武梓萌 羅毅灃 張劍鋒

(廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科，南寧市 530007，電子郵箱：18245280117@126.com)

研究表明，百草枯可促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，誘導(dǎo)細胞凋亡[1]。百草枯進入機體后會迅速分布在許多重要器官中，其中肺臟是主要靶器官之一，中毒患者早期即可出現(xiàn)急性肺損傷(acute lung injury，ALI)[2]，其主要病理機制可能是肺組織炎癥和(或)細胞凋亡[3]，但具體分子機制尚未闡明。本研究擬建立百草枯中毒肺損傷大鼠模型，檢測其損傷肺組織細胞凋亡情況，另采用PCR芯片檢測凋亡基因，以了解百草枯中毒導(dǎo)致大鼠肺損傷的可能機制，為臨床防治提供思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康且無特定病原體級SD雌性大鼠18只，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(許可證號：SCXK桂2020-0003)。鼠齡6～8周，體質(zhì)量為(200±20)g，潔凈空調(diào)房間內(nèi)喂養(yǎng)，實驗室溫度為(23±3)℃，濕度為(55.5±10.0)%。大鼠分籠飼養(yǎng)(6只/籠)，給予顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 實驗主要藥品及試劑 二氯百草枯(Sigma-Aldrich公司，批號： 856177-1G)，TUNEL試劑盒(羅氏公司，批號：11684817910)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色液(博士德生物工程有限公司，批號：AR1177)，總RNA 提取試劑RNAiso Plus(TaKaRa公司，批號：9109)，反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa公司，批號：RR036A)，TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司，批號：RR820A)，2×RealStar Green Fast Mixture(with ROX Ⅱ)(GenStar公司，批號：A304-10)。

1.3 建模及分組 將18只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為百草枯組和陰性對照組，各9只。百草枯組SD大鼠給予單劑量的二氯百草枯(20 mg/kg )腹腔注射；陰性對照組SD大鼠給予和百草枯組等量的生理鹽水腹腔注射。在腹腔注射后24 h，用10%水合氯醛(0.03 mL/kg)進行腹腔注射麻醉后，將大鼠固定于大鼠固定板上，剪開胸腔，暴露心肺及大血管，結(jié)扎大血管后使用0.9%氯化鈉沖洗肺血管中殘留的血液。取右上肺用RNA保存液置于-20℃冰箱保存，備用于PCR檢測；取左肺葉置于10%中性甲醛中固定24 h，用于TUNEL染色凋亡檢測。

1.4 凋亡實驗 將甲醛固定24 h后的肺組織常規(guī)脫水、透明、 包埋、 切片、脫蠟后,用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌3次，每次5 min，加脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)檢測液100 μL ，37℃避光孵育60 min，再用PBS洗滌3次，每次5 min，滴加DAPI染色液100 μL，室溫避光孵育20 min，再用PBS洗滌3次，每次5 min，水溶性封片劑封片后熒光顯微鏡下觀察，可看到凋亡細胞核為綠色熒光，DAPI染色細胞核為藍色熒光。根據(jù)以下公式進行凋亡率的計算:凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%,每個樣本隨機計數(shù)5個視野(400倍視野),取均值。

1.5 大鼠細胞凋亡PCR芯片檢測和實時定量PCR驗證 取右肺組織進行研磨，裂解提取RNA，配置RT反應(yīng)液，最終體積為10 μL(5×PrimeScriptTMRT Master Mix 2 μL，Total RNA 2 μL，RNase Free dH2O 6 μL)，輕柔混勻后進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件如下:37℃15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))； 85℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))；4℃(保存)。配置定量PCR反應(yīng)液，最終體積為20 μL，包括TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 2×5 μL，上游引物 0.4 μL，下游引物 0.4 μL，ROX Reference Dye 50× 0.2 μL，DNA Sample 1 μL，ddH2O 13 μL。輕柔混勻后進行定量PCR反應(yīng)，條件如下：95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環(huán)40次。使用大鼠細胞凋亡定量PCR陣列分析基因表達譜(芯片購自上海啟因生物科技有限公司)，具體芯片目的基因信息見表1。用Wcgene Biotech軟件進行數(shù)據(jù)分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)源對照，基于循環(huán)閾值(Ct值)，采用2-ΔCt的方法計算相對表達倍數(shù)(fold值)[4]，并且認為相對表達倍數(shù)比(fold值百草枯組/ fold值陰性對照組)<0.5或>2，且P<0.05的值是有意義的[5]，再將數(shù)據(jù)標準化為log2值。同時對目的基因進行生物信息分析進一步篩選差異表達基因。然后通過ABI7500 qRT-PCR系統(tǒng)(Thermo Scientific公司)對所篩選的3個基因(引物序列見表2)表達水平進行定量分析。配置實時定量PCR反應(yīng)液，最終體積為20 μL，包括2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，RNase Free dH2O 6 μL，DNA Sample 2 μL；設(shè)置程序如下：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)40次。使用2-△△Ct的方法計算選定基因的相對表達水平(fold change，F(xiàn)C)，再將數(shù)據(jù)標準化為log2值，利用選定基因的標準化相對表達水平(Log2FC)對定量PCR陣列分析基因表達譜結(jié)果進行驗證。

表1 目的基因及相對表達倍數(shù)比

表2 引物名稱及引物序列

1.6 生物信息學(xué)分析 使用R軟件(x64 3.5.1)和RStudio軟件，取凋亡PCR芯片中目的基因，利用兩組數(shù)據(jù)的fold值均值制作熱圖，用-lgP值和log2(fold值百草枯組/ fold值陰性對照組)繪制火山圖，以log2(fold值百草枯組/ fold值陰性對照組)<-1或>1，且-lgP值>1.3為標準，篩選差異表達顯著的基因。利用STRING軟件 (http://string.embl.de/cgi/input.pl?User Id=vb IZut BFUXxs&session Id=u98tg B1k Bto L&input_page_show_search=on)和Cytoscape軟件，分析目的基因所編碼蛋白的蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)關(guān)系。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗或t′檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組肺組織TUNEL染色結(jié)果 百草枯組大鼠肺組織中TUNEL陽性細胞比例為 (11.84±0.80) %,高于陰性對照組的(1.07±0.14) %(t=39.783,P<0.001)，見圖1。

圖1 兩組TUNEL染色情況 (×400)

2.2 大鼠凋亡PCR芯片檢測結(jié)果和生物信息學(xué)分析結(jié)果 凋亡PCR芯片共篩選出3個差異表達基因，百草枯中毒大鼠肺組織的TNFSF10、FASLG和TNFRSF1B基因表達降低。凋亡PCR芯片中目的基因熱圖見圖2，通過火山圖(圖3)篩選出TNFSF10、TNFRSF1B、FASLG為差異表達顯著的基因。PPI網(wǎng)絡(luò)顯示了TNFSF10、TNFRSF1B、FASLG和其他凋亡基因的交互關(guān)系，并利用Cytoscape軟件識別最顯著模塊，見圖4。

圖2 凋亡PCR芯片目的基因熱圖

圖3 火山圖

圖4 目的基因所編碼的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3 實時定量PCR驗證結(jié)果 使用實時定量PCR驗證TNFSF10、TNFRSF1B、FASLG的表達情況，結(jié)果也顯示,百草枯組的TNFSF10、TNFRSF1B、FASLG的表達水平均低于陰性對照組(均P<0.05)，見表3。

表3 3個基因的實時定量PCR驗證結(jié)果

3 討 論

壞死性凋亡是細胞程序性死亡的一種類型，與其他細胞程序性死亡相比，壞死性凋亡具有獨特的細胞形態(tài)變化和生化特征[6]。死亡受體配體、干擾素和病毒感染等各種刺激均可引發(fā)壞死性凋亡。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)屬于死亡受體配體家族，可以與膜上的受體結(jié)合，誘導(dǎo)細胞凋亡[7]。已有研究表明，百草枯刺激TNF和白細胞介素6等因子與活性氧形成正反饋回路，使中毒組織持續(xù)損傷凋亡[8]。本研究通過TUNEL實驗證實了百草枯組大鼠的肺組織存在凋亡，通過大鼠細胞凋亡PCR芯片進行測序，并對測序數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析，篩選出3個有意義的差異表達基因，即TNFSF10、FASLG、TNFRSF1B，再對這3個基因進行實時定量PCR驗證，結(jié)果證實PCR芯片與實驗數(shù)據(jù)有一致的趨勢。

TNFSF10又名腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體，屬于TNF超家族。TNFSF10在免疫系統(tǒng)的多種細胞如自然殺傷細胞、T淋巴細胞、自然殺傷T淋巴細胞、巨噬細胞和樹突細胞中表達，并且在病原抵抗、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤監(jiān)視等多個領(lǐng)域都起著重要的作用。TNFSF10通過激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)-3和Caspase-8，誘導(dǎo)受感染細胞短時間內(nèi)發(fā)生凋亡，有效地防御病原體的擴散[9]，因此能有效地增強生物自身的免疫力，但在正常健康細胞中未檢測到其促凋亡活性[7]。在本研究中，百草枯組肺組織中的TNFSF10表達相對陰性對照組下調(diào)，可能是人體自我調(diào)節(jié)對抗百草枯誘導(dǎo)的細胞損害，其下調(diào)可抑制Caspase-3和Caspase-8等相關(guān)凋亡因子表達，從而抑制細胞發(fā)生凋亡。

FASLG及其受體(FAS)屬于TNF家族。FAS是TNF受體超家族的原型成員，介導(dǎo)人體內(nèi)的Caspase家族尤其是Caspase-8前體和Caspase-10前體的募集；募集后進入死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物以其活性形式被加工并激活，觸發(fā)由其他前胱天蛋白酶組成的生化級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞凋亡[10]。但也有部分研究表明，在多種癌癥中均出現(xiàn)FASLG下調(diào)，從而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的凋亡和增殖[11-13]。有研究表明活性氧刺激上皮細胞后，F(xiàn)ASLG的含量及FAS的mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯降低，并出現(xiàn)上皮細胞凋亡[14]。而百草枯可以顯著刺激活性氧的增加，故在本研究中，可能是因百草枯刺激活性氧的表達上調(diào)，導(dǎo)致FASLG的表達降低。

TNFRSF1B是TNF受體超家族的成員[15]，可以激活經(jīng)典的激活轉(zhuǎn)錄因子核因子κB和c-Jun N端激酶信號傳導(dǎo)[16]，導(dǎo)致抗凋亡和促炎反應(yīng)的產(chǎn)生；其下調(diào)意味著抗凋亡減弱，可能間接促進了百草枯組大鼠肺組織細胞凋亡的發(fā)生[17]。

綜上所述，在百草枯中毒導(dǎo)致的大鼠肺組織凋亡的模型中，TNFSF10、TNFRSF1B、FASLG的表達下調(diào)，三者可能在大鼠肺組織凋亡中發(fā)揮重要作用，但其明確的下調(diào)機制仍不明確，有待進一步的實驗研究。