李騰宇 于肖鵬 李曉光 王延秀 李俊福 陳岱韻 孫 振

1.泰安市中心醫(yī)院口腔科，山東 泰安 271000；2.泰安市中心醫(yī)院疼痛科，山東 泰安 271000；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科，山東 泰安 271000

舌癌是一種發(fā)病率、復(fù)發(fā)率高的惡性腫瘤，發(fā)生復(fù)發(fā)后則預(yù)后不良。因此研究更加安全有效的治療方法，例如基因治療，就成為近來研究的熱點(diǎn)。VEGF在舌癌等多種腫瘤中表達(dá)［1-4］，在腫瘤的血管生成中起重要作用，目前針對(duì)VEGF靶點(diǎn)的重組人源單克隆抗體-貝伐單抗，已經(jīng)應(yīng)用于臨床。生存素（Survivin）是至今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等緊密相關(guān)，其可直接抑制Caspase-3及Caspase-7［5］，同時(shí)，Survivin也可對(duì)抗G2／M期對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，使腫瘤細(xì)胞可通過凋亡的關(guān)卡，增進(jìn)癌細(xì)胞的異常增殖及生長［6］。在肺癌、卵巢癌等［7-8］研究中已證實(shí)，Survivin-ASODN可以明顯抑制腫瘤生長。本研究將VEGF-ASODN、Survivin-ASODN聯(lián)合應(yīng)用，觀察其對(duì)裸鼠舌癌移植瘤的治療作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物

BALB／c，4～6周齡的雌性nu／nu裸鼠，體重20～22 g，共25只，購于斯萊克上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，SPF級(jí)的無菌飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)。共5組，每組裸鼠5只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

VEGF反義寡核苷酸序列為：5＇-TGGCTTGAAGATGTACTCGAT-3＇，Survivin反義寡核苷酸序列為：5’-CCACGGCCTCCCAAAGTGCTG-3’，均用硫代磷酸化進(jìn)行修飾，委托大連寶生物公司進(jìn)行合成。Invitrogen公司提供陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000（LIP），免疫組織化學(xué)試劑盒（武漢博士德生物公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

建立裸鼠移植瘤模型方法：無菌條件下Tca8113舌癌細(xì)胞制備成為單細(xì)胞懸液，濃度是1×107個(gè)細(xì)胞／ml，每只裸鼠右股部皮下注射0.2 ml，成瘤標(biāo)準(zhǔn)是皮下腫物直徑超過0.5 cm。①聯(lián)合ASODN組：每次在裸鼠瘤體及瘤周注入Survivin-ASODN、VEGF-ASODN各66μg，注射液體積為200μl，內(nèi)含LipofectamineTM 2000和無血清1640液。②VEGF-ASODN組：同上述方法注射VEGFASODN 66μg。③Survivin-ASODN組：同法注射Survivin-ASODN 66μg。④脂質(zhì)體組：同法注射等量脂質(zhì)體200μl。⑤生理鹽水（NS）組：注射等量NS200μl。3天注射1次，共7次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束2 d后，全麻下處死裸鼠，稱取腫瘤重量并測(cè)量大小，體積＝1／6πab2（a為腫瘤最大處長徑，b為腫瘤最短徑）。抑瘤率＝（NS組腫瘤重量－治療組腫瘤重量）／NS組腫瘤重量×100%。腫瘤制作石蠟切片，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)VEGF、Survivin、PCNA、CD34表達(dá)水平。

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定方法

1.4.1 細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核有棕黃色顆粒為VEGF、Survivin蛋白表達(dá)陽性，見圖1、圖2。染色結(jié)果定量分析，使用HPIAS-1000彩色病理圖文計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)。每張組織切片選取無非特異性染色、細(xì)胞棕黃色陽性顆粒清晰、能反映該片染色強(qiáng)度部位，選取4個(gè)視野，200倍鏡頭下檢測(cè)組織切片光密度值（OD值），取其平均值，以此結(jié)果間接反映該片VEGF、Survivin的表達(dá)量。

圖1 VEGF陽性Tca8113舌癌細(xì)胞漿內(nèi)含有棕褐色顆粒（免疫組化DAB染色×400）

圖2 Survivin陽性Tca8113舌癌細(xì)胞漿內(nèi)含有棕褐色顆粒（免疫組化DAB染色×400）

1.4.2 分裂細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antige，PCNA）標(biāo)記指數(shù)（PCNA label index，PLI）以細(xì)胞核出現(xiàn)棕褐色顆粒為PCNA陽性細(xì)胞，見圖3。選取500個(gè)癌細(xì)胞，計(jì)數(shù)其中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)量，其所占的百分比即為PLI。

圖3 PCNA陽性Tca8113舌癌細(xì)胞核內(nèi)含有棕褐色顆粒（免疫組化DAB染色×400）

1.4.3 腫瘤微血管計(jì)數(shù)的計(jì)算方法 依照Weidner［9］的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，觀察腫瘤組織內(nèi)有染色的微小血管及毛細(xì)血管，血管有單個(gè)或多個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)棕色染色，即算作一個(gè)血管計(jì)數(shù)值，每張組織切片選取三個(gè)血管最多的腫瘤間質(zhì)區(qū)，200倍鏡頭下進(jìn)行血管計(jì)數(shù)，每個(gè)腫瘤標(biāo)本分別計(jì)數(shù)五個(gè)視野，其均值即為腫瘤的微血管密度（microvessel density，MVD）。見圖4。

圖4 CD34陽性血管內(nèi)皮細(xì)胞染色呈棕色（免疫組化DAB染色×400）

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤組織中VEGF、Survivin表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

取VEGF、Survivin免疫組織化學(xué)染色切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，聯(lián)合轉(zhuǎn)染組、單獨(dú)轉(zhuǎn)染組與NS組、脂質(zhì)體組相比，其腫瘤細(xì)胞染色較淺，陽性細(xì)胞數(shù)量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組與VEGF-ASODN單獨(dú)轉(zhuǎn)染組比較，VEGF表達(dá)明顯降低（P＜0.05），Survivin表達(dá)也明顯降低（P＜0.05）。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組與Survivin-ASODN單獨(dú)轉(zhuǎn)染組比較，VEGF表達(dá)明顯降低（P＜0.01），Survivin表達(dá)也明顯降低（P＜0.05）。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NS組和脂質(zhì)體組比較差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。說明VEGF-ASODN及Survivin-ASODN對(duì)腫瘤VEGF及Survivin表達(dá)有明顯的抑制作用，聯(lián)合轉(zhuǎn)染抑制作用更強(qiáng)。

2.2 PLI檢測(cè)結(jié)果

在聯(lián)合轉(zhuǎn)染組和單獨(dú)轉(zhuǎn)染組，PLI明顯低于NS組及脂質(zhì)體組，聯(lián)合轉(zhuǎn)染組較單獨(dú)轉(zhuǎn)染組PLI明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），NS組與脂質(zhì)體組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。說明VEGF-ASODN及Survivin-ASODN對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，聯(lián)合轉(zhuǎn)染抑制作用更強(qiáng)，NS及脂質(zhì)體無明顯抑制腫瘤增殖作用。

2.3 腫瘤組織的MVD檢測(cè)結(jié)果

CD34表達(dá)陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)有棕褐色染色，聯(lián)合轉(zhuǎn)染組及單獨(dú)轉(zhuǎn)染組CD34的表達(dá)明顯低于NS組及脂質(zhì)體組，聯(lián)合轉(zhuǎn)染組較單獨(dú)轉(zhuǎn)染組CD34的表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），NS組與脂質(zhì)體組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。說明VEGF-ASODN及Survivin-ASODN明顯抑制腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長增殖，聯(lián)合轉(zhuǎn)染的抑制增殖生長作用更強(qiáng)。

表1 各實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織VEGF、Survivin和PLI、MVD檢驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）

表1 各實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織VEGF、Survivin和PLI、MVD檢驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）

注：與NS組比較，*P＜0.01。與脂質(zhì)體組比較，ΔP＜0.01。與VEGF-ASODN組比較，▲P＜0.01，▲▲P＜0.05。與Survivin-ASODN組比較，☆P＜0.01，☆☆P＜0.05。

組別 VEGF（OD值） Survivin（OD值）PLI MVD NS組0.59±0.03 0.62±0.03 38.03±3.67 17.37±1.14脂質(zhì)體組 0.57±0.04 0.60±0.03 36.17±2.21 16.72±2.15 VEGF-ASODN組 0.38±0.03*，Δ 0.41±0.02*，Δ 20.18±2.18*，Δ 10.03±1.38*，Δ Survivin-ASODN組 0.41±0.04*，Δ 0.36±0.02*，Δ，▲▲ 19.27±2.17*，Δ 10.12±1.29*，Δ聯(lián)合ASODN組 0.33±0.02*，Δ，▲▲，☆☆ 0.31±0.03*，Δ，▲，☆☆ 10.16±1.36*，Δ，▲，☆ 7.01±1.18*，Δ，▲▲，☆☆Welch F值 63.33 143.21 120.21 47.73 P值＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 移植瘤的重量、體積和抑瘤率檢測(cè)結(jié)果

聯(lián)合轉(zhuǎn)染組和單獨(dú)轉(zhuǎn)染組與NS組及脂質(zhì)體組比較，其體積、重量明顯減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組與單獨(dú)轉(zhuǎn)染組比較，其體積、重量更小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組和單獨(dú)轉(zhuǎn)染組與脂質(zhì)體組比較，其抑瘤率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組與單獨(dú)轉(zhuǎn)染組比較，其抑瘤率差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表2 移植瘤的平均體積及重量（±s，n＝5）

表2 移植瘤的平均體積及重量（±s，n＝5）

注：與NS組比較，*P＜0.01。與脂質(zhì)體組比較，ΔP＜0.01。與VEGF-ASODN組比較，▲P＜0.01。與Survivin-ASODN組比較，☆P＜0.01。

組別 腫瘤平均體積（cm3） 腫瘤平均瘤重（g） 抑瘤率（%）NS組 2.52±0.38 2.27±0.34—脂質(zhì)體組 2.21±0.32 1.99±0.23 12.33±4.07 VEGF-ASODN組 1.21±0.11*，Δ 1.09±0.12*，Δ 51.98±9.36*，Δ Survivin-ASODN組 1.24±0.12*，Δ 1.12±0.14*，Δ 50.66±9.27*，Δ聯(lián)合ASODN組 0.61±0.13*，Δ，▲，☆ 0.55±0.13*，Δ，▲，☆ 75.77±9.04*，Δ，▲，☆Welch F值 53.33 57.03 50.67 P值＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討 論

腫瘤的發(fā)生及發(fā)展調(diào)控復(fù)雜，是多途徑、多因子及多通路的作用結(jié)果，所以單靶點(diǎn)治療難以根治腫瘤［10］。因此我們考慮同時(shí)多靶點(diǎn)干預(yù)，探討其作用效果。目前抗血管生成是研究熱點(diǎn)之一［11］，VEGF是其經(jīng)典靶點(diǎn)，已有實(shí)驗(yàn)證明其安全有效［12］。我們的前期研究表明，單VEGF-ASODN對(duì)癌細(xì)胞增殖抑制明顯［13-14］。Survivin表達(dá)于多數(shù)腫瘤組織，而且正常組織幾乎不表達(dá)，這種表達(dá)的特異性使其成為理想的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將VEGF-ASODN、Survivin-ASODN聯(lián)合應(yīng)用，進(jìn)行雙靶點(diǎn)基因治療，觀察該方法對(duì)腫瘤生長的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了VEGFASODN及Survivin-ASODN聯(lián)合應(yīng)用的效果更佳。單獨(dú)使用VEGF-ASODN或Survivin-ASODN均有效地抑制了腫瘤生長。但與單獨(dú)應(yīng)用相比，聯(lián)合轉(zhuǎn)染組表現(xiàn)出了比單ASODN更強(qiáng)的抑制腫瘤生長的作用效果，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這可能與VEGF、Survivin表達(dá)具有相關(guān)性，和兩者對(duì)腫瘤的作用途徑有關(guān)聯(lián)［15-18］。在ASODN單獨(dú)轉(zhuǎn)染組，其本身的靶基因表達(dá)出現(xiàn)了降低，同時(shí)另一基因也表達(dá)降低（P＜0.01）。這樣聯(lián)合轉(zhuǎn)染組既有兩者對(duì)本身靶基因的表達(dá)抑制，又有對(duì)應(yīng)基因的抑制作用，兩個(gè)作用疊加互相強(qiáng)化，使得聯(lián)合轉(zhuǎn)染組VEGF和Survivin表達(dá)較單獨(dú)轉(zhuǎn)染組更低（P＜0.01）。說明VEGF和Survivin表達(dá)可能信號(hào)通路相關(guān)，且有相互促進(jìn)作用。由此推斷VEGF-ASODN既抑制了VEGF表達(dá)，同時(shí)可能降低了Survivin抗凋亡作用，促進(jìn)腫瘤血管退化，Survivin-ASODN除了抑制Survivin表達(dá)，同時(shí)可能抑制VEGF基因表達(dá)，加速腫瘤血管凋亡，此結(jié)果與其他作者的［19-20］研究基本相同。

PCNA為DNA聚合酶δ的輔助蛋白，常常作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)。在細(xì)胞增殖周期中，G2／M期是一重要調(diào)控檢查點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞在DNA損傷后，有選擇性地停留在G2期的趨勢(shì)，所以在G2／M期，通過誘導(dǎo)凋亡可以消除異常細(xì)胞［21］，例如腫瘤細(xì)胞。而Survivin-ASODN可以阻滯瘤細(xì)胞停留在G2／M期，進(jìn)而有利于促進(jìn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8，22］。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組不但增加了誘導(dǎo)凋亡，同時(shí)減少血管生長，本實(shí)驗(yàn)的移植瘤PCNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01），說明明顯降低了舌癌細(xì)胞增殖。MVD反映腫瘤的血管密度和營養(yǎng)供給情況，本實(shí)驗(yàn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染組明顯降低MVD和移植瘤體積及重量（P＜0.01），聯(lián)合轉(zhuǎn)染組作用更強(qiáng)（P＜0.01），說明其明顯抑制了腫瘤微血管生長和腫瘤生長。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VEGF和Survivin雙靶點(diǎn)ASODN聯(lián)合應(yīng)用治療舌癌，效果優(yōu)于單靶點(diǎn)。通過ASODN抑制Survivin及VEGF的表達(dá)，進(jìn)而降低舌癌細(xì)胞增殖生長，同時(shí)減少舌癌新生血管生成，可以達(dá)到治療舌癌的目的。這為舌癌的綜合治療提供了一個(gè)新手段，應(yīng)用前景廣闊。