劉雅鑫，葛富月，李婧璐，劉柏玲

(曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，273165，山東省曲阜市)

0 引 言

金錢木(Portulacamolokiniensis)，別稱圓貝馬齒莧、云葉、金鋮木，為馬齒莧科(Portulacaceae)馬齒莧屬(Portulaca)的多年生常綠草本，因肥厚的葉片排列整齊形似銅錢而得名，是近年來流行的室內(nèi)觀葉植物.金錢木高12～35 cm，主莖直立，呈圓柱形，具分支.葉交互對生，無柄或近無柄，肉質(zhì)，長圓形或倒卵形，沿莖的頂端部分簇生排列成4個覆瓦狀，下部葉隨著植株的生長逐漸凋落，上部葉常聚生成總苞狀.頭狀花序，黃色，清晨開放，夜晚即閉合[1].金錢木具有較高的觀賞價值和經(jīng)濟(jì)效益，目前金錢木的生產(chǎn)繁殖方式主要是分株和扦插，有較大的局限性，限制了其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.植物組織培養(yǎng)技術(shù)不受季節(jié)和環(huán)境的限制，可以克服傳統(tǒng)技術(shù)繁殖的缺點，是快速繁殖植物的簡便可靠方法[2-4].據(jù)我們所知，目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)金錢木快速繁殖方法的報道.因此我們根據(jù)同屬植物馬齒莧(portulacaoleracea)組織培養(yǎng)的研究，開展金錢木的組織培養(yǎng)快速繁殖試驗.本研究以金錢木的葉片為外植體，在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度和不同種類的植物激素研究其對金錢木葉片誘導(dǎo)和增殖效果的影響，探索出最佳培養(yǎng)基配方，建立了金錢木快速繁殖的組織培養(yǎng)體系，為其工廠化生產(chǎn)提供了技術(shù)參考，有利于金錢木的便捷高效生產(chǎn).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料購自杭州丹諾園藝有限公司，種植于曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院溫室，以健康金錢木葉片為外植體，MS(Murashige and Skoog)為基本培養(yǎng)基進(jìn)行試驗.

1.2 試驗方法

1.2.1 選材與消毒

從金錢木植株上選取生長狀態(tài)良好、肉質(zhì)化程度高的葉片為外植體.為除去葉片表面灰塵，加洗潔精清洗之后在緩水下沖洗30 min后放入已滅菌的空瓶中.在超凈工作臺中用70%酒精消毒30 s后用無菌水沖洗2～3次.之后再用0.1%升汞(HgCl2)溶液消毒5 min(加入1～2滴吐溫使消毒更充分)，期間不停地?fù)u晃，最后用無菌水沖洗3～5次，每次1 min.將消毒后的葉片置于無菌濾紙上吸去多余的水分，之后用解剖刀切成約1 cm2大小，備用.

1.2.2 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

將切好的外植體接種至添加不同細(xì)胞分裂素6-BA(6-benzylaminopurine，芐胺基嘌呤)、KT(kinetin，激動素)和TDZ(thidiazuron，苯基噻二唑基脲)的MS基本培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生(表1).28 d后統(tǒng)計誘導(dǎo)的不定芽數(shù)量和不定芽誘導(dǎo)率.

不定芽誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%.

1.2.3 不定芽增殖培養(yǎng)

選取初代培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的不定芽，切下后接種到含有不同濃度的6-BA和NAA(naphthaleneacetic acid，萘乙酸)組合的MS培養(yǎng)基中(表2)，探究不同激素濃度組合對金錢木不定芽增殖的影響.第7 d統(tǒng)計不定芽的數(shù)目、增殖系數(shù)(倍)和玻璃化率.

不定芽增殖系數(shù)=產(chǎn)生的不定芽數(shù)目/接種的不定芽數(shù)目.

玻璃化率=(不定芽發(fā)生玻璃化數(shù)目/產(chǎn)生的不定芽數(shù)目)×100%.

1.2.4 不定芽生根培養(yǎng)

選取增殖培養(yǎng)中生長狀態(tài)一致的不定芽置于不同的生根培養(yǎng)基中(表3)，探究不同濃度的NAA、IBA(indole-butyric acid吲哚丁酸)、IAA(indole-3-acetic acid 吲哚乙酸)對金錢木不定芽生根的影響.第21 d統(tǒng)計生根的數(shù)目、根長、生根率以及植株高度.

試管苗生根率=(生根試管苗數(shù)/接種試管苗數(shù))×100%.

1.2.5 煉苗與移栽

選擇根系良好、生長健壯的金錢木幼苗，打開瓶蓋煉苗.第4天，取出瓶里的無菌苗，用清水洗凈根部粘附的培養(yǎng)基，于通風(fēng)處晾干.將幼苗移入混有蛭石(營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)的土壤中.一個月后統(tǒng)計成活率.

成活率=(成活的植株數(shù)/移栽的植株數(shù))×100%.

1.2.6 培養(yǎng)條件

選用MS為基本培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基中添加30 g蔗糖，6.5 g瓊脂，加入不同種類和不同濃度的激素，將pH調(diào)至5.8～6.0，分裝后，高壓滅菌(1.1 Mpa，121 ℃)15 min.外植體接種后均置于培養(yǎng)溫度為251±1 ℃，光照12 h/d，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx的培養(yǎng)室中培養(yǎng).

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

每瓶培養(yǎng)基中接種3個外植體，每處理5瓶，重復(fù)3次.利用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析和Duncan檢驗.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同細(xì)胞分裂素對金錢木誘導(dǎo)不定芽的影響

為誘導(dǎo)金錢木的葉片形成愈傷組織進(jìn)而誘導(dǎo)不定芽，在MS培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的6-BA、KT和TDZ(表1).結(jié)果表明，外植體切口處在第7 d開始出現(xiàn)愈傷組織，體積變大并增厚(圖1A).第14 d左右，愈傷組織上長出不定芽，極少數(shù)的不定芽直接在外植體上誘導(dǎo)出來，不定芽剛開始為嫩黃色，此后迅速生長增大轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色(圖1B).在不添加任何細(xì)胞分裂素時，不能誘導(dǎo)出愈傷組織和不定芽，而細(xì)胞分裂素6-BA在誘導(dǎo)金錢木愈傷組織形成的過程中起關(guān)鍵作用.在含有6-BA的MS培養(yǎng)基中，產(chǎn)生了較多的愈傷組織且誘導(dǎo)出不定芽，各個處理的愈傷組織較大，誘導(dǎo)出的不定芽數(shù)量較多，葉片較大.在含有0.5 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)的不定芽數(shù)量最多，為5.8個；6-BA為0.5 mg/L和 1 mg/L的MS培養(yǎng)基中，不定芽誘導(dǎo)率分別達(dá)到了93.3%和95.6%.因此，誘導(dǎo)金錢木不定芽產(chǎn)生的最適培養(yǎng)基為MS + 6-BA 1.0 mg/L. KT和TDZ不利于愈傷組織的形成，不能或只能少量誘導(dǎo)出不定芽.

表1 不同細(xì)胞分裂素對金錢木不定芽誘導(dǎo)的影響

續(xù)表

2.2 不同濃度組合的6-BA和NAA對金錢木不定芽增殖的影響

將生長狀況良好的不定芽分別接種在不同濃度的6-BA和NAA培養(yǎng)基中對不定芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)(表2).結(jié)果表明，細(xì)胞分裂素6-BA濃度為0.5 mg/L時，組培苗的玻璃化現(xiàn)象較嚴(yán)重，隨著NAA濃度的增加，不定芽增殖系數(shù)逐漸降低.當(dāng)6-BA濃度較高(1 mg/L)時，不定芽生長情況隨時間的延長出現(xiàn)明顯分化，由1個芽分化形成多個不定芽(圖1C).當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L，NAA濃度為0.1 mg/L和0.3 mg/L時不定芽增殖率基本相同，而 NAA濃度為0.1 mg/L時，不定芽的葉片較大，不定芽玻璃化程度較低.綜上所述，金錢木不定芽增殖最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA.

2.3 不同濃度的生長素對金錢木不定芽生根的影響

將生長狀況一致的不定芽接種至含有不同濃度的NAA、IBA以及IAA的生根培養(yǎng)基中，觀察并分析其對金錢木不定芽生根的影響(表3).結(jié)果表明，第7 d開始出現(xiàn)不定根，第14 d時，大部分不定芽已長出根，第21 d時，大部分植株的根出現(xiàn)了纏繞，根的數(shù)量明顯增加(圖1D，E).當(dāng)IBA濃度為0.1 mg/L時，不定芽生根率最高，根最長，植株高度最高.NAA濃度為0.5 mg/L時，植株的根數(shù)最多，但很細(xì).綜上所述，誘導(dǎo)金錢木不定芽生根的最佳培養(yǎng)基為 1/2MS+0.1 mg/L IBA.

續(xù)表

2.4 煉苗與移栽

選取生根狀態(tài)良好的植株煉苗3 d，然后取出植株，根部培養(yǎng)基沖洗干凈后移入混合蛭石的土壤中.每天光照12 h，溫度維持在25 ℃左右，罩上透明蓋子保濕，一個月后統(tǒng)計植株存活率達(dá)90.0%以上(圖1F).

圖1 金錢木組織培養(yǎng)過程

3 討 論

3.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對金錢木不定芽誘導(dǎo)、增殖和生根的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑是組織培養(yǎng)中調(diào)控植物生長分化的關(guān)鍵因素，培養(yǎng)基中不同的生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度影響器官分化的過程[2-5].金錢木的葉片外植體在不添加任何細(xì)胞分裂素時不能形成愈傷組織和不定芽，而不同的細(xì)胞分裂素對金錢木不定芽的誘導(dǎo)和增殖效果不同，在含有6-BA的MS培養(yǎng)基中產(chǎn)生了較多的愈傷組織并誘導(dǎo)出不定芽，每個處理的愈傷組織均較大，誘導(dǎo)出的不定芽數(shù)量均較多，說明6-BA的誘導(dǎo)效果最好，這與李燾[6]、黃紅梅[7]等在馬齒莧(Portulacaoleracea)組織培養(yǎng)的研究結(jié)果一致，也與Liu等人在丹參(salviamiltiorrhiza)愈傷組織誘導(dǎo)的研究結(jié)果一致，即與TDZ和KT相比6-BA(1.0 mg/L)的誘導(dǎo)效果最好[8].本研究結(jié)果表明，高濃度的6-BA對愈傷組織的形成有抑制作用，與Liu等利用6-BA誘導(dǎo)丹參愈傷組織的影響一致[8]，這可能是6-BA的代謝活動誘導(dǎo)了植物組織中其他內(nèi)源激素的反應(yīng)[9].在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素TDZ時，外植體的不定芽誘導(dǎo)率和不定芽數(shù)均較低，而添加低濃度的KT時，不能形成愈傷組織和不定芽，表明KT對金錢木外植體誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生沒有效果.在金錢木不定芽增殖培養(yǎng)中，在含有6-BA的培養(yǎng)基中添加生長素NAA，結(jié)果表明在細(xì)胞分裂素和生長素的相對濃度較高的情況下，不定芽的增殖率較高，這與Sivanesan等在瓜葉菊(Seneciocruentus)中的研究結(jié)果一致[10]，即在含有細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中添加一定量的生長素可以促進(jìn)不定芽的形成.健壯生長的不定芽在MS基本培養(yǎng)基中時，增殖率很低，并且出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，表明植物生長調(diào)節(jié)劑是金錢木不定芽增殖所必需的.

一般情況下只用生長素處理就能誘導(dǎo)生根[11].在人參(Panaxginseng)組織培養(yǎng)的生根誘導(dǎo)階段，Kim等人證明IBA的效果比NAA更有效[12].本試驗在1/2MS培養(yǎng)基中添加NAA、IBA和IAA三種生長素，其中IBA更有利于金錢木的不定芽誘導(dǎo)出不定根(圖1E)，不定芽生根率最高達(dá)88.9%，這與黃策群[7]、黃紅梅[13]等在馬齒莧組織培養(yǎng)的研究結(jié)果一致，說明生長素IBA是誘導(dǎo)金錢木不定芽生根的有效植物生長調(diào)節(jié)劑.

3.2 金錢木組織培養(yǎng)過程中玻璃化和褐化對其生長的影響

在金錢木的不定芽增殖培養(yǎng)中，不定芽發(fā)生玻璃化較普遍.玻璃化導(dǎo)致組培苗形態(tài)異常，使葉片呈透明化狀態(tài)[14,15].玻璃化的發(fā)生受多種因素的影響，比如外植體的類型；組培環(huán)境的通風(fēng)條件、光照、溫度；培養(yǎng)基的成分；組培苗自身發(fā)育的影響等[16-18].金錢木不定芽玻璃化可能是由于培養(yǎng)基的水分含量較高、培養(yǎng)基的成分以及不定芽的內(nèi)部激素含量不均勻等因素造成的.因此，適當(dāng)提高培養(yǎng)基中瓊脂的濃度、增加自然光照、控制光照時間、改善培養(yǎng)基的成分可減少玻璃化苗的產(chǎn)生.在后續(xù)的研究中可進(jìn)行不同溫度對金錢木組織培養(yǎng)過程中玻璃化的試驗，探索出最適宜的培養(yǎng)溫度從而提高生產(chǎn)效率.

在金錢木的繼代培養(yǎng)過程中會有褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生，第14 d就能觀察到部分不定芽的頂部變黃，第30 d時，不定芽由最初的鮮綠色變?yōu)榘迭S色，最后變黑枯死.褐變主要是由于組培苗酚類物質(zhì)含量的不同和多酚氧化酶活性的差異造成的[19,20].褐化也與外植體類型、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等因素有關(guān)[15].劉淑蘭等對核桃(Juglansregia)的試驗證明，不同季節(jié)、不同樹齡的外植體，褐化發(fā)生的情況不同，通常幼齡外植體比老齡外植體褐化輕、褐化率低[21].在金錢木的組織培養(yǎng)試驗時盡量選擇幼嫩的葉片，以降低組培苗的褐化程度.在金錢木不定芽誘導(dǎo)第14 d左右即進(jìn)行不定芽增殖試驗，防止不定芽褐化影響不定芽增殖培養(yǎng).另外，也可以通過在培養(yǎng)基中添加褐變抑制劑和吸附劑，多次轉(zhuǎn)移等方式降低褐化現(xiàn)象的發(fā)生[20].如何減少金錢木組織培養(yǎng)過程中玻璃化和褐化的產(chǎn)生還有待進(jìn)一步的研究.

總之，在金錢木苗木繁殖中采用組培快繁技術(shù)，可以避免地理環(huán)境、季節(jié)和母本數(shù)量的限制，并且在較短時間內(nèi)快速繁殖這種經(jīng)濟(jì)價值較高的植物.本研究結(jié)果為利用組培方法大量繁殖金錢木的工廠化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義.