黃昌志，許學(xué)忠，劉小菁

1.海南省萬(wàn)寧市人民醫(yī)院急診內(nèi)分泌科，海南萬(wàn)寧572000；2.海南省萬(wàn)寧市婦幼保健院藥劑科，海南萬(wàn)寧571500

2型糖尿病(T2DM)是冠心病(CAD)的高風(fēng)險(xiǎn)因素之一[1]。微小RNA(miRNA)已經(jīng)成為多種疾病預(yù)測(cè)或診斷中最具潛力的生物學(xué)分子[2]。CHEN等[3]研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a能夠通過(guò)靶向抑制過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)表達(dá)促進(jìn)胰島素抵抗并影響糖脂代謝。PPAR-γ屬于一類(lèi)配體激活轉(zhuǎn)錄因子，在控制糖脂代謝過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。目前，已知PPAR-γ與多種代謝性疾病有關(guān)，如高脂血癥、糖尿病和CAD[5]。為了明確miR-27a在預(yù)測(cè)CAD合并T2DM方面的作用，本研究分析了CAD、T2DM及CAD合并T2DM患者中循環(huán)miR-27a及其靶點(diǎn)PPAR-γ的表達(dá)差異。

1 資料與方法

1.1一般資料 經(jīng)萬(wàn)寧市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并提供書(shū)面知情同意書(shū)。選取萬(wàn)寧市人民醫(yī)院2018年12月至2019年12月的147例受試者作為研究對(duì)象，男89例，女58例，年齡37～82歲，平均(54.39±12.95)歲。男選取36例健康人群作為對(duì)照組，空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血生化指標(biāo)均正常；既往無(wú)T2DM、高血壓、CAD或其他心血管疾病史，入組前3個(gè)月未因任何慢性疾病服用藥物。選取38例單純T2DM患者作為T(mén)2DM組，根據(jù)美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)指南[7]，患者HbA1c水平≥6.5%，無(wú)其他糖尿病并發(fā)癥，且排除不穩(wěn)定型心絞痛患者、無(wú)創(chuàng)心功能檢查陽(yáng)性、腦血管疾病、冠狀動(dòng)脈疾病、外周動(dòng)脈疾病、急性冠狀動(dòng)脈綜合征者。選取36例單純CAD患者作為CAD組，根據(jù)陽(yáng)性病史(心肌梗死、心絞痛和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù))和/或常規(guī)12導(dǎo)聯(lián)心電圖上的缺血性變化(包括ST段壓低或Q波改變)和/或血管造影結(jié)果(至少有1根冠狀動(dòng)脈狹窄>70%)診斷。選取37例CAD合并T2DM患者作為CAD-T2DM組，診斷為CAD，且患者HbA1c水平≥6.5%，具有T2DM病史。除上述以外，所有研究對(duì)象還需排除1型糖尿病、腦卒中、心肌梗死、惡性腫瘤、肝腎功能障礙、慢性炎癥、自身免疫性疾病。

1.2方法

1.2.1人體測(cè)量學(xué)和生物化學(xué)測(cè)量 采用標(biāo)準(zhǔn)公式[體質(zhì)量(kg)/身高2(m2)]計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)。此外，使用標(biāo)準(zhǔn)血壓計(jì)測(cè)量研究對(duì)象休息15 min后的收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)。禁食8 h以上收集所有研究對(duì)象的靜脈血，檢測(cè)FBG、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和肌酐(Cr)。另外采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定空腹胰島素(Fins)水平。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)的計(jì)算公式如下：HOMA-Ir=[FBG(mg/dL)]×[Fins(μU/mL)]/405。

1.2.2采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清miR-27a表達(dá)水平 抽取靜脈血10 mL，使用750 μL TRIzol?LS試劑(美國(guó)Invitrogen公司)從250 μL血清中提取循環(huán)RNA，并用35 μL預(yù)熱(65 ℃)洗脫液進(jìn)行洗脫。血清與三唑醇混合后，加入10 μL秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)miR-39(0.05 μmol/L，由中國(guó)上海基因公司合成)。使用NanoDrop 1000(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行RNA定量。用Taqman MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。qPCR在20 μL體積反應(yīng)中進(jìn)行，并用Bio Rad IQ5熱循環(huán)儀(美國(guó)Bio Rad Laboratories公司)進(jìn)行熱循環(huán)處理：94 ℃ 1 min，然后94 ℃ 15 s+60 ℃30 s循環(huán)40次。使用2-ΔΔCq方法計(jì)算miR-27a相對(duì)于其內(nèi)參的表達(dá)水平。引物序列如下：miR-27a正向?yàn)?′-GCG GAA CTT AGC CAC TGT GA-3′；反向?yàn)?′-TGA GGA GCA GGG CTT AGC TG-3′。

1.2.3血清PPAR-γ水平檢測(cè) 根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)，采用人PPAR-γ ELISA試劑盒(美國(guó)Protein Tech公司)檢測(cè)血清PPAR-γ水平，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A值)。根據(jù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)濃度A值曲線(xiàn)計(jì)算血清樣本中PPAR-γ水平(pg/mL)。

1.2.4雙熒光素酶報(bào)告基因分析 經(jīng)在線(xiàn)軟件TargetScan Human7.2預(yù)測(cè)血清miR-27a及靶基因PPAR-γ的結(jié)合位點(diǎn)，采用Genecreate設(shè)計(jì)并構(gòu)建報(bào)告基因 pmirGLO-PPARγ-3′UTR-WT、pmirGLO-PPARγ-3′UTR-MUT。熒光素酶試驗(yàn)是采用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)(美國(guó)Promega公司)，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明執(zhí)行。HEK293T細(xì)胞分別與miR-27a、 miR-NC、 ppmirGLO-PPARγ-3′UTR-WT、pmirGLO-PPARγ-3′UTR-MUT共轉(zhuǎn)染36 h。將細(xì)胞溶解并測(cè)量熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.14組研究對(duì)象一般資料及生化指標(biāo)水平比較 與對(duì)照組比較，CAD-T2DM組患者SBP、HbA1c、FBG、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C水平均明顯升高，HDL-C水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4組其他一般資料和生化指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組研究對(duì)象一般資料及生化指標(biāo)水平比較

組別nDBP(mm Hg)HbA1c(%)FBG(mg/dL)HOMA-IRTG(mmol/L)TC(mmol/L)對(duì)照組3678.44±5.605.42±0.4397.0(88.0,107.0)0.95±0.561.48±0.393.95±0.82T2DM組3881.61±8.957.95±1.03*189.0(156.0,239.2)*2.85±1.04*1.60±0.654.81±1.72*CAD組3682.36±11.275.54±0.35#97.5(82.7,109.5)#0.96±0.47#1.85±0.73*4.96±1.26*CAD-T2DM組3782.68±12.398.53±0.89*#△198.2(153.5,257.8)*△3.38±1.25*△2.34±1.01*#△5.74±1.63*#F/χ2/H1.389173.40847.25673.01210.0959.879P0.249<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與T2DM組比較，#P<0.05；與CAD組比較，△P<0.05。

2.24組研究對(duì)象血清miR-27a、PPAR-γ水平比較 與對(duì)照組比較，T2DM組、CAD組、CAD-T2DM組患者血清miR-27a表達(dá)水平降低，血清PPAR-γ水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與T2DM組、CAD組比較，CAD-T2DM組患者血清miR-27a表達(dá)水平進(jìn)一步降低，血清PPAR-γ水平則進(jìn)一步升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組血清miR-27a、PPAR-γ水平比較

2.3多因素Logistic回歸分析血清miR-27a與健康人群T2DM、CAD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及T2DM患者CAD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性 分別以健康人群是否發(fā)生T2DM(賦值1=T2DM，0=對(duì)照組)、健康人群是否發(fā)生CAD(賦值1=CAD，0=對(duì)照組)、T2DM患者是否發(fā)生CAD(賦值1=CAD-T2DM，0=T2DM)作為因變量，校正各種混雜因素后，經(jīng)多元線(xiàn)性回歸模型分析，血清miR-27a低表達(dá)水平可增加健康人群發(fā)生T2DM、CAD的風(fēng)險(xiǎn)或T2DM發(fā)生CAD的風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.870、0.912、0.738，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 單因素和多因素Logistic回歸分析血清miR-27a與及健康人群T2DM、CAD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及T2DM患者CAD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

2.4血清miR-27a表達(dá)水平對(duì)T2DM、CAD、CAD-T2DM的輔助診斷價(jià)值 經(jīng)ROC曲線(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-27a輔助診斷健康人群發(fā)生T2DM、CAD及T2DM發(fā)生CAD的AUC分別為0.755(95%CI：0.646～0.864，P<0.05)、0.759(95%CI：0.646～0.872，P<0.05)、0.850(95%CI：0.766～0.934，P<0.05)，cut off值分別為0.835、0.870、0.555，靈敏度分別為94.4%、88.9%、84.2%，特異度分別為44.7%、52.8%、70.3%。見(jiàn)圖1。

圖1 血清miR-27a用于輔助診斷T2DM、CAD、CAD-T2DM的ROC曲線(xiàn)

2.5血清miR-27a和PPAR-γ靶向調(diào)控關(guān)系 經(jīng)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)分析，miR-27a存在與PPAR-γ mRNA相結(jié)合的互補(bǔ)序列。經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因分析，miR-27a mimics和PPARγ-3′UTR-WT共轉(zhuǎn)染后，可降低熒光素酶活性(P<0.05)，但是與PPARγ-3′UTR-MUT共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

注：與miR-NC比較，*P<0.05。

2.6CAD-T2DM組患者血清miR-27a和PPAR-γ水平的關(guān)系 經(jīng)Pearson分析發(fā)現(xiàn)，CAD-T2DM組患者miR-27a表達(dá)水平與血液PPAR-γ水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.808，P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 CAD-T2DM組患者血清miR-27a和PPAR-γ水平的關(guān)系

3 討 論

CAD是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命的心血管疾病，多發(fā)于40歲以上人群，受高血壓、高血脂和T2DM等多種因素影響[6]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)CAD患者合并 T2DM呈逐年升高趨勢(shì)[7]。與單純T2DM或單純CAD患者比較，CAD-T2DM患者病情更加嚴(yán)重，且會(huì)出現(xiàn)彌漫性改變征象，因而具有較高的病死率和致殘率。及時(shí)采取有效的治療和控制措施，對(duì)CAD-T2DM患者有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組、T2DM組和CAD組比較，CAD-T2DM組患者血清miR-27a表達(dá)水平明顯降低，而且經(jīng)單因素和多因素Logistic回歸分析顯示，血清miR-27a低表達(dá)水平是增加健康人群發(fā)生T2DM、CAD及T2DM發(fā)生CAD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在ROC曲線(xiàn)分析中，血清miR-27a可以用來(lái)分析健康人群與CAD患者或T2DM患者及T2DM患者與CAD-T2DM患者之間的區(qū)別。經(jīng)Pearson相關(guān)分析顯示，CAD-T2DM組患者血清miR-27a和PPAR-γ水平呈負(fù)相關(guān)。生物信息學(xué)和熒光素酶報(bào)告基因證明，miR-27a可以直接靶向PPAR-γ基因的3′UTR并介導(dǎo)其相關(guān)轉(zhuǎn)錄。上述研究數(shù)據(jù)表明，miR-27a與T2DM和CAD的發(fā)生均有關(guān)，可能是兩種疾病的共病機(jī)制之一，而且miR-27a與PPAR-γ基因存在靶向調(diào)控關(guān)系，miR-27a低表達(dá)可能是引起PPAR-γ表達(dá)上調(diào)的重要原因。

CAD合并T2DM的發(fā)生是環(huán)境與多種基因聯(lián)合作用進(jìn)而影響相關(guān)通路活性改變的復(fù)雜疾病[8]。PPAR-γ基因位于3號(hào)染色體，其編碼的PPAR-γ是核激素受體家族成員之一，主要在脂肪組織、造血細(xì)胞和大腸中表達(dá)。PPAR-γ控制著大量基因的表達(dá)，這些基因涉及代謝穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)、葡萄糖和能量代謝、脂肪形成和炎癥等[9]。有研究證實(shí)，PPARs調(diào)節(jié)大量代謝通路，與代謝綜合征、T2DM、非酒精性脂肪肝和心血管疾病等代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[10]。例如PPAR-γ可通過(guò)減少基質(zhì)金屬肽酶9的表達(dá)來(lái)降低斑塊的穩(wěn)定性，并通過(guò)刺激氧化低密度脂蛋白的攝入來(lái)促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，這也可能被PPAR-γ依賴(lài)或獨(dú)立的反調(diào)節(jié)機(jī)制所抵消[11]。QIAN等[12]研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ基因外顯子中C161T的多態(tài)性可能會(huì)影響促炎細(xì)胞因子的分泌，并影響對(duì)CAD的易感性。HASAN等[13]研究證實(shí)，埃及人群中PPAR-γ基因rs1801282位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性可以增加T2DM發(fā)生CAD的風(fēng)險(xiǎn)。PPAR-γ可以將脂質(zhì)和糖代謝的改變與CAD的發(fā)展聯(lián)系起來(lái)，尤其是在CAD合并T2DM中。有研究證實(shí)，PPAR-γ在CAD-T2DM患者血清中呈高表達(dá)，而通過(guò)PPAR-γ激動(dòng)劑(如噻唑烷二酮類(lèi))誘導(dǎo)PPAR-γ活化后，導(dǎo)致PPAR-γ構(gòu)象發(fā)生改變，血清PPAR-γ表達(dá)水平下降[14]。目前，很多人工合成的PPAR-γ 激動(dòng)劑，如曲格列酮、吡格列酮、羅格列酮被證實(shí)可以降低T2DM發(fā)生CAD的風(fēng)險(xiǎn)，并且能夠改善CAD-T2DM的預(yù)后，但是其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

miRNA是一種內(nèi)源性非編碼RNA，可以調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄后翻譯過(guò)程，其中miR-27a被證實(shí)與胰島素抵抗及血脂代謝途徑有關(guān)。YU等[15]研究證實(shí)，miR-27a可能參與了糖尿病的病理機(jī)制，如脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、腎纖維化等。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組、CAD組和T2DM組比較，CAD-T2DM組患者血清miR-27a水平明顯下降，這表明與冠狀動(dòng)脈事件的風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，該結(jié)果與之前的基礎(chǔ)研究結(jié)論基本一致。PPAR-γ為單亞基，具有N端區(qū)(A/B區(qū))、居中高度保守的DNA結(jié)合區(qū)(C區(qū))和C端的激素結(jié)合區(qū)(E區(qū))。本研究通過(guò)TargetScan在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，PPAR-γ mRNA可能含有與miR-27a結(jié)合的靶向位點(diǎn)。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析，miR-27a mimics和PPARγ-3′UTR-WT共轉(zhuǎn)染后，可降低熒光素酶活性，說(shuō)明miR-27a可以直接靶向PPARγ-3′UTR并介導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步通過(guò)Pearson相關(guān)分析顯示，在CAD-T2DM患者miR-27a和PPAR-γ之間存在明顯負(fù)相關(guān)，說(shuō)明miR-27a低表達(dá)可能是影響PPAR-γ基因轉(zhuǎn)錄的重要上游機(jī)制之一。另外，ROC曲線(xiàn)分析顯示，血清miR-27a用于輔助診斷T2DM、CAD、CAD-T2DM發(fā)生的靈敏度較高，說(shuō)明血清miR-27a不僅可以作為一項(xiàng)潛在的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)參數(shù)，而且還可以作為1項(xiàng)生物標(biāo)志物來(lái)區(qū)分發(fā)生CAD的T2DM患者和未發(fā)生CAD的T2DM患者。本研究納入的樣本量相對(duì)較小，miR-27a用于鑒別的實(shí)用性還需要進(jìn)一步確認(rèn)。

綜上所述，CAD合并T2DM患者表現(xiàn)為血清miR-27a表達(dá)水平降低，這可能是導(dǎo)致血清PPAR-γ水平升高的重要原因之一。檢測(cè)血清miR-27a表達(dá)水平對(duì)于輔助診斷T2DM并發(fā)CAD有一定臨床價(jià)值，而且miR-27a和PPAR-γ也有望成為未來(lái)預(yù)防或治療CAD合并T2DM的新靶點(diǎn)。