陳 辰，陳亞軍，蔣翠蓮，馬金飛，李義坤，鐘天鷹△

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院/南京市婦幼保健院檢驗(yàn)科,江蘇南京 210004；2.杭州凱萊譜醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310000

肝臟是人體重要的代謝器官，肝細(xì)胞以膽固醇為原料合成膽汁酸經(jīng)膽管排入十二指腸，協(xié)助脂類物質(zhì)完成消化吸收后，再通過(guò)門(mén)靜脈回流被肝臟重吸收，形成膽汁酸的“腸肝循環(huán)”[1-2]。膽汁酸的組成和結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，按結(jié)構(gòu)可分為兩大類,一類是游離型膽汁酸[3-4],包括膽酸(CA)、 脫氧膽酸(DCA)、 鵝脫氧膽酸(CDCA)、 熊脫氧膽酸(UDCA)和石膽酸(LCA)[5]；另一類是結(jié)合型膽汁酸[6],為游離型膽汁酸與甘氨酸或?；撬岬慕Y(jié)合物[7]。多種不同類型的膽酸共同構(gòu)成了膽汁酸譜。一旦肝臟或膽囊發(fā)生病變，如肝炎、肝硬化、膽石癥、妊娠期膽汁淤積癥(ICP)等，膽汁酸的“腸肝循環(huán)”受阻，血液中的膽汁酸水平升高，這些疾病的總膽汁酸(TBA)升高水平可能接近，但膽汁酸譜的成分不同，測(cè)定TBA水平對(duì)肝膽疾病的鑒別有局限性。因此，膽汁酸譜亞型檢測(cè)對(duì)于肝膽疾病的診斷和治療具有十分重要的意義。近年來(lái)有研究表明，通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)膽汁酸譜亞型進(jìn)行測(cè)定，可以有效提高肝膽疾病的診斷效率[5]。由于以往的測(cè)定方法比較煩瑣，并且沒(méi)有適合于特定人群(如孕期、兒童)的膽汁酸譜參考區(qū)間，限制了其在臨床實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用。本研究擬建立一種基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)技術(shù)的血清膽汁酸譜檢測(cè)方法，并進(jìn)行性能評(píng)估，有利于孕期不同肝膽疾病的鑒別診斷，并建立適合于孕期的膽汁酸譜參考區(qū)間，以便更及時(shí)、有效地對(duì)孕期肝膽疾病進(jìn)行干預(yù)。

1 資料與方法

1.1儀器與試劑 儀器：ABsciex 4500三重四極桿質(zhì)譜儀，Jasper系列高效液相色譜儀(美國(guó)ABsciex公司)；試劑：甲醇(HPLC級(jí)，美國(guó)Merk公司)，乙酸銨(MS級(jí)，美國(guó)SIGMA公司)，樣本前處理試劑(含氘代內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液)購(gòu)自迪安生物有限公司，純凈水為市售屈臣氏蒸餾水。

1.2混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液配置 膽汁酸亞型標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司，制成混標(biāo)溶液后逐級(jí)稀釋為7種濃度梯度(S1～S7濃度比為：1∶2∶5∶20∶50∶100∶200)，各亞型濃度見(jiàn)表1。

表1 混標(biāo)溶液各濃度點(diǎn)各亞型膽汁酸濃度(ng/mL)

1.3樣本收集 隨機(jī)選取南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院2018年7-8月產(chǎn)科門(mén)診某診室所有孕中期初次常規(guī)產(chǎn)前檢查表觀健康孕婦。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡22～40歲，孕周14～28周。剔除標(biāo)準(zhǔn)：肝膽疾病、肝功能異常，心血管疾病及腎臟病等慢性病，以及吸煙、酗酒等不良生活習(xí)慣?？崭钩檠罅⒓措x心，剔除溶血、脂血樣本于-80 ℃保存，共146例入組。隨機(jī)選取其中126例用于建立15種亞型參考區(qū)間，其余20例用于驗(yàn)證參考區(qū)間。

1.4方法

1.4.1樣本處理 取50 μL樣本，加入120 μL前處理液，漩渦10 min，4 ℃下14 000 r/min離心10 min，吸取上清液100 μL待測(cè)。

1.4.2色譜條件 安捷倫Eclipse XDB-C18(4.6×150 mm,5 μm)色譜柱；柱溫50 ℃；流動(dòng)相A：純凈水，流動(dòng)相B：純甲醇(HPLC級(jí)，含5 mmol/L乙酸銨)；流速：0.85 mL/min,采用梯度洗脫：0.0～0.8 min,65% B，0.8～2.8 min,65%～82% B，2.8～3.2 min,82%～83% B，3.2～5.3 min,83%～85% B，5.3～5.4 min,85% B，5.4～7.5 min,85%～98% B，7.5～9.0 min,65% B。進(jìn)樣量：10 μL。

1.4.3質(zhì)譜條件 電噴霧離子源、負(fù)離子掃描模式、MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式、離子源溫度550 ℃。15種膽汁酸亞型質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)及保留時(shí)間見(jiàn)表2。

表2 15種膽汁酸亞型質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)及保留時(shí)間

1.5性能評(píng)估 參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)C62-A 文件[8]和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的生物分析方法驗(yàn)證導(dǎo)則標(biāo)準(zhǔn)[9]對(duì)建立的LC-MS/MS技術(shù)測(cè)定膽汁酸譜的方法進(jìn)行基本分析性能驗(yàn)證。

1.5.1最低定量限(LLMI)和最低檢出限(LoD) 取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液S1，稀釋至1/4S1、1/8S1，3種濃度重復(fù)測(cè)定10次，分別計(jì)算15種亞型10次測(cè)定結(jié)果的平均值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差(s)、變異系數(shù)(CV)、偏倚(Bias)，以CV<20%，Bias<15%，S/N>20為L(zhǎng)LMI可接受標(biāo)準(zhǔn)，以CV<20%，Bias<15%，S/N>3為L(zhǎng)oD可接受標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.5.2線性評(píng)價(jià) 將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液S6濃度作為高值(H)，S2濃度作為低值(L)，按照4H、3H+L、2H+2L、3L+H、4L配制成5種不同濃度的溶液，每種濃度重復(fù)檢測(cè)5次，計(jì)算均值、CV、與理論值的Bias，CV<15%、Bias<15%，計(jì)算出回歸方程，且r2>0.99,即可判為線性[8]。

1.5.3準(zhǔn)確度評(píng)價(jià) 健康人混合血漿混勻后取3份，每份1 mL，分別添加不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)品S1溶液(10、30、100 μL)，檢測(cè)樣本中15種膽汁酸亞型濃度，每份樣本重復(fù)檢測(cè)5次取均值，計(jì)算加標(biāo)回收率，并與理論值進(jìn)行比較，計(jì)算Bias。Bias<15%，且加標(biāo)回收率需滿足80%～120%，即判斷為可接受[8]。

1.5.4精密度評(píng)價(jià) 批內(nèi)精密度：健康人混合血漿混勻后取3份，每份1 mL，分別添加相同體積不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(S2、S4、S6)，制成低值、中值、高值樣本，檢測(cè)3份樣本中15種膽汁酸亞型水平，每份樣本重復(fù)檢測(cè)20次取均值，計(jì)算s和CV，CV<15%即判斷為可接受。批間精密度：將上述加標(biāo)處理后的3份血漿分別用EP管分裝，-20 ℃冰凍保存，使用前37 ℃快速?gòu)?fù)融，使用相同批號(hào)的試劑每天測(cè)定4次，連續(xù)5 d，計(jì)算s和CV，CV<15%即判斷為可接受。

1.5.5攜帶污染情況 采用混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液S3、S5、S7依次進(jìn)樣后，用甲醇作為空白樣本進(jìn)樣，測(cè)定空白的峰面積響應(yīng)，連續(xù)反復(fù)5次，以每次測(cè)得的峰面積響應(yīng)值小于LoD響應(yīng)值的25%為通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.6本地區(qū)正常孕婦膽汁酸譜參考區(qū)間的建立和驗(yàn)證 根據(jù)CLSI EP28-A3c[9]文件推薦的方法和程序，采用Dixon法剔除離群值后，最終入組126例，擬建立適合于南京地區(qū)表觀健康孕中期孕婦膽汁酸譜各組分參考區(qū)間。根據(jù)小樣本驗(yàn)證法[10]，選擇剩余20例參考個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)，將結(jié)果與待驗(yàn)證的參考區(qū)間進(jìn)行比較，若超出參考區(qū)間的數(shù)據(jù)不超過(guò)2例，則通過(guò)驗(yàn)證；如超過(guò)2例，則另選擇20例合格參考個(gè)體重復(fù)以上驗(yàn)證過(guò)程。

2 結(jié) 果

2.1LLMI和LoD 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為混合標(biāo)準(zhǔn)品濃度S1時(shí)，重復(fù)檢測(cè)10次，滿足每種亞型CV均<15%,且S<10%，信噪比>20∶1，各種亞型的LLMI為混合標(biāo)準(zhǔn)品曲線中S1的濃度。而濃度在1/4 S1時(shí)，信噪比滿足>3∶1，CV和s滿足LoD的要求，但不能滿足LLMI的要求，故1/4 S1濃度為該膽汁酸譜檢測(cè)方法的LoD。

2.2線性范圍 通過(guò)7種不同的濃度點(diǎn)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。以質(zhì)量濃度(ng/mL) 為X軸，各膽汁酸扣除空白后的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為Y軸,進(jìn)行線性回歸分析,得到15種膽汁酸的線性回歸方程和回歸系數(shù)。15種膽汁酸在儀器檢測(cè)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性范圍滿足臨床檢測(cè)需求，r2為0.993～0.999，均大于0.990,符合線性范圍驗(yàn)證的要求。見(jiàn)表3。

表3 15種膽汁酸亞型擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)線性范圍

2.3準(zhǔn)確度及精密度 加標(biāo)后測(cè)定3種濃度(低、中、高)的血清樣本15種膽汁酸亞型的平均加標(biāo)回收率均滿足80%～120%，且Bias<15%，符合準(zhǔn)確度評(píng)估要求；3種濃度的血清樣本15種亞型批內(nèi)精密度和批間精密度的最大CV分別為13.26%和11.38%，均小于15%，滿足精密度評(píng)估要求。見(jiàn)表4。

表4 準(zhǔn)確度及精密度(%)

續(xù)表4 準(zhǔn)確度及精密度(%)

2.4攜帶污染率 15種膽汁酸亞型5次高值進(jìn)樣后的空白殘留最大峰面積響應(yīng)值為7 000，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于最低定量檢出限響應(yīng)值的25%(16 000)，因此可認(rèn)為該法不存在明顯的攜帶污染。

表5 健康孕婦孕中期15種膽汁酸亞型生物參考區(qū)間

3 討 論

近年來(lái)，膽汁酸各種亞型作為信號(hào)分子在孕期能量代謝中發(fā)揮的作用，成為代謝研究的熱點(diǎn)[11-13]。本研究基于LC-MS/MS技術(shù)建立一種簡(jiǎn)單、快速測(cè)定膽汁酸譜的方法。用膽汁酸各種亞型標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)應(yīng)氘代物建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以達(dá)到精準(zhǔn)定量的目的。LC-MS/MS技術(shù)靈敏度高、特異性好，近年來(lái)已被用于總膽汁酸譜的臨床檢測(cè)。與之前報(bào)道的方法比較，LC-MS/MS技術(shù)在樣本前處理上使用了成本低廉的甲醇，且將蛋白沉淀渦旋后的離心時(shí)間延長(zhǎng)為4 ℃下10 min，最大程度去除雜質(zhì)。在保證檢測(cè)靈敏度的前提下，摒除了氮吹復(fù)融步驟，以減少操作誤差。為保證檢測(cè)體系的弱堿性，避免酸性物質(zhì)的離子抑制作用，在流動(dòng)相B中添加了5 mmol/L乙酸銨。由于15種膽汁酸各種亞型在水中的溶解度差異較大，并存在3組同分異構(gòu)體，故對(duì)其梯度進(jìn)行優(yōu)化，降低了初始流動(dòng)相中水相的比例，每一種同分異構(gòu)體亞型都呈現(xiàn)出較好的分離效果。每份樣本15種膽汁酸亞型的檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)僅為9 min，極大提升了檢測(cè)效率。

鑒于長(zhǎng)江中下游地區(qū)為孕期ICP高發(fā)地區(qū)[14]，南京市婦幼保健院為婦產(chǎn)科專科醫(yī)院，患者以孕產(chǎn)婦為主，不應(yīng)直接套用健康人群參考區(qū)間。本研究建立了適合于本地區(qū)孕中期孕婦膽汁酸譜參考區(qū)間并通過(guò)驗(yàn)證，有利于孕期不同肝膽疾病的鑒別診斷，指導(dǎo)臨床及時(shí)有效地對(duì)孕期肝膽疾病進(jìn)行干預(yù)。

本研究具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，基于質(zhì)譜技術(shù)建立的方法可以精準(zhǔn)、快速地定量檢測(cè)膽汁酸譜，同時(shí)檢測(cè)膽汁酸譜中的15種亞型，有利于肝膽疾病的鑒別診斷。本研究建立了適合于本地區(qū)孕婦膽汁酸譜的參考區(qū)間，利用膽汁酸譜檢測(cè)結(jié)果可指導(dǎo)孕期肝膽疾病的診療。