田岐震, 魏少鵬,2, 姬志勤*,,2

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 陜西省植物源農(nóng)藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

臭椿Ailanthus altissima是原產(chǎn)于東亞的苦木科臭椿屬植物，其根皮和果實(shí)為傳統(tǒng)中藥[1]。迄今為止，已從臭椿中分離鑒定了數(shù)十個(gè)苦木苦味素類(lèi)化合物，這些化合物表現(xiàn)出抗病毒、抗腫瘤、抗瘧及抗菌等多種藥理活性[2-4]。1959年，Mergen首次報(bào)道臭椿提取物具有除草活性[5]；1995年，臭椿提取物中的除草活性成分被分離鑒定為臭椿酮[6]。2003年，De Feo等對(duì)臭椿根皮中的除草活性成分進(jìn)行了系統(tǒng)分離，從中得到臭椿酮、ailanthinone、chaparrine和ailanthinol B 4個(gè)具有除草活性的苦木苦味素類(lèi)化合物，其中臭椿酮的活性最強(qiáng)[7]。2011年，Pedersini等比較了臭椿莖皮不同溶劑提取物的除草活性，發(fā)現(xiàn)其活性與臭椿酮的濃度呈正相關(guān)[8]。Heisey等報(bào)道了臭椿提取物對(duì)17種雜草的田間防除效果，發(fā)現(xiàn)提取物對(duì)其中13種供試雜草具有很好的防效[9]。2019年，Demasi等研究了臭椿酮苗前土壤處理防治雜草的田間持效期，發(fā)現(xiàn)其在低有機(jī)質(zhì)含量土壤中的持效期可達(dá)20～30 d，但在高有機(jī)質(zhì)含量土壤中的降解較快[10]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)臭椿酮 (或臭椿提取物)的除草活性進(jìn)行了較多的研究，證明臭椿酮具有開(kāi)發(fā)成植物源除草劑的潛在價(jià)值，然而有關(guān)臭椿酮除草作用機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。本研究測(cè)定了臭椿酮對(duì)植物種子萌發(fā)及相關(guān)生理生化指標(biāo)的影響，旨在為進(jìn)一步研究臭椿酮的除草作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑及植物

臭椿酮 (ailanthone，純度95%，CAS: 981-15-7)，本課題組從臭椿根皮中分離得到[11]。

油菜Brassica napus、小麥Triticum aestivum、馬齒莧Portulaca oleracea、苘麻Abutilon theophrasti、稗草Echinochloa crusgalli、反枝莧Amaranthus retroflexus、狗尾草Setaria viridis及馬唐Digitaria sanguinalis，以上供試作物及雜草的種子均采自西北農(nóng)林大學(xué)北校區(qū)農(nóng)場(chǎng)。

1.2 種子萌發(fā)活性測(cè)定

采用平皿法測(cè)定臭椿酮對(duì)8種供試植物種子萌發(fā)的影響[7]。先用少量二甲基亞砜溶解臭椿酮，再用體積分?jǐn)?shù)0.1%的Tween 80分別稀釋成1.56、3.13、6.25、12.50、25.00和50.00 μg/mL 的供試溶液，二甲基亞砜在所有供試溶液中的最終體積分?jǐn)?shù)不超過(guò)0.5%。先用體積分?jǐn)?shù)1%的次氯酸鈉溶液對(duì)種子進(jìn)行表面消毒，再用去離子水沖洗3次。將50粒種子均勻地放在培養(yǎng)皿 (9 cm) 的濾紙上，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入5.0 mL上述臭椿酮供試溶液。以含體積分?jǐn)?shù)0.5%的二甲基亞砜和0.1% Tween 80的水溶液作為溶劑對(duì)照。種子在25 ℃、16 h/8 h (光/暗) 條件下培養(yǎng)4 d。分別于24、48、72和96 h記錄萌發(fā)種子的數(shù)量 (以根長(zhǎng)2 mm為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn))。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 種子吸水量測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[12]。在鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿 (9 cm) 中分別加入5.0 mL質(zhì)量濃度為1.56、3.13、6.25、12.50和25.00 μg/mL 的臭椿酮溶液，分別放入油菜 (1.0 g) 和小麥 (2.0 g) 種子，在25 ℃恒溫條件下分別培養(yǎng)4、8、12和16 h。將種子從溶液中取出，吸干水分，稱(chēng)重，計(jì)算吸水量 (最終質(zhì)量減去初始質(zhì)量)。以含體積分?jǐn)?shù)為0.5%的二甲基亞砜和0.1%的Tween 80的水溶液作為溶劑對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.4 幼苗生長(zhǎng)的生理生化指標(biāo)的測(cè)定

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定臭椿酮抑制幼苗生長(zhǎng)中濃度。將萌發(fā)的油菜和小麥種子分別置于0.50 μg/mL和2.00 μg/mL臭椿酮溶液中，在25 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng) (光/暗 = 12 h/12 h)。以含體積分?jǐn)?shù)為0.5%的二甲基亞砜和0.1%的Tween 80的水溶液作為溶劑對(duì)照。當(dāng)對(duì)照組種子胚芽長(zhǎng)到約1.0 cm時(shí)，分別收集胚芽和胚根 (各0.50 g)，置于預(yù)冷的研缽中，加入0.05 mol/L預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液1.0 mL (pH 7.8)，然后將胚芽和胚根在冰上磨成粉末，分別提取超氧化物歧化酶 (SOD)、過(guò)氧化氫酶 (CAT)、過(guò)氧化物酶 (POD) 和總可溶性蛋白(TSP)[13]。當(dāng)對(duì)照組種子胚芽長(zhǎng)到約1.0 cm時(shí)，分別收集胚芽和胚根 (0.10 g)，加入蒸餾水5～10 mL，煮沸30 min，提取兩次，提取液過(guò)濾入25.00 mL容量瓶，用蒸餾水定容，提取總可溶性糖 (TSS)[14]。所有粗提液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用氮藍(lán)四唑光還原法[14]測(cè)定SOD活性；采用愈創(chuàng)木酚法[14]測(cè)定POD活性；采用高錳酸鉀滴定法[14]測(cè)定CAT活性；采用3,5-二硝基水楊酸法[14]、考馬斯藍(lán)G-250染色法[14]分別測(cè)定TSS和TSP含量。每處理重復(fù)3次。

1.5 對(duì)植物細(xì)胞有絲分裂的影響

參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[15]。將油菜種子置于含水濾紙上培養(yǎng)，待根長(zhǎng)為1.0 cm時(shí)，挑選生長(zhǎng)一致的幼苗移至質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.50和1.00 μg/mL的臭椿酮溶液中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取根尖0.5 cm部分，浸入卡諾氏固定液中固定6 h。取出根尖用去離子水沖洗至無(wú)醋酸氣味，接著將根尖浸入1 mol/L的鹽酸溶液，在60 ℃下孵育10 min。取出根尖用去離子水洗滌3次，置于載玻片上，用接種針將根尖搗碎，加入卡寶品紅染色10 min。放上蓋玻片，用鉛筆輕輕敲擊，使細(xì)胞均勻分布。光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。有絲分裂指數(shù)和畸形指數(shù)分別按公式 (1) 和 (2)計(jì)算。

式中：A，有絲分裂指數(shù)；C，分裂細(xì)胞數(shù)；D，頂端分生組織細(xì)胞總數(shù)；B，畸形指數(shù)；E，分裂異常數(shù)。

1.6 活性氧含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)方法[16]并略作修改。將油菜種子置于含水濾紙上催芽，待根長(zhǎng)為1.0 cm時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)相近的油菜幼苗，浸入0.10、1.00和10.00 μg/mL的臭椿酮溶液，于25 ℃黑暗培養(yǎng)12 h。以體積分?jǐn)?shù)為0.1%的二甲基亞砜溶液作為溶劑對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。將幼苗分別轉(zhuǎn)置于3,3-二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) 染色液和氯化硝基四氮唑藍(lán) (NBT)染色液中，于25 ℃黑暗培養(yǎng)箱中浸染2 h。取出幼苗觀察拍照，用Image J軟件進(jìn)行量化處理。按公式（3）計(jì)算染色強(qiáng)度。

式中：R，染色強(qiáng)度；F，未染色根尖灰度值；H，染色根尖灰度值。

1.7 細(xì)胞死亡率測(cè)定

參考文獻(xiàn)方法[15]并略作修改。將油菜種子置于含水濾紙上催芽，待根長(zhǎng)為1.0 cm時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)相近的油菜幼苗，浸入0.10、1.00和10.00 μg/mL的臭椿酮溶液。以體積分?jǐn)?shù)為0.1%二甲基亞砜溶液為對(duì)照，于28 ℃黑暗培養(yǎng)24、48和72 h，幼苗煮沸30 min作為死亡對(duì)照，將整株油菜浸入2.50 μg/mL的伊文思藍(lán)水溶液中，于旋轉(zhuǎn)搖床上25 ℃孵育30min，取出植株用去離子水洗滌，除去未結(jié)合的染料，并觀察拍照。每處理重復(fù)3次。運(yùn)用Image J對(duì)照片進(jìn)行量化處理。按公式(4)計(jì)算細(xì)胞相對(duì)死亡率。

式中：X，細(xì)胞相對(duì)死亡率；M，0.1%二甲基亞砜組灰度值；L，處理組灰度值；K，CK組灰度值；Z，煮沸對(duì)照組灰度值。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0軟件計(jì)算臭椿酮對(duì)種子萌發(fā)抑制IC50值，使用鄧肯氏新復(fù)極差法 (P< 0.05) 進(jìn)行差異顯著性分析；使用Image J量化處理染色強(qiáng)度；使用Excel 2010完成圖表繪制；使用Photoshop 6.0處理圖片。

2 結(jié)果與討論

2.1 臭椿酮對(duì)8種植物種子萌發(fā)的影響

從表1可以看出，臭椿酮對(duì)油菜、稗草、苘麻、狗尾草和馬唐的種子萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50值分別為3.74、9.86、9.71、3.87和3.76 μg/mL。臭椿酮對(duì)小麥和反枝莧種子萌發(fā)也有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50值分別為24.70和32.60 μg/mL。在供試濃度下，臭椿酮對(duì)馬齒莧種子萌發(fā)的抑制作用較弱。從結(jié)果可以看出，臭椿酮的除草活性在單子葉和雙子葉植物間無(wú)選擇性，但是個(gè)別雜草對(duì)臭椿酮的敏感性較低。臭椿酮對(duì)油菜和小麥的種子萌發(fā)有明顯抑制作用，有文獻(xiàn)也報(bào)道了臭椿提取物在采用莖葉噴霧法防治雜草時(shí)對(duì)番茄、白蘿卜、黃豆、向日葵、玉米、燕麥和南瓜有嚴(yán)重的藥害[9]，因此不建議將其用于大田作物及蔬菜生產(chǎn)中，但在園藝作物中作為一種非選擇性除草劑具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，相關(guān)應(yīng)用技術(shù)值得進(jìn)一步研究。

表1 臭椿酮對(duì)8種植物種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of ailanthone on seed germination of eight plants

2.2 臭椿酮對(duì)油菜和小麥種子吸水量的影響

萌發(fā)是種子從靜止干燥狀態(tài)到代謝活躍狀態(tài)，然后生長(zhǎng)成幼苗的過(guò)程[17]。這一過(guò)程始于干燥種子對(duì)水分的吸收，外源化合物可以抑制種子蛋白酶的活性，造成種子吸水能力下降，最終導(dǎo)致種子不能正常萌發(fā)[12,18]。臭椿酮處理后的油菜和小麥種子吸水量如圖1所示。可以看出，不同濃度臭椿酮處理的種子在吸水能力上并無(wú)明顯差異，與空白對(duì)照相比也沒(méi)有顯著差異，這說(shuō)明臭椿酮并未影響種子的吸水能力，由此可以推測(cè)臭椿酮不影響種子蛋白酶的活性。

2.3 臭椿酮對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響

SOD在保護(hù)細(xì)胞免受超氧化物自由基損傷方面發(fā)揮重要作用，它催化超氧化物自由基的降解生成過(guò)氧化氫[19]。細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫水平受多種酶調(diào)控，CAT是多酶體系中的一種[20]。POD是植物中的抗氧化酶，通過(guò)將過(guò)氧化氫還原為水來(lái)催化多種底物的氧化[21]。SOD、CAT和POD活性的增加是植物組織提高抗氧化能力的表現(xiàn)。

對(duì)油菜和小麥胚芽和胚根中SOD、CAT和POD的酶活性測(cè)定結(jié)果 (圖2) 表明：溶劑對(duì)照處理油菜胚根SOD活性為106.27 U/g, 臭椿酮處理后SOD活性增加至173.56 U/g。同樣，用臭椿酮處理后，小麥胚芽中SOD活性從1 851.43 U/g增加到2 159.61 U/g，小麥胚根中SOD活性從167.50 U/g 增加到441.54 U/g。臭椿酮也導(dǎo)致了CAT活性的輕微增加，小麥胚芽和胚根的CAT活性值從1.79 mg/(g?min)增加到2.20 mg/(g?min)，胚根的CAT活性值從0.41 mg/(g?min)增加到0.56 mg/(g?min)；處理過(guò)的油菜和小麥幼苗POD活性也高于對(duì)照組。

與對(duì)照組相比，臭椿酮提高了油菜和小麥胚中TSS和TSP的含量，說(shuō)明低劑量的臭椿酮能提高植物的整體代謝水平。

活性氧 (ROS) 的產(chǎn)生和消除是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，在植物體內(nèi)活性氧的消除主要依賴(lài)于細(xì)胞的抗氧化酶系，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧增加時(shí)，為維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，植物會(huì)提高抗氧化酶活性消除活性氧[22]。上述生理指標(biāo)試驗(yàn)證實(shí)臭椿酮的存在可以提高植物的抗氧化能力，但臭椿酮是否會(huì)誘導(dǎo)ROS的積累仍需通過(guò)活性氧染色試驗(yàn)進(jìn)行探究。

2.4 臭椿酮對(duì)細(xì)胞有絲分裂的影響

通過(guò)對(duì)油菜根分生組織細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)分析，評(píng)價(jià)了臭椿酮對(duì)油菜根分生組織細(xì)胞分裂的影響。暴露于臭椿酮 (0.01、0.05、0.10、0.50和1.00 μg/mL) 24 h后，較高濃度的臭椿酮 (0.50和1.00 μg/mL) 明顯抑制了油菜根的生長(zhǎng) (圖3 Ⅰ)，其中1.00 μg/mL的臭椿酮抑制率為40.60%。處理組根尖分生區(qū)有絲分裂指數(shù)均低于對(duì)照組，且臭椿酮對(duì)油菜細(xì)胞分裂的抑制作用呈劑量依賴(lài)性 (圖3 Ⅱ)。暴露于1.00 μg/mL的臭椿酮后，有絲分裂指數(shù)僅為0.48%，而對(duì)照組為5.85%。此外，臭椿酮還能導(dǎo)致畸形細(xì)胞的形成，其中0.10 μg/mL的臭椿酮處理后畸形指數(shù)最高，約為0.45% (圖3 Ⅱ、Ⅲ)。

2.5 臭椿酮對(duì)植物組織中活性氧積累的影響

活性氧是植物進(jìn)行代謝的副產(chǎn)物，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可以作為信號(hào)分子參與調(diào)控，但是活性氧的過(guò)度積累會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而對(duì)植物的生長(zhǎng)造成嚴(yán)重的損傷[23]。植物體內(nèi)的活性氧主要包括超氧陰離子 (O2?)、過(guò)氧化氫 (H2O2) 和羥基自由基 (?OH) 等。

由圖4可以看出，油菜根浸入臭椿酮后，不僅根長(zhǎng)受到了抑制，根部的活性氧含量也大幅升高，且其含量隨著臭椿酮質(zhì)量濃度的增加而升高，在10.00 μg/mL臭椿酮?jiǎng)┝肯?，油菜根長(zhǎng)幾乎沒(méi)有增長(zhǎng)，但是過(guò)氧化氫和超氧陰離子含量分別是溶劑對(duì)照的2.53倍和2.08倍。由試驗(yàn)結(jié)果得知，臭椿酮的存在可以在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)植物體內(nèi)大量活性氧的累積?？寡趸富钚詼y(cè)定結(jié)果表明，在臭椿酮的影響下，SOD、CAT和POD的活性都呈升高的趨勢(shì)，這與臭椿酮可以在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)大量活性氧積累相關(guān)，體內(nèi)活性氧含量升高會(huì)損害細(xì)胞正常生命活性，機(jī)體便會(huì)調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性來(lái)消除活性氧。

2.6 細(xì)胞死亡率測(cè)定

通過(guò)圖5 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ) 可以看出，染色較深的是根毛茂盛部位和根尖，對(duì)根尖區(qū)域的相對(duì)死亡率測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在臭椿酮相同質(zhì)量濃度下，根尖細(xì)胞的相對(duì)死亡率并沒(méi)有隨著時(shí)間的推移而產(chǎn)生較大變化。1.00 μg/mL臭椿酮處理24、48和72 h的細(xì)胞相對(duì)死亡率分別為8.56%、9.58%和10.23%，但是，在同一時(shí)間段，根尖細(xì)胞相對(duì)死亡率會(huì)隨著臭椿酮質(zhì)量濃度的增加而增大，0.10、1.00和10.00 μg/mL臭椿酮處理72 h時(shí)的細(xì)胞相對(duì)死亡率分別為6.01%、10.23%和21.36%。表明1.00 μg/mL臭椿酮在24 h內(nèi)就已經(jīng)造成細(xì)胞死亡，但是直至72 h細(xì)胞死亡的數(shù)量并沒(méi)有顯著增加，說(shuō)明受到臭椿酮影響失去活力的細(xì)胞占根尖細(xì)胞的比例變化不大。細(xì)胞有絲分裂周期為G1、S、G2和M4個(gè)時(shí)期，在外部條件相同的情況下，處于一個(gè)時(shí)期的細(xì)胞數(shù)量幾乎不變，例如，處于M期的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)5%～10%[24]。結(jié)合根尖分生區(qū)有絲分裂現(xiàn)象觀察，可以推測(cè)：臭椿酮的存在可以引起部分植物根尖分生區(qū)細(xì)胞死亡，使這一部分細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入M期，或進(jìn)入M期后引起有絲分裂畸形，從而減少新生細(xì)胞數(shù)量，導(dǎo)致根無(wú)法正常生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

臭椿酮對(duì)多種植物的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)具有很強(qiáng)的抑制作用，且在單子葉和雙子葉植物之間沒(méi)有選擇性。臭椿酮對(duì)植物種子吸水能力無(wú)明顯影響。植物生長(zhǎng)量的減少可能與臭椿酮抑制其細(xì)胞分裂有關(guān)。SOD、CAT和POD的酶活試驗(yàn)結(jié)果表明，臭椿酮提高了植物的抗氧化能力。DAB和NBT染色結(jié)果表明，臭椿酮誘導(dǎo)了植物組織中活性氧的積累，伊文思藍(lán)染色說(shuō)明臭椿酮可以引起一部分細(xì)胞死亡，但并未隨著時(shí)間的推移而增長(zhǎng)，推測(cè)臭椿酮的存在可以引起部分植物根尖分生區(qū)細(xì)胞死亡，并使這一部分細(xì)胞是無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞有絲分裂的M期，或進(jìn)入M期后會(huì)引起有絲分裂畸形，從而減少新生細(xì)胞數(shù)量，導(dǎo)致植物根系無(wú)法正常生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明，臭椿酮表現(xiàn)出較強(qiáng)抑制種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)活性，究其原因可能為活性氧積累，或引起了部分植物根尖分生區(qū)細(xì)胞死亡使其無(wú)法正常有絲分裂。