到400余種[18]。而在定性技術上，可以分為氣相色譜檢測器(氫火焰離子檢測器FID、氮磷檢測器NPD、火焰光度檢測器FPD、硫化學發(fā)光檢測器SCD)，離子遷移譜，及質(zhì)譜等，其中質(zhì)譜根據(jù)質(zhì)量分析器類型的不同，又可分為低分辨質(zhì)譜(單四極桿、三重四極桿、離子阱)和高分辨質(zhì)譜(如靜電場軌道阱質(zhì)譜Orbitrap-MS、飛行時間質(zhì)譜TOF-MS)。風味定性一般需要考慮質(zhì)譜庫匹配程度、保留指數(shù)(RI)和標準品，通過GC-O嗅聞技術的研究一般還需要核對物質(zhì)的香氣特征。關于醬油風味物質(zhì)的系統(tǒng)研究，最早的SCI發(fā)表于1961年，日本Yokotsuka[19]對日式醬油風味物質(zhì)進行研究，認為愈創(chuàng)木酚化合物是烹調(diào)醬油的特色風味成分。到了80年代，Nunomura等[20-22]利用GC-MS技術從日本醬油酸、中、堿性組分中分離鑒定出93、142及35種揮發(fā)性化合物。隨后的40年間，醬油的風味研究得到了迅速的發(fā)展，特別是中國研究技術手段的升級帶來了傳統(tǒng)發(fā)酵行業(yè)的理論研究的熱潮。筆者曾對已報道文獻進行統(tǒng)計，有近1 038種化合物在醬油中檢出。結合氣相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法(gas chromatography-orbitrap/mass spectrometry)，更是有助于GC-MS/O中未知香氣活性化合物的分析，如貢獻甜香的大馬酮[23]。

氣相色譜-質(zhì)譜/嗅聞儀聯(lián)用技術(GC-MS/olfactory,GC-MS/O)的發(fā)展使得關鍵香氣活性化合物的檢測成為可能。該技術將GC流出物分成兩部分，一半進入質(zhì)譜檢測器分析結構，另一半進入嗅聞口，以感官人員的鼻子作為檢測器，感官人員描述嗅聞到的化合物的香氣強度和特點[23]。GC-MS/O方法包括香氣提取稀釋分析(aroma extraction distillation analysis,AEDA)、頻次檢測法和直接強度法，其中AEDA應用最為常見[24-25]。從2004年開始，至今為止共有近9個團隊對中國、日本、韓國、泰國各種代表性工藝的醬油產(chǎn)品進行了深入分析，分別檢出了11～94種香氣活性化合物[3,13,15,18,25-33]。

1.2 揮發(fā)性物質(zhì)和香氣活性化合物研究

醬油中揮發(fā)性化合物的種類和數(shù)量繁多，已檢出的1 038種揮發(fā)性化合物[2]主要可分為酸類、醇類、醛類、酮類、酚類、酯類、吡嗪類、呋喃(酮)類、吡喃(酮)類、吡咯類、吡啶類、含硫化合物及含氮化合物等13大類，其具體的數(shù)量分布見圖2。由圖2可知，酯類和醇類是檢出數(shù)量較多的類別。

圖2 醬油中不同種類的揮發(fā)性化合物的數(shù)量Fig.2 Number of different kinds of volatile compounds in soy sauce

從2004年開始，韓國的Beak等[26]首次采用固相微萃取-氣相色譜-嗅聞聯(lián)用(SPME-GC-O)對醬油中關鍵香氣活性化合物進行了分析，描述了11種化合物的香氣特征。迄今為止，研究者們[3,13,15,18,25-33]采用GC-MS/O技術共在醬油中鑒定出了202種香氣活性化合物，根據(jù)其檢出頻次(≥1次和≥5次)的不同，分別做了統(tǒng)計總結，見圖3。由圖3可知，醇類、醛類、酯類、呋喃(酮)類、酮類是檢出關鍵香氣活性化合物較多(≥25個)的化合物類別。但202個化合物中沒有一種物質(zhì)可以完全被描述為“醬油香”或“醬香”，可見醬油的香氣是由多種物質(zhì)按一定比例組成的復雜香氣組合。

圖3 醬油中不同種類香氣活性化合物的數(shù)量Fig.3 Number of different kinds of aroma-active compounds in soy sauce

表1及圖4重點列舉了醬油中高頻檢出(≥5次)的31種香氣活性化合物及其香氣描述詞、強度和檢出頻次。根據(jù)香氣描述詞大致可歸納為酸醇香、麥芽香、花香、果香、焦糖香、煙熏香、烘烤香和蔬菜類香8種香型。

圖4 醬油中的關鍵風味化合物Fig.4 Key flavor compounds in soy sauce

表1 醬油中檢出頻次大于等于5的香氣活性化合物Tab.1 Aroma-active compounds with detection frequency greater than or equal to 5 times in soy sauce

1.2.1酸香和醇香物質(zhì)

醬油中的酸香主要由低分子量的揮發(fā)性酸構成，如乙酸、2-甲基丁酸和3-甲基丁酸。酸類物質(zhì)能使發(fā)酵環(huán)境的pH值下降，為酵母的生長和發(fā)育提供酸性環(huán)境，同時，可與醇類發(fā)生酯化反應形成酯類化合物，對香氣和口感起著重要作用。醬油中乙酸含量較高，一般可達到1～10 mg/L，但其閾值相對較高(22 mg/L)[2-3]；相比之下，2/3-甲基丁酸的含量需要在發(fā)酵過程中有所控制，過高會產(chǎn)生“汗味”“臭襪子味”等異味，影響醬油品質(zhì)。

乙醇是醬油醇類中含量最高的揮發(fā)性化合物，一般含量為3 000～10 000 mg/L[1,3]。日式醬油的醇香顯著強于中式醬油，這與其發(fā)酵工藝中酵母的代謝密切相關，部分產(chǎn)品還有添加乙醇，以提高醬油的防腐性能[1]。

1.2.2麥芽香物質(zhì)

2/3-甲基-1-丁醇、2-甲基丙醛和2/3-甲基丁醛是醬油“麥芽香”的重要來源，該類物質(zhì)與氨基酸的代謝關系密切，如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，這一類氨基酸前體的廣泛存在，使得它們在多種食品中都具有香氣活性，如大豆醬[34]、黑巧克力等。

1.2.3花香和果香物質(zhì)

在花香特征上，苯乙醇和苯乙醛是主要的貢獻者，具有“花香”“甜香”和“蜂蜜香”，與苯丙氨酸的代謝相關，兩者在醬油中平均香氣強度達到3.6，檢出頻次超過80%，是醬油中重要的香氣物質(zhì)，也在很多食品(如奶酪、面包和紅酒)中被鑒定為關鍵香氣活性化合物[35]，同時也是花朵芬芳的重要來源。

醬油中果香與乙酯類化合物密切相關，主要包括乳酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸乙酯和異丁酸乙酯，特別是異丁酸乙酯，具有特征的蘋果香味，帶給醬油濃郁而柔和的特征[1]，但在低分辨MS的鑒定中異丁酸乙酯容易被前一個物質(zhì)覆蓋，利用高分辨質(zhì)譜結合解卷積可以有效鑒定該物質(zhì)[23]。在日式醬油中乙酯類化合物的含量相對中式醬油更高[31]，約為中式醬油的4～5倍，使得日式醬油具有較為濃郁的果香，這與酵母的代謝活動有關。

1.2.4焦糖香物質(zhì)

由表1可知，焦糖香化合物平均香氣強度為3.4分，平均檢出頻次達到64%，是醬油重要的香氣特征之一，其物質(zhì)基礎是HEMF、HDMF、麥芽酚和sotolone等，這些化合物的分子結構特征均是環(huán)酮分子中含有烯醇化的結構單元[2]。焦糖香氣物質(zhì)中，檢出頻次最高的物質(zhì)為HEMF，俗稱醬油酮，在GC-MS檢測時，這個物質(zhì)一般能檢出2個同分異構體，包括4-羥基-2-乙基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮和4-羥基-5-乙基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮，典型離子碎片為142 m/z。本研究團隊曾調(diào)查了27種商業(yè)醬油的香氣活性化合物，HEMF在醬油的所有香氣活性化合物中，平均OAV值排第二，最高可達到2 163[36]。此外，sotolone的檢出頻次為焦糖香化合物中最低，但其平均香氣強度排名第一，這可能與其揮發(fā)特性及檢測方法的選用有關，該物質(zhì)除貢獻焦糖香外，還常被描述為調(diào)味品香[2-3]。

1.2.5煙熏香物質(zhì)

煙熏香化合物檢出頻次達到71%，2,6-二甲氧基苯酚、愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-EG)和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚這4種甲氧基酚類化合物是最主要的貢獻者，常被描述為“煙熏”“焦香”及“培根”等[3,12]。該類化合物檢出最多的4-乙基愈創(chuàng)木酚具有強烈的煙熏香和培根香，是日韓醬油香氣的重要貢獻化合物。

1.2.6烘烤香物質(zhì)

貢獻烘烤香的物質(zhì)主要是吡嗪類化合物，常檢出的有2,6-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪，吡嗪類化合物是含有1,4-二氮雜苯母環(huán)的一類化合物的總稱，經(jīng)常在堅果、芝麻和花生等焙烤食品中發(fā)現(xiàn)，貢獻著烘烤香和堅果香[2-3]。該類物質(zhì)在醬油中具有中等香氣強度(2.7分)，檢出頻次較低。這與醬油中常檢出的幾類吡嗪類化合物閾值較高是有關系的，前期對商業(yè)醬油的研究中發(fā)現(xiàn)其OAV值都小于1[36]。

1.2.7蔬菜香物質(zhì)

蔬菜香型包括“蘑菇香”“煮熟的洋蔥味”和“烤土豆味”等，具有較高的香氣強度(3.1分)，且檢出頻次達到68%。1-辛烯-3-醇具有類似蘑菇的香氣，也被稱之為蘑菇醇。二甲基三硫除了貢獻“煮熟的洋蔥味”，還貢獻“硫黃味”?！翱就炼刮丁庇袃蓚€典型的化合物，即3-甲硫基丙醛和3-甲硫基丙醇，而3-甲硫基丙醛是醬油[3]和豆醬[34]等發(fā)酵豆制品中常見的香氣活性化合物。二甲基三硫、3-甲硫基丙醛和3-甲硫基丙醇是醬油中最常檢出的含硫化合物，雖然含量不高，但具有較低的閾值[2]，故具有較強的香氣貢獻。

2 醬油的滋味物質(zhì)研究進展

2.1 醬油滋味的分析方法研究

醬油的滋味具有五味調(diào)和、咸鮮突出的特點，其基本研究思路與香氣類似，也包括感官和非揮發(fā)性物質(zhì)分析兩個部分(圖1)。感官分析一般采用人來評價醬油的滋味特點，但其鹽濃度常高達16%～18%，感官分析難度較高。近年來，電子舌技術也被引入到醬油滋味的研究中，通過馴化建立模型，可以用來輔助醬油調(diào)配工作[37]。同時，隨著分離和檢測技術的發(fā)展，非揮發(fā)性物質(zhì)的鑒定種類也與日俱增，關注對象從乳酸、谷氨酸等，逐漸擴展到了糖類、氨基酸、肽和美拉德反應產(chǎn)物等，代謝組學思想的引入更是為傳統(tǒng)發(fā)酵行業(yè)的科學發(fā)展注入了新力量。

采用HPLC和氨基酸分析儀，一般能從醬油中檢測到15～18種氨基酸[4,38-39]和7～10種糖類物質(zhì)。隨后，核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)、LC-MS、UPLC-MS/MS、GC-MS衍生化等組學技術的發(fā)展和應用，進一步揭秘了醬油的物質(zhì)基礎。筆者和團隊成員曾優(yōu)化并采用以上幾種技術研究醬油的小分子代謝物質(zhì)，并結合文獻報道，總結發(fā)現(xiàn)，NMR和GC-MS衍生化適合于初級代謝產(chǎn)物(糖、糖醇、有機酸等)的檢測，而LC-MS和UPLC-MS/MS相對更適合次級代謝產(chǎn)物和肽類物質(zhì)的分析，也包括一系列氨基酸和肽的衍生物。Kamal等[40]和林涵玉[41]采用 NMR 技術分別從醬油中檢測到 18、24種非揮發(fā)性化合物，而GC-MS結合衍生化法[42-43]，可鑒定出50～100種化合物，包括糖、氨基酸、糖醇、有機酸、核苷酸等；UPLC-MS/MS技術的應用，將物質(zhì)鑒定數(shù)量更是提高到了155～427種[44-46]。

關鍵滋味化合物的分析也隨著分子感官科學的不斷革新有了新的進展，主要包括以下幾方面的技術。QDA表征醬油酸甜苦咸鮮以及濃厚六個維度的滋味強度，為分析滋味物質(zhì)基礎打下了良好的基礎。此外，滋味稀釋分析(TDA)[47]是一種基于凝膠色譜、HPLC分離，并通過感官分析連續(xù)稀釋級分，以在食品復雜的混合物中鑒定出最強烈的滋味化合物的技術，它的應用是食品關鍵滋味活性化合物分析的里程碑[48]。本團隊采用該方法從醬油中鑒定得到了15條鮮味肽[49-50]，然而該類方法工作量大，研究周期相對較長。此外，重組、缺失實驗也被應用到紅酒[51]和綠茶[52]上，用于鑒定其關鍵滋味化合物，而醬油中非揮發(fā)性化合物的種類和數(shù)量眾多，如何將這一些技術更好地應用于醬油值得關注。

2.2 非揮發(fā)性化合物和滋味化合物研究

對已發(fā)表的文獻總結發(fā)現(xiàn)，在醬油中共檢測到230種非揮發(fā)性化合物，包括90種肽、49種有機酸、27種氨基酸及其衍生物、28種糖、11種糖醇、6種生物胺、4種核苷酸和16種其他類化合物，結果見圖5，這些物質(zhì)分別構成了醬油的酸、甜、苦、咸、鮮和濃厚味。

圖5 醬油中不同種類非揮發(fā)性化合物的數(shù)量Fig.5 Number of different types of non-volatile compounds in soy sauce

2.2.1酸味物質(zhì)

醬油的酸味主要貢獻者是種類繁多的有機酸，包括揮發(fā)性和非揮發(fā)性的。非揮發(fā)性有機酸主要有乳酸、琥珀酸、酒石酸和檸檬酸等[41]。有機酸可以調(diào)和醬油的風味，如乳酸可以賦予醬油圓潤綿長的口感，在醬油風味中能夠緩解咸味[1]，而Kong等[53]發(fā)現(xiàn)，乳酸和焦谷氨酸能夠平衡中式醬油的滋味。

2.2.2甜味物質(zhì)

醬油甜味的主要來源是糖類物質(zhì)，如葡萄糖、半乳糖和果糖等單糖[54]，他們來自原料營養(yǎng)物質(zhì)的水解，此外，也有在調(diào)配過程中加入的蔗糖。早期采用HPLC等分離鑒定醬油中的糖類，而GC-MS衍生化法的應用，可從醬油中鑒定出14～23種糖和糖醇類化合物[41,55]，糖醇類化合物的滋味貢獻早期報道較少，如赤蘚糖醇、半乳糖醇、木糖醇和核糖醇等，值得進一步探討。

除糖與糖醇類以外，還有一類弱疏水性的氨基酸化合物為醬油貢獻甜味，如丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等，其中丙氨酸具有較強的甜味，在中式和日式醬油中其濃度分別為丙氨酸呈味閾值(60 mg/100 mL)的2.9倍和6.2倍[4]。

2.2.3苦味物質(zhì)

氨基酸的滋味與其側(cè)鏈密切相關，當氨基酸具有強疏水性時，大多數(shù)具有苦味，如組氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。除此之外，還有多酚和部分的肽呈苦味，如崔春等[56]在2019年報道的醬油中16條小肽(分子質(zhì)量<1 000 Da，富含疏水性氨基酸)。本研究團隊認為這些苦味物質(zhì)及其衍生物在適宜的濃度范圍內(nèi)，可能對醬油的濃厚味感具有積極的影響。

2.2.4咸味物質(zhì)

高濃度的NaCl(12%～18%)是醬油咸味特征的來源，是醬油中除水以外含量最高的化合物。在發(fā)酵過程中，高濃度的鹽能夠抑制有害微生物的生長，從而保證了醬油的風味和品質(zhì)。近年來，減鹽醬油的開發(fā)也成為熱潮，如何在發(fā)酵過程采用控溫、微生物添加等技術來保證減鹽醬油的風味品質(zhì)和安全生產(chǎn)是近年來的研究熱點。

2.2.5鮮味物質(zhì)

醬油鮮味是其最重要的滋味特征，鮮味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸一直是關注的重點，主要來源于蛋白質(zhì)的分解，也有部分來源于調(diào)配階段所加入的鮮味劑——谷氨酸鈉。這也是醬油品質(zhì)指標氨基酸態(tài)氮所反映的內(nèi)涵之一。此外，部分有機酸也具有增鮮作用，如琥珀酸[1]。

然而，以上單體物質(zhì)的重組體系與醬油的鮮味輪廓仍有一定差距，隨著分離和鑒定技術的發(fā)展，研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)，食品中肽組分具有呈鮮或增強鮮味感知的能力。據(jù)Tamura等[57]發(fā)表于1989年的一份研究報告，從牛肉湯中分離鑒定得到一條呈鮮味的八肽Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala，在pH值6.5時其鮮味強度與谷氨酸鈉相當，然而后期Van Wassenaar等[58]和Hau[59]報道的結果與之有所矛盾。這些報道拉開了呈味肽研究的序幕，2004年，Lioe等[38]研究了醬油中的呈味肽段，發(fā)現(xiàn)<500 Da的醬油組分鮮味最強。代謝組學技術的發(fā)展解決了肽段結構的解析難題，Yamamoto等[43]通過數(shù)學模型分析了醬油中237個二肽與滋味之間的相關性，得到5條與鮮味高度相關的二肽。本團隊也采用不同的分離技術從醬油中分離出了鮮味肽，并分別鑒定了5條和10條鮮味肽結構[49-50]。

醬油的鮮味研究并不止步于此，還有更多的鮮味及鮮味增強物質(zhì)在不斷地被發(fā)現(xiàn)。2014年，Shiga等[45]在醬油中發(fā)現(xiàn)了一種美拉德反應產(chǎn)物N-(1-deoxyfructos-1-yl)glutamic acid(Fru-Glu)，其鮮味強度高于對應濃度的谷氨酸。此外，F(xiàn)ru-pGlu、Fru-Val、pGlu-Gln、pGlu-Val、Lac-Glu、Lac-Leu等一系列氨基酸衍生物的新發(fā)現(xiàn)為醬油研究打開了新方向，部分物質(zhì)已經(jīng)被驗證具有鮮味增強作用[44,60-61]。由此可見，醬油鮮味的秘密還未完全解開，仍值得深入探索。

2.2.6濃厚味物質(zhì)

酸甜苦咸鮮五種基本滋味無法全面概括醬油的滋味特征。Ueda等[62]在1990提出了一種新的滋味屬性 “kokumi”(濃厚味)，是一種綿延感、飽滿感和厚重感的綜合味感，他們的研究表明：大蒜水提取物中的含硫化合物，特別是谷胱甘肽(γ-Glu-Cys-Gly)能夠增強 kokumi 味。2013年，Kuroda等[46]首次證實醬油中存在γ-Glu-Val-Gly，說明醬油的kokumi味可能與其肽及相關衍生物關系密切。

2.3 香氣與滋味的交互作用研究

風味物質(zhì)的組成及其之間的相互作用共同決定了醬油的風味效果。近些年來，研究人員關注到醬油的香氣對滋味感知也有影響。Onuma等[63]和Chokumnoyporn等[64]研究發(fā)現(xiàn)將醬油香氣添加到NaCl溶液和食品體系中可以增強其咸味感知。為了進一步探明互作的物質(zhì)基礎，本團隊采用氣相色譜-嗅聞/與滋味相關(GC-O/AT)技術明確了醬油中與咸/鮮味相關的香氣化合物，發(fā)現(xiàn)香氣與滋味特征存在一致性，并且3-甲硫基丙醛具有最強的增咸和增鮮作用[33]。醬油的滋味與滋味之間也存在交互作用。Imamura等[65]研究發(fā)現(xiàn)醬油中一種多糖能夠抑制鮮味回味，Kim等[66]在韓國醬油中分離得到的F05鮮味活性組分，能夠掩蔽部分苦味。未來，食品的風味交互作用仍有大量的空白區(qū)域值得深入探索。

3 醬油的生理活性物質(zhì)及功能特性

醬油中富含諸如類黑精、呋喃類化合物、異黃酮類化合物、大豆多肽等生理活性物質(zhì)，使得醬油在起到調(diào)味作用的同時也具有較好的功能特性，如抗氧化、抗癌、降血壓、降尿酸、抗過敏、抗血小板產(chǎn)生、抗白內(nèi)障等，其中前3種活性物質(zhì)的功能研究較為深入，甚至在臨床中已有應用?，F(xiàn)將研究中發(fā)現(xiàn)的醬油生理活性物質(zhì)及功能特性歸納于表2。

表2 醬油生理活性物質(zhì)及功能研究總結Tab.2 Summary of researches on physiological active substances and their functions in soy sauce

3.1 抗氧化方面的作用

通過體內(nèi)與體外實驗驗證，醬油是一種極為有效的抗氧化劑[6,80]，新加坡國立大學的研究人員發(fā)現(xiàn)醬油相對于咖喱醬、料酒等多種亞洲調(diào)味料，其抗氧化活性具有明顯優(yōu)勢，特別是老抽，約為紅酒抗氧化活力的10倍左右。這與Li等[5]的研究結果相符，通過對41種市售醬油的基本成分和抗氧化活性分析，也發(fā)現(xiàn)老抽具有最高的抗氧化活性，PLS回歸分析表明醬油的抗氧化活性與褐變指數(shù)密切相關；Wang等[67]發(fā)現(xiàn)麥芽酚和類黑精等含碳水化合物的色素是醬油具有高抗氧化能力的主要原因。

此外，大豆異黃酮的抗氧化活性也常常被關注，其可作用于氧自由基和脂過氧化物以預防動脈粥樣硬化等疾病[81]。Kinoshita等[71]利用HPLC從發(fā)酵醬油中分離得到了3種異黃酮衍生物，鑒定為大豆素、染料木素與8-羥基染料木素的衍生物；本團隊采用UPLC-MS/MS揭示了15種大豆異黃酮在醬油制曲和醬醪發(fā)酵全過程的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵的進行，大豆異黃酮從苷類異黃酮逐漸轉(zhuǎn)化為高活性的苷元類黃酮以及羥基異黃酮，且在發(fā)酵過程中，羥基大豆苷元的抗氧化活力貢獻約為大豆苷元的100～500倍，屬于“少量關鍵”的功能性物質(zhì)。Kataoka等[68]的實驗表明HEMF、HDMF、HMF這類呋喃酮類化合物具有抗氧化作用，且發(fā)現(xiàn)HEMF、HDMF比抗壞血酸的抗氧化效果更好，其活性分別為抗壞血酸的1.52倍和1.28倍；Chen等[69]通過分離純化大豆蛋白水解物和硫氰酸鐵法將多肽Leu-Leu-Pro-His-His判定為抗氧化肽；Yang等[70]發(fā)現(xiàn)醬糟蛋白水解物的抗氧化活性較佳，可能與其抗氧化氨基酸Try、Met、His、Lys和Trp含量較高有關。

3.2 抗癌方面的作用

醬油中活性成分的抗癌作用與抗氧化作用具有相關性[82]，如異黃酮和呋喃酮等。大豆苷被發(fā)現(xiàn)對ZR-75-1乳癌具有抗增殖的作用，而染料木苷與哺乳動物腫瘤減少有著極大的相關性[83]；醬油中含有的呋喃酮類化合物也具有抗癌作用，Nagahara等[8]早在1991年便驗證了HEMF能抑制BP 誘導老鼠胃瘤形成，此后Kataoka等[68]在1997年證實了HMF和HDMF具有同樣的效果，其中HDMF是抗癌能力最強的成分。此外，威斯康星大學食品研究所發(fā)現(xiàn)醬油中含有的綴合亞油酸能有效地抑制皮膚癌和胃癌[84]；李瑩等[7]采用柱層析色譜分離技術從發(fā)酵醬油弱極性部分中分離鑒定出了4種具有醌還原酶(QR)誘導活性的化合物，進而誘導Ⅱ相酶從而實現(xiàn)對癌癥的預防作用[85]，主要包括兒茶酚、大豆苷元、flazin和perlolyrin。

3.3 降血壓方面的作用

對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的抑制效果為評估降血壓活性的常用指標。黃驪虹[72]研究表明大豆多肽可抑制ACE的作用；Hata等[86]和Kawasaki等[73]陸續(xù)發(fā)現(xiàn)無鹽醬油中部分肽段如Ile-Pro-Pro、Val-Pro-Pro和Val-Tyr對于輕度高血壓患者具有降壓作用。此外，Kinoshita等[9]在醬油中發(fā)現(xiàn)了具有ACE抑制活性的成分——煙酰胺。

3.4 降尿酸方面的作用

Li等[74]發(fā)現(xiàn)醬油(1.8 mL/kg)可以有效降低氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥大鼠血清中的尿酸水平，并認為降低血清尿酸水平的機制之一可能是抑制了血清黃嘌呤氧化酶(XOD)的活性。隨后其以XOD抑制活性為導向，通過硅膠柱層析、凝膠柱層析及半制備HPLC分離等一系列的方法從醬油中分離純化得到10種活性化合物，其中flazin的XOD抑制活性最強，且為首次報道，IC50值為0.51 mM，其次，鄰苯二酚、染料木素和3,4-二羥基肉桂酸乙酯均有較強的XOD抑制活性，作者還進一步揭示了這些關鍵活性化合物的作用機制和相互作用。

3.5 其他方面的作用

Kobayashi[10]發(fā)現(xiàn)醬油多糖具有抗過敏的作用；Sasaki等[75]發(fā)現(xiàn)HEMF、HDMF和HMF在具有抗氧化和抗癌作用的同時，還兼具抗白內(nèi)障的作用。除此之外，醬油中的活性成分還具有促進胃液分泌、抗貧血及降血脂的作用。

4 展 望

整體而言，關于醬油的風味物質(zhì)和功能活性已有大量研究報道，關鍵物質(zhì)的揭示將為其品質(zhì)調(diào)控提供明確的目標和方向，如何全面地解析這些成分、確定關鍵活性化合物，并對其進行有效的調(diào)控，一直是調(diào)味品行業(yè)的研究熱點。同時，未來仍有許多值得深入探索的地方，如醬油鮮味的秘密，如何進一步挖掘增鮮肽等鮮味物質(zhì)基礎并定向調(diào)控富集，風味的交互作用如何影響醬油的產(chǎn)品品質(zhì)，以及醬油風味功能菌的分離鑒定、交互研究和開發(fā)應用，都是醬油企業(yè)及傳統(tǒng)發(fā)酵行業(yè)需要繼續(xù)關注的研究方向。相信隨著檢測技術和分析方法的不斷發(fā)展，基于多組學技術聯(lián)合的釀造工藝升級和品質(zhì)定向調(diào)控將不斷突破，更有利于系統(tǒng)解密醬油釀造，進一步增強發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的調(diào)控效果。