向進(jìn)平,周澤偉,孫 娟

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院大足醫(yī)院/重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科,重慶 402360

胃泌素是一種主要由胃竇中的胃泌素表達(dá)細(xì)胞產(chǎn)生的肽激素，是胃酸輸出的重要生理調(diào)節(jié)因子和胃上皮細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)因子[1]。循環(huán)胃泌素-17(G-17)水平升高常見于萎縮性胃炎引起的高胃泌素血癥患者，多與幽門螺桿菌(Hp)持續(xù)感染及相關(guān)慢性炎性反應(yīng)有關(guān)[2]，易增加胃腺癌和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。既往有研究證實(shí)，胃泌素在胃癌組織中呈高表達(dá)，并且與胃癌晚期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)[4]。然而，胃泌素影響胃癌發(fā)生的潛在分子途徑及其調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。眾所周知，微小RNA(miRNAs)控制著大部分基因組的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，而且具有組織特異性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等特點(diǎn)，是癌癥診斷、治療和預(yù)后評(píng)估方面最具潛力的生物標(biāo)志物之一[5]。本研究采用Target Scan預(yù)測胃泌素可能是miR-30a的候選靶基因之一，基于這一推斷，本研究納入68例胃癌患者，通過檢測循環(huán)血清和胃癌組織標(biāo)本中miR-30a相對(duì)表達(dá)量，分析與胃泌素、患者臨床病理特征的相關(guān)性，為尋找胃癌治療的新靶點(diǎn)提供一定的循證數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院大足醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲得所有研究對(duì)象知情同意后，采集血液標(biāo)本和組織標(biāo)本用于研究。選取2018年3月至2019年12月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院大足醫(yī)院68例胃癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)為胃腺癌；(2)未接受任何形式的化療、放療或靶向治療等術(shù)前治療；(3)接受根治性或非根治性胃癌切除+淋巴結(jié)清掃手術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他同期或既往惡性腫瘤者；(2)被診斷為全身炎癥性疾病、肝硬化或慢性肝衰竭，或腎功能異常者。共收集連續(xù)的有完整臨床資料和腫瘤組織的68例胃癌患者，男45例，女23例，年齡33～75歲，平均(57.56±11.57)歲?；诿绹┌Y聯(lián)合委員會(huì)和國際抗癌聯(lián)盟分期系統(tǒng)進(jìn)行TNM分期[6]。另選取30例健康者(年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史等與胃癌患者相匹配)血樣作為對(duì)照組，所有血常規(guī)和血生化指標(biāo)均正常。

1.2標(biāo)本采集和處理 胃癌患者在手術(shù)前使用靜脈穿刺法采集5 mL血樣，對(duì)照組人群使用體檢時(shí)采集的血樣。室溫下凝血后，1 500 r/min離心15 min，收集上清液，置于-20 ℃冷凍待檢。對(duì)于胃癌患者，在手術(shù)過程中獲得新鮮組織標(biāo)本后，立即置于液氮中保存，隨后置于-80 ℃長期保存，直至用于RNA提取。使用前調(diào)取病理組織切片，由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院大足醫(yī)院病理科醫(yī)師采用盲法復(fù)閱，確定為原發(fā)性胃腺癌組織，且癌旁正常組織無癌細(xì)胞浸潤。胃癌患者的基線評(píng)估包括詳細(xì)病史和體格檢查，以及血清腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA)19-9、CA125、G-17水平檢測。CEA、CA19-9和CA125的臨界值分別為5 ng/mL、39 U/mL、35 U/mL。

1.3血清和胃癌組織RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測miR-30a相對(duì)表達(dá)量 采用miRCURYTM RNA分離試劑盒(丹麥Exiqon公司)從200 μL血清/50 mg胃癌組織勻漿中分離出包括miRNA在內(nèi)的總RNA。采用miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR Kit(丹麥Exiqon公司)對(duì)200 ng RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min)得到cDNA。使用1 μL cDNA模板配制PCR反應(yīng)體系，在iQ5光學(xué)實(shí)時(shí)PCR儀(美國Bio-Rad公司)上完成PCR：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s+60 ℃ 1 min+72 ℃ 30 s，40次循環(huán)。小分子U6被用作胃癌組織和血清標(biāo)本數(shù)據(jù)正?；膬?nèi)源性控制。用2-ΔΔCt法測定胃癌組織與癌旁正常組織、血清標(biāo)本中miR-30a相對(duì)表達(dá)量。miR-30a：正向5′-GCA GCT GCA AAC ATC CGA C-3′和反向5′-GCG ACT GTA AAC ATC CTC GAC T-3′；U6：正向5′-GAG ACG GGA ACG ACA AAC CT-3′和反向5′-TGG ACG AAG AGG ATT CGC TG-3′。

1.4生物信息學(xué)分析 采用GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,http://gepia.cancer-pku.cn)數(shù)據(jù)庫和OncomiR數(shù)據(jù)庫(http://www.oncomir.org)分析胃泌素基因(GAST)和miR-30a在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)量，并繪制Kaplan-Meier生存曲線。

1.5雙熒光素酶報(bào)告基因分析 采用GAST-3′UTR野生型或突變型和miR-30a模擬物的pLMP載體共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后取細(xì)胞進(jìn)行裂解。用雙熒光素酶報(bào)告者檢測系統(tǒng)(美國Promega公司)在轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行報(bào)告者檢測，并用共轉(zhuǎn)染的腎素?zé)晒馑孛笇?duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。所有試驗(yàn)至少進(jìn)行3次。

2 結(jié) 果

2.1生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析GAST和miR-30a在胃癌組織中的表達(dá)量及與預(yù)后的關(guān)系 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示，胃癌組織GAST表達(dá)量較癌旁正常組織升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；OncomiR數(shù)據(jù)庫分析顯示，胃癌組織中miR-30a表達(dá)量低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Pearson相關(guān)分析顯示，GAST與miR-30a表達(dá)量呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.520，P<0.05)。采用上述數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析GAST和miR-30a在胃癌組織中的表達(dá)量與生存期的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高低GAST或miR-30a表達(dá)量患者的生存預(yù)后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

注：A為GEPIA數(shù)據(jù)庫或OncomiR數(shù)據(jù)庫分析GAST和miR-30a在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)差異及相關(guān)性，T為胃癌組織，N為癌旁正常組織；B為胃癌組織中GAST和miR-30a不同表達(dá)量患者的生存曲線。

2.2雙熒光素酶報(bào)告基因分析 基于Target Scan預(yù)測，miR-30a(358～364 nt)含有與GAST(60～66 nt)靶向結(jié)合的互補(bǔ)序列。雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示，miR-30a mimics和GAST-3′UTR-WT共轉(zhuǎn)染，熒光素酶相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。見圖2。

注：與NC mimics比較，*P<0.05。

2.3胃癌患者血清和胃癌組織中miR-30a相對(duì)表達(dá)量 經(jīng)qRT-PCR檢測，與健康者血樣比較，胃癌患者血清miR-30a相對(duì)表達(dá)量明顯降低[(0.688±0.279)vs.(1.000±0.200)，t=5.524，P<0.05]；與癌旁正常組織比較，胃癌組織中miR-30a相對(duì)表達(dá)量明顯降低[(0.348±0.244)vs.(1.000±0.175)，t=13.211，P<0.05]。胃癌患者血清和胃癌組織中miR-30a相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.376，P=0.002)。見圖3。

圖3 胃癌患者血清和胃癌組織中miR-30a相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系

2.4胃癌患者血清和胃癌組織中miR-30a相對(duì)表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系 胃癌患者血清和胃癌組織中miR-30a相對(duì)表達(dá)量與腫瘤最大徑、TNM分期、血清CEA、CA19-9、CA125水平及Hp感染均有關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 胃癌患者血清和胃癌組織中miR-30a相對(duì)表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表1 胃癌患者血清和胃癌組織中miR-30a相對(duì)表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系

2.5胃癌患者血清miR-30a相對(duì)表達(dá)量與血清G-17水平的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示，胃癌患者血清miR-30a相對(duì)表達(dá)量與血清G-17水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.729，P<0.05)。見圖4。

圖4 胃癌患者血清miR-30a相對(duì)表達(dá)量與血清G-17水平的相關(guān)性

3 討 論

miRNAs作為一類內(nèi)源性非蛋白編碼的小分子RNA，大約30%的人類基因組具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，其依賴于互補(bǔ)的RNA-RNA結(jié)合抑制翻譯、增加切割或誘導(dǎo)靶基因的降解等。由于miRNAs控制著基因組的很大一部分，它們的表達(dá)模式具有組織特異性，并且在許多惡性腫瘤中呈表達(dá)失調(diào)狀態(tài)，因此，miRNAs有可能成為癌癥診斷和治療的重要靶點(diǎn)。

在既往研究中，LI等[7]構(gòu)建了差異miRNAs/mRNA表達(dá)譜，并鑒定了12種基因因其網(wǎng)絡(luò)化程度高而被認(rèn)為是中心基因，包括miR-29c、miR-30a、miR-335、miR-101等，其中miR-30a可能在hub基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本研究首先通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫檢索及qRT-PCR對(duì)68例胃癌患者血清標(biāo)本、組織標(biāo)本進(jìn)行檢測，證實(shí)胃癌患者血清中miR-30a相對(duì)表達(dá)量低于健康對(duì)照者，同時(shí)，胃癌組織中miR-30a的相對(duì)表達(dá)量亦低于癌旁正常組織，說明miR-30a在胃癌的發(fā)生過程中屬于功能性基因。通過分析血清和胃癌組織中miR-30a相對(duì)表達(dá)量與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系，證實(shí)腫瘤最大徑>5.0 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、血清腫瘤標(biāo)志物異常升高者血清和胃癌組織中miR-30a相對(duì)表達(dá)量明顯降低，說明miR-30a在胃癌進(jìn)展中扮演著抑癌基因的角色。miR-30a是許多類型癌癥中最有潛力的抑癌基因之一，它可以通過不同的靶基因抑制癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲。YU等[8]的研究證實(shí)，上調(diào)miR-30a表達(dá)可以靶向抑制成纖維細(xì)胞活化蛋白a活化，進(jìn)而抑制胃癌轉(zhuǎn)移。LIU等[9]研究證實(shí)，miR-30a-5p通過直接靶向胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)抑制胃癌細(xì)胞AGS、HGC27、BGC823、SGC7901等的生長和轉(zhuǎn)移。因此，miR-30a-5p/IGF-1R軸可能是胃癌治療的潛在靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者有Hp感染者血清和胃癌組織miR-30a相對(duì)表達(dá)量低于無Hp感染者。LIU等[10]通過體內(nèi)試驗(yàn)構(gòu)建miR-30a基因敲除小鼠模型，與Hp感染的野生型小鼠比較，Hp感染的miR-30a基因敲除小鼠表現(xiàn)出慢性胃炎、慢性萎縮性胃炎、非典型增生及其他癌前病變或腺癌表現(xiàn)的發(fā)病率明顯增加，并通過影響癌基因的表達(dá)促進(jìn)腫瘤發(fā)展。上述結(jié)果說明，miR-30a對(duì)于Hp感染者胃癌細(xì)胞的生長有一定的抑制作用。Hp持續(xù)感染和相關(guān)慢性炎癥引起的慢性胃萎縮與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，而胃腺萎縮可以促進(jìn)胃泌素大量分泌。MURPHY等[11]通過幾十年的隨訪數(shù)據(jù)證實(shí)，高胃泌素血癥患者人群胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)大大增加。因此，眾多學(xué)者普遍認(rèn)為胃泌素是一種致癌生長因子，在結(jié)直腸[12]、胃[13]、肝臟[14]等器官的癌癥進(jìn)展中起重要作用。陳遠(yuǎn)等[15]研究證實(shí)，血清G-17在胃癌患者中呈高表達(dá)，并且與胃癌晚期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)；GAST基因的異常表達(dá)受轉(zhuǎn)錄后水平環(huán)境因素的影響，如Hp感染。

本研究為了進(jìn)一步明確miR-30a在胃癌發(fā)生中的作用，首先通過Target Scan生物學(xué)軟件預(yù)測miR-30a存在與GAST mRNA靶向結(jié)合的互補(bǔ)序列，并且通過熒光素酶報(bào)告基因分析證實(shí)，以GAST編碼序列為靶點(diǎn)的miR-30a可以有效地沉默GAST的表達(dá)。因此，本研究推斷胃泌素在胃癌患者血清中的過度表達(dá)可能與miR-30a表達(dá)下調(diào)有關(guān)。通過分析胃癌患者血清miR-30a相對(duì)表達(dá)量與G-17水平的關(guān)系，證實(shí)二者存在明顯負(fù)相關(guān)。根據(jù)上述結(jié)果推斷，針對(duì)miR-30a/胃泌素研發(fā)新的靶向治療藥物可能適合于Hp感染引起的胃腺癌的治療。

綜上所述，胃癌患者血清和胃癌組織中miR-30a相對(duì)表達(dá)量普遍降低，而且與腫瘤最大徑、TNM分期、血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物水平及Hp感染均有關(guān)；此外，GAST是miR-30a的潛在靶基因。因此，miR-30a表達(dá)下調(diào)可能是胃泌素促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長和遷移的重要原因，為針對(duì)miR-30a/胃泌素研發(fā)靶向治療胃癌的新型藥物提供了新的思路。