許家偉
遼寧中醫(yī)藥大學(xué),遼寧 沈陽(yáng) 110847
全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1500萬(wàn)人,居各種死因首位。心腦血管疾病給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),氣虛血瘀證作為老年心血管疾病的多發(fā)證型,尤其不能被忽視[1]。“藥食同源”是古人在食物和藥物的發(fā)現(xiàn)中總結(jié)的智慧[2]。補(bǔ)氣活血方作為藥食同源類(lèi)藥方,是由諸多具有補(bǔ)氣、補(bǔ)血、活血化瘀等功效的藥物相互配伍組成的,用以補(bǔ)中益氣、活血生津、通經(jīng)活絡(luò),其藥效功能對(duì)氣虛血瘀證有著良好的作用[3-4]。本研究旨在研究自擬補(bǔ)氣活血方在不同劑量下對(duì)氣虛血瘀證大鼠的血液學(xué)評(píng)價(jià)。
1.2 材料、試劑及儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;RMPI-1640購(gòu)自Gbico公司;LipofectamineTM 2000 購(gòu)自Invitrogen公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo公司;抗LDH抗體購(gòu)自Abcam公司;抗GAPDH抗體購(gòu)自CST公司;GV219-PTEN(PTEN-OE)及對(duì)照質(zhì)粒(NC)由吉?jiǎng)P生物技術(shù)公司構(gòu)建;LDH、LD試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1-A及實(shí)驗(yàn)儀器由上海交通大學(xué)第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室提供。
SPF級(jí)SD大鼠180只,雌雄各半,體重180~220 g,由本溪長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供,合格證號(hào):SCXK(遼)2015-0001。于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房飼養(yǎng),動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(遼)2013-0009。
2014年5月,為認(rèn)真貫徹落實(shí)黨的十八大和十八屆三中全會(huì)精神,加強(qiáng)基層服務(wù)型黨組織建設(shè),中共中央辦公廳印發(fā)了《關(guān)于加強(qiáng)基層服務(wù)型黨組織建設(shè)的意見(jiàn)》,這是對(duì)基層黨組織功能定位的深化,是基層黨組織建設(shè)工作思路創(chuàng)新和方式方法轉(zhuǎn)型的必由之路,具有十分重要的意義〔1〕。
補(bǔ)氣活血方(人參10 g,甘草10 g,淮小麥20 g,大棗10 g,姜黃10 g,當(dāng)歸10 g,山藥15 g,炒山楂15g),補(bǔ)陽(yáng)還五湯(黃芪120 g,當(dāng)歸尾6 g,赤芍4.5 g,桃仁3 g,紅花3 g,川芎3 g,地龍3 g)。分別將補(bǔ)氣活血方與補(bǔ)陽(yáng)還五湯中各味藥混合后在水中浸泡1h,后加至10倍量水煎煮1 h,濾去煎煮液備用。再添入8倍量水,煎煮1 h后收集煎煮液,與第一次煎煮液合并濃縮[5],制備出高劑量補(bǔ)氣活血方1.25 g/ml與陽(yáng)性對(duì)照藥補(bǔ)陽(yáng)還五湯1.45 g/ml,高劑量稀釋后可得到0.625 g/ml、0.3125 g/ml中低劑量藥物。
采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料采用(±s)表示,各組間的比較采用單因素方差分析ANOVA的LSD-t檢驗(yàn)分析,P≤0.05則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
1.5.3 血液流變學(xué)測(cè)定
1.5.1 氣虛血瘀模型的制備及給藥
將雌雄各半的大鼠隨機(jī)分為6組,空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組。每組30只,除空白組外,均采用饑餓、勞累、寒冷相結(jié)合的方式復(fù)制氣虛血瘀模型。造模前,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。造模時(shí),除空白組正常飲食飲水外,其余各組每天限制以40 g/kg給予飼料[6],并將大鼠放入水溫14~16℃,水深(35±5)cm,直徑為50 cm的水桶中進(jìn)行游泳,以每組大鼠自然沉降沒(méi)入水中不能自主上浮為其疲憊標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)全組有50%出現(xiàn)自然沉降時(shí),全組停止游泳撈出,使之暴露于空氣中自然晾干[7],不予擦拭。給藥組每天按照10 ml/kg標(biāo)準(zhǔn)灌胃,空白組給予等量的生理鹽水,連續(xù)灌胃60天,取血前一天禁食24 h,不禁水。
在車(chē)牌定位時(shí),當(dāng)遇到整張圖片較為昏暗或者轉(zhuǎn)化為灰度圖像后區(qū)分度不高等情況時(shí),使用OTSU算法,就會(huì)出現(xiàn)二值化后車(chē)牌區(qū)域值為0,即為黑色,導(dǎo)致車(chē)牌定位失敗。此外,由于車(chē)牌定位主要基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)運(yùn)算,運(yùn)用腐蝕膨脹操作,如果圖片中也有二值化后白色像素點(diǎn)比較密集的地方,可能會(huì)被誤判為車(chē)牌區(qū)域。
全血黏度:60天模型組相對(duì)于空白組提升明顯,陽(yáng)性對(duì)照組與中高劑量組相對(duì)模型組下降明顯,低劑量組相對(duì)模型組有下降趨勢(shì)。血漿黏度:60天模型組相對(duì)空白組有明顯提升,高、中、低劑量組相對(duì)模型組明顯下降。見(jiàn)表1。
腹主動(dòng)脈采血于肝素鈉和檸檬酸鈉采血管內(nèi)。取60天大鼠心臟用10%氯化鉀溶液沖洗,使其充分舒張。切取心肌組織,用4%多聚甲醛溶液固定[8]。
半自動(dòng)血液流變儀LBY-N6K,(北京普利生儀器有限公司);Sysmex CA510型全自動(dòng)血凝分析儀(日本Sysmex株式會(huì)社);酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad公司)。
將1.5.2中肝素鈉采血管輕輕上下震蕩,使血液產(chǎn)生抗凝作用,用血液流變儀測(cè)定全血黏度和血漿黏度。
1.5.4 凝血四項(xiàng)測(cè)定
HE染色結(jié)果顯示,空白組心肌組織為正常心肌組織,心肌細(xì)胞橫紋清晰,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)血管擴(kuò)張及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。而在模型組中,可見(jiàn)心肌結(jié)構(gòu)破壞、紊亂、纖維增生。低劑量組心肌細(xì)胞損傷程度較模型組明顯減輕,細(xì)胞結(jié)構(gòu)大體規(guī)整,可見(jiàn)少量的纖維化改變,但無(wú)明顯大片纖維化病灶形成。中高劑量組心肌細(xì)胞纖維化程度進(jìn)一步減輕,未見(jiàn)明顯纖維化改變。見(jiàn)圖1。
1.5.5 PIVKA-Ⅱ、谷氨酸羧化酶、F1+2片段含量測(cè)定
將1.5.4中血漿按照ELISA試劑盒步驟操作,并用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算待測(cè)物質(zhì)濃度。
園林花卉的栽培與管理對(duì)于園林景觀的構(gòu)成與造景具有重要影響。因此,需要利用科學(xué)的栽培技術(shù)并加強(qiáng)對(duì)栽植花卉的日常管理,從而確?;ɑ苌L(zhǎng)良好。因此,需要通過(guò)合理種植、科學(xué)的水肥管理及病蟲(chóng)害防治,以保證花卉的安全性及經(jīng)濟(jì)效益。
1.5.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
PT測(cè)定試劑盒(批號(hào):1905048)、FIB測(cè)定試劑盒(批號(hào):1905010)、TT測(cè)定試劑盒(批號(hào):1905079)、APTT測(cè)定試劑盒(批號(hào):1905026)、氯化鈣、希森美康清洗液購(gòu)于上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司。凝血片段F1+2測(cè)定試劑盒、谷氨酸羧化酶測(cè)定試劑盒、PIVKA-Ⅱ測(cè)定試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科 技 有 限 公 司(批 號(hào):ml204917、ml059265、ml601445)。
將1.5.2中檸檬酸鈉采血管輕輕上下震蕩,使血液產(chǎn)生抗凝作用,冷凍離心15 min使血漿分離出,使用全自動(dòng)血凝分析儀分析,剩余血漿吸入EP管內(nèi),-80℃保存。
圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化(HE染色,×400)
1.5.2 標(biāo)本采集
表1 60天大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)(±s,n=10)
表1 60天大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)(±s,n=10)
注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。
組別 全血黏度/(mpa/s)3-1 60-1 200-1 血漿黏度150-1/(mpa/s )空白組18.80±2.76 5.86±0.81 4.35±0.77 1.46±0.08模型組 14.32±1.04## 4.71±0.93## 3.23±0.47## 1.13±0.14##陽(yáng)性對(duì)照組 16.19±1.20** 5.61±0.72* 3.84±0.37** 1.23±0.05*低劑量組 15.13±1.27 5.03±0.51 3.67±0.41* 1.21±0.06*中劑量組 16.04±1.71* 5.53±0.67* 3.73±0.27** 1.28±0.02**高劑量組 16.36±1.67** 5.66±0.43** 3.96±0.25** 1.31±0.11**
氣虛血瘀證動(dòng)物模型是中醫(yī)理論中一種常見(jiàn)的證候模型。“氣為血之帥”,氣能行血,氣虛不能充分推動(dòng)血液運(yùn)行以致血行不暢而瘀滯,或氣不行津,導(dǎo)致痰飲水濕停聚,而間接產(chǎn)生血流受阻致瘀,則發(fā)展為氣血同病、氣虛血瘀(因虛致瘀)。“血為氣之母”,血能生氣,血瘀則臟腑失養(yǎng)、生氣乏源,亦能致使氣虛,表現(xiàn)為氣血同病、氣虛血瘀(因瘀致虛)[9]。所以造模時(shí)從上述兩個(gè)方向入手,“饑則損氣”“勞則耗氣”可通過(guò)勞累加饑餓的方式以達(dá)到因虛致瘀[10],再通過(guò)寒涼的方式來(lái)達(dá)到因瘀致虛,多因素共同影響來(lái)營(yíng)造氣虛血瘀模型。
表2 60天大鼠凝血四項(xiàng)指標(biāo)變化情況
大鼠血漿中PIVKA-Ⅱ:模型組含量相對(duì)空白組明顯升高,藥物組含量在60天相對(duì)于模型組明顯降低;谷氨酸羧化酶:模型組含量相對(duì)于空白組明顯下降,藥物組含量相對(duì)模型組明顯提升;F1+2片段:模型組相較于空白組含量在20天明顯上升,在40天和60天含量明顯下降;藥物組在40天和60天相較于模型組均明顯上調(diào)。見(jiàn)表3~5。
表3 大鼠血漿中PIVKA-Ⅱ含量
表4 大鼠中血漿谷氨酸羧化酶含量
表5 大鼠血漿中中F1+2片段含量
60天模型組相較于空白組PT與APTT上升明顯,F(xiàn)IB在40天后明顯下降,TT有上升趨勢(shì)。藥物組在60天均對(duì)PT和APTT有明顯下調(diào)作用,中高劑量組FIB上調(diào)明顯,TT相較模型組有回落趨勢(shì),見(jiàn)表2。
將冷凍的胰臟置于4℃冰箱中解凍,待樣品將要完全解凍時(shí)從頭、體、尾三個(gè)部位剪取約0.5 g左右的胰腺,并用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)重。按質(zhì)量體積比1∶9的比例加入勻漿介質(zhì)在玻璃勻漿器中勻漿(整個(gè)操作過(guò)程都在冰浴條件下進(jìn)行)。充分勻漿后將勻漿液倒入離心管中3 000 r/min 4℃條件下離心10 min,收集上清并迅速將上清液分裝成若干份貯存于-20℃中,以備進(jìn)行酶活性分析。
血液流變學(xué)是判斷血液黏稠度的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)全血及血漿黏度明顯下降,APTT和PT明顯上升,F(xiàn)IB明顯降低等數(shù)據(jù)表明,氣虛血瘀模型大鼠處于低凝低黏的狀態(tài),為陳可冀[11]血瘀證分類(lèi)中的血瘀證Ⅱ型,與李雅君[12]龐樹(shù)齡等結(jié)果一致。部分疾病屬于這一類(lèi)型,主要表現(xiàn)為血液黏度低、血漿蛋白等有形成分不足,或者某一凝血功能不足等,常見(jiàn)貧血癥、部分月經(jīng)病、肝硬化等。
凝血四項(xiàng)是臨床上血栓性疾病的常用檢查指標(biāo)之一,是反映機(jī)體凝血功能正常與否,從而判斷是否有血液疾病及肝病的嚴(yán)重程度的重要手段[13]。在凝血四項(xiàng)結(jié)果中模型組PT在20天前有明顯下降,在40天、60天時(shí)明顯上升,F(xiàn)IB一直呈上升趨勢(shì),這種PT與APTT異常轉(zhuǎn)換可能是其他因素影響下的結(jié)果。肝臟作為機(jī)體的主要產(chǎn)熱單位,在機(jī)體遇到寒冷時(shí)會(huì)主動(dòng)進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài),不斷產(chǎn)生熱量,長(zhǎng)久以來(lái)會(huì)造成損傷,進(jìn)入失代償期。并且饑餓情況下肝部代謝功能降低,缺乏對(duì)維生素K的吸收與補(bǔ)充,導(dǎo)致凝血功能異常,通過(guò)APTT升高和PT升高推斷是維生素K缺乏導(dǎo)致,并且APTT和PT在20天時(shí)的表現(xiàn)與40天和60天相反,F(xiàn)IB表現(xiàn)降低預(yù)測(cè)模型大鼠有DIC前期高凝期和中期消耗性低凝期的表現(xiàn)[14]。
為了驗(yàn)證上述推測(cè),接著測(cè)定血漿中PIVKA-Ⅱ、谷氨酸羧化酶[15]、F1+2片段含量[16]。模型組相較于空白組PIVKA-Ⅱ明顯升高、谷氨酸羧化酶明顯降低,表明機(jī)體內(nèi)肝功能下降導(dǎo)致維生素K含量不足,營(yíng)養(yǎng)不良。F1+2片段在20天有提升,在40天和60天有明顯下降,結(jié)合凝血四項(xiàng)APTT先由20天的升高變?yōu)?0天、60天的顯著降低來(lái)推測(cè)體內(nèi)先有微血栓的生成,后面隨著肝臟功能負(fù)荷逐漸加重,出現(xiàn)DIC的中期的溶解表現(xiàn),表明血栓的生成與溶解過(guò)程,而補(bǔ)氣活血方及陽(yáng)性藥物組都可以顯著改善這幾個(gè)指標(biāo)狀況。
在傳統(tǒng)教學(xué)中英語(yǔ)教師在施教過(guò)程中往往采用填鴨式的教學(xué),教師關(guān)注學(xué)生的筆試多一點(diǎn)而輕視學(xué)生的聽(tīng)說(shuō)能力培養(yǎng)。在新課程理念的指引下,小學(xué)英語(yǔ)教師應(yīng)試著從傳統(tǒng)的教學(xué)形式中解脫出來(lái),改進(jìn)教學(xué)方式和方法,提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。但這些愿望的實(shí)現(xiàn)需要相關(guān)的政策支持與指導(dǎo)。
水資源規(guī)劃與規(guī)劃水資源論證的最大不同應(yīng)體現(xiàn)在“論證”二字,水資源規(guī)劃是創(chuàng)造性地提出區(qū)域水資源的相應(yīng)規(guī)劃措施,而規(guī)劃水資源論證重點(diǎn)是對(duì)規(guī)劃已有內(nèi)容的一個(gè)分析,雖然都涉及水資源配置、水資源管理等內(nèi)容,但報(bào)告編制的概念、工作內(nèi)容的深度應(yīng)有所區(qū)別,規(guī)劃水資源論證在提出相關(guān)規(guī)劃調(diào)整、修改的結(jié)論上不應(yīng)達(dá)到水資源規(guī)劃的深度。
綜上所述,本研究成功復(fù)制氣虛血瘀大鼠模型,并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)具有維生素K缺乏(營(yíng)養(yǎng)不良)、心肌輕微纖維化、DIC前中期表現(xiàn),并推斷可誘發(fā)心功能及肝功能受損等癥狀。而補(bǔ)氣活血方可以顯著改善上述狀態(tài),并且對(duì)肝臟起到了明顯的保護(hù)作用。驗(yàn)證了補(bǔ)氣活血方對(duì)治療低凝狀態(tài)下氣虛血瘀證有著很好的療效。
山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)學(xué)報(bào)2021年6期