周 政

（湘潭市易俗河鎮(zhèn)農(nóng)技農(nóng)機(jī)畜牧水產(chǎn)推廣服務(wù)中心，湖南 湘潭 411228）

沙門氏菌屬于腸桿菌科成員之一，該病原廣泛存在于自然環(huán)境中，可感染多種動(dòng)物，其中包括豬、禽和反芻動(dòng)物等。此外，人對(duì)該病原也易感，且人類感染該病原后可出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，包括惡心、嘔吐和渾身乏力等，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致敗血癥，甚至威脅生命[1]。截至目前，科研人員發(fā)現(xiàn)沙門氏菌屬有超過(guò)2 600種血清型，但也只有部分血清型沙門氏菌可感染人，如鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌[2-3]。據(jù)報(bào)道，消費(fèi)者發(fā)生食源性細(xì)菌病中毒主要是由沙門氏菌感染引起的，而歐洲消費(fèi)者感染沙門氏菌病部分原因是與食用被該病原污染的豬肉有關(guān)[4]。由于沙門氏菌的感染途徑主要是水平傳播，環(huán)境中存在沙門氏菌對(duì)消費(fèi)者健康也會(huì)造成一定的威脅。

隨著人們對(duì)食品安全越來(lái)越重視，目前國(guó)內(nèi)有研究人員開始關(guān)注屠宰場(chǎng)生豬肉品或環(huán)境中沙門氏菌的污染情況。邱燕等2016年對(duì)貴州部分地區(qū)屠宰場(chǎng)豬肉樣品進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)屠宰場(chǎng)豬肉中沙門氏菌檢出率為14.0%（7/50）[5]；韓依辛等對(duì)廣東省部分地區(qū)屠宰場(chǎng)豬肉樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，498份樣品中有70份為沙門氏菌檢測(cè)陽(yáng)性，檢出率為14.06%[6]。本研究于2020年5—8月從湘潭縣部分生豬屠宰場(chǎng)共采集90份樣品進(jìn)行沙門氏菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，旨在為該病的防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

2020年5—8月從湘潭縣3個(gè)生豬屠宰場(chǎng)共采集90份樣品，其中包括豬肉樣品58份和環(huán)境樣品32份。豬肉樣品主要采集扁桃體、淋巴結(jié)或肺臟等，每份樣品約30 g，標(biāo)記后置于封口袋中；環(huán)境樣品主要是生豬剖殺臺(tái)和豬肉分割臺(tái)，用無(wú)菌棉簽蘸取少量滅菌PBS溶液后，在剖殺臺(tái)或分割臺(tái)表面進(jìn)行來(lái)回涂抹，涂抹面積為25～30 cm2，其后將棉簽置于封口袋中并標(biāo)記。所有樣品低溫運(yùn)輸至湘潭縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，待檢。

1.2 樣品處理及細(xì)菌分離鑒定

取生豬組織樣品（0.8～1 g）與適量PBS溶液混合后進(jìn)行研磨，離心后取50 μL上清液放入SC增菌培養(yǎng)液中進(jìn)行細(xì)菌增殖；環(huán)境樣品所用棉簽與適量PBS混合后，取100 μL上清液置于增菌培養(yǎng)液中培養(yǎng)。其后，采用沙門氏菌檢測(cè)試紙對(duì)以上樣品分別進(jìn)行檢測(cè)。

將試紙條檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定：用接種環(huán)蘸取少量菌液在麥康凱培養(yǎng)基表面劃線，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況；其后挑取疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌株形態(tài)學(xué)特征。

1.3 沙門氏菌16S rRNA基因擴(kuò)增、測(cè)序及分析

將形態(tài)學(xué)鑒定為沙門氏菌的菌株在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中增菌后，取200 μL菌液煮沸以獲得細(xì)菌基因組。以細(xì)菌基因組為模板，通過(guò)PCR法對(duì)細(xì)菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，其體系（50.0 μL）包括：2×PCR mix 25.0 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA模板3.0 μL及雙蒸水20.0 μL；反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5.0 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，獲得測(cè)序結(jié)果后，將序列進(jìn)行拼接，其后在NCBI上將獲得序列進(jìn)行同源性BLAST比對(duì)分析。

1.4 血清型分型及藥敏試驗(yàn)

采用玻片凝集試驗(yàn)及沙門氏菌屬診斷血清的O、H和Vi抗原抗血清反應(yīng)對(duì)本試驗(yàn)獲得的沙門氏菌分離株進(jìn)行血清型鑒定，其判定標(biāo)準(zhǔn)參考Kauffmann-White方案。

嚴(yán)格按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)對(duì)本試驗(yàn)獲得的沙門氏菌菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。以多環(huán)西素、頭孢唑林、林可霉素、克林霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、多黏菌素B、氨芐西林、頭孢拉定、頭孢噻肟和氨曲南作為菌株抗生素敏感型試驗(yàn)抗生素。具體操作過(guò)程為：將以上菌株分別在普通瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)增后，將其稀釋至1×106cfu/mL，取100 μL菌液涂布于培養(yǎng)基表面，待菌液稍干后貼上含有不同抗生素的藥敏紙片，其后將培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。最后用游標(biāo)卡尺衡量不同抗生素紙片的抑菌圈直徑，根據(jù)藥敏紙片產(chǎn)品說(shuō)明書判定菌株對(duì)該抗生素的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 沙門氏菌分離及鑒定

本試驗(yàn)從湘潭縣3個(gè)屠宰場(chǎng)采集環(huán)境或豬肉樣品共90份，對(duì)樣品中細(xì)菌性病原進(jìn)行初步擴(kuò)增后，用沙門氏菌檢測(cè)試紙對(duì)以上樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有9份樣品檢測(cè)為陽(yáng)性，其陽(yáng)性率為10.0%；其后我們對(duì)以上陽(yáng)性樣品進(jìn)行病原分離及革蘭氏染色鑒定，最終可確定9個(gè)樣品分離菌株疑似為沙門氏菌，該菌株在麥康凱培養(yǎng)基表面可形成無(wú)色、表面光滑的圓形菌落，革蘭氏染色可發(fā)現(xiàn)兩端鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌（圖1）。其后，對(duì)以上菌株進(jìn)行擴(kuò)增后，提取DNA基因組，應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)菌株16S rRNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序及分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)獲得的9個(gè)菌株均被鑒定為沙門氏菌。

圖1 沙門氏菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

2.2 湘潭縣屠宰場(chǎng)來(lái)源樣品沙門氏菌污染情況

通過(guò)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明90份被檢樣品中有9份樣品被沙門氏菌污染，平均檢出率為10.0%（9/90）；其中3個(gè)屠宰場(chǎng)被污染樣品數(shù)量分別為1份、5份和3份，其檢出率分別為3.3%（1/30）、16.7%（5/30）和10.0%（3/30）；此外，90份樣品可分為環(huán)境樣品（32份）和豬肉樣品（58份），檢測(cè)為沙門氏菌陽(yáng)性的樣品數(shù)量分別為5份和4份，檢出率分別為15.6%（5/32）和6.9%（4/58），見(jiàn)表1。

表1 湘潭縣屠宰場(chǎng)來(lái)源樣品沙門氏菌污染情況

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

進(jìn)一步的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)分離的9個(gè)沙門氏菌毒株對(duì)不同抗生素敏感性具有一定差異，具體結(jié)果如表2所示，所有沙門氏菌對(duì)多環(huán)西素和頭孢唑林均產(chǎn)生耐藥性，耐藥率為100.0%；對(duì)克林霉素、林可霉素和氨芐西林的耐藥率均超過(guò)50.0%，分別為88.89%、88.89%和77.78%；對(duì)多黏菌素B、氧氟沙星和恩諾沙星等藥物相對(duì)敏感，其耐藥率分別為0、22.22%和11.11%。

表2 分離的沙門氏菌菌株對(duì)不同抗生素藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

盡管目前人們對(duì)食品衛(wèi)生安全問(wèn)題逐漸重視，但生豬在飼養(yǎng)和屠宰等環(huán)節(jié)仍然容易受到病原菌感染或污染，且部分病原菌具有感染人的能力，如大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等，這類致病菌感染（污染）豬（肉）不但可影響豬肉品質(zhì)，還可能對(duì)消費(fèi)者健康造成威脅。沙門氏菌屬于重要的人畜共患性致病菌，且該致病菌在豬場(chǎng)十分常見(jiàn)，但肥育豬感染該病一般不表現(xiàn)臨床癥狀，這導(dǎo)致有些外觀健康的屠宰豬帶菌，消費(fèi)者接觸或食用帶菌肉類后就有可能會(huì)感染該病。方忠意等對(duì)河南地區(qū)部分屠宰場(chǎng)外觀健康屠宰場(chǎng)盲腸組織內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品中沙門氏菌檢出率為5.36%（45/840）[7]；而韓依辛等調(diào)查結(jié)果顯示廣東省部分屠宰生豬沙門氏菌檢出率達(dá)14.06%（70/498）[6]。

為初步調(diào)查屠宰場(chǎng)生豬沙門氏菌污染情況及分離菌對(duì)不同抗生素的耐藥特性，本試驗(yàn)于2020年5—8月從湘潭縣3個(gè)屠宰場(chǎng)采集屠宰豬組織及環(huán)境樣品共90份，用于沙門氏菌分離鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共9份樣品為沙門氏菌陽(yáng)性，平均檢出率為10%，其中豬肉樣品和環(huán)境樣品檢出率分別為6.9%和15.6%，且以上3個(gè)屠宰場(chǎng)中均有沙門氏菌陽(yáng)性樣品，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明湘潭縣生豬屠宰場(chǎng)中豬肉或環(huán)境中存在沙門氏菌污染，且環(huán)境污染更加嚴(yán)重，同時(shí)也提示屠宰場(chǎng)應(yīng)定期對(duì)環(huán)境和屠宰工具等進(jìn)行消毒，防止環(huán)境中致病菌污染豬肉。

進(jìn)一步藥敏試驗(yàn)分析結(jié)果顯示，本試驗(yàn)分離的9個(gè)沙門氏菌分離株對(duì)不同抗生素耐藥性存在差異，其中對(duì)多環(huán)西素、頭孢唑林、林可霉素和克林霉素耐藥率均超過(guò)80%，提示臨床上不能使用以上抗生素用于該地區(qū)豬沙門氏菌病防控；但以上菌株對(duì)氧氟沙星、恩諾沙星和多黏菌素B等耐藥率相對(duì)較低，提示以上抗生素是防控豬沙門氏菌病的首選，但不可長(zhǎng)期使用同種藥物，應(yīng)注意穿梭用藥。