葉 碩，吳方匯，柯秀榮，王曉清，劉夢濤，楊賢燕，張 雷，茍中入，楊國敬

(1.溫州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院暨瑞安市人民醫(yī)院，浙江 瑞安 325200；2.浙江加州國際納米技術(shù)研究院，浙江大學，浙江，杭州 310058)

1 前 言

長期以來，感染性骨缺損因其慢性炎癥長期遷延及局部感染反復出現(xiàn)而導致修復緩慢，一直困擾著骨科臨床[1-2]。目前臨床常規(guī)的骨移植、人工材料填充修復在治療感染性骨缺損方面均存在諸多局限性，尤其是難以在病變修復、感染控制及誘導新骨再生功能需求問題上獲得突破[3]。通常，感染情況下的骨再生修復效率主要取決于植入物對感染的高效控制，以及由植入物釋放活性物質(zhì)、植入物的多孔網(wǎng)絡空間演化推進，使得新骨再生與長效抗感染的協(xié)同[4]。

生物活性陶瓷的活性不僅體現(xiàn)在表面誘導類骨礦物沉積方面，并且降解釋放的多種無機離子在活化成骨相關(guān)細胞響應[5]與感染防控[6-8]發(fā)揮了重要作用。其中，磷灰石陶瓷不僅能傳導骨生長，精確構(gòu)建的特定表面微納結(jié)構(gòu)還能誘導異位成骨[9]，但是該材料在生理環(huán)境中十分穩(wěn)定，降解極為緩慢，難以實現(xiàn)骨缺損高效并完全再生修復[10]。生物活性玻璃雖然顯示出良好的生物降解性，其表面還可以維持細胞粘附、生長。并且降解溶出的無機離子組合物能顯著促進成骨細胞增殖和成骨分化[11-12]，但是其存在易脆、加工成形難等問題。近年來一些含鎂的鈣-硅基生物陶瓷，如透輝石(CaMgSi2O6)、鎂黃長石(Ca2MgSi2O7)，被證實具有良好成骨活性[13]，在模擬體液中能較快地誘導類骨磷灰石礦物沉積，在體內(nèi)與骨組織能形成骨性鍵合[14]。

迄今，生物陶瓷材料修復感染性骨缺損已取得了很大進展，但是人們對該類材料的生物活性效應認知，往往局限于是否有利于改善骨再生效率，對骨骼內(nèi)的感染控制等“邊際需求”重視有限[15-16]，這極大地制約了該類材料在病理環(huán)境下的應用。近年來的一些研究證實，通過摻入一些離子如鋅、銅、鍶、硒、硒等，能夠改善生物陶瓷材料的降解性或生物活性，并且在促進骨再生方面起到一定的改善作用。更為重要的是，某些無機離子在抗感染、控制炎癥與抗腫瘤活性等方面顯示出獨特生物學效益。譬如，中澳兩國學者的合作研究發(fā)現(xiàn)，銅摻雜介孔生物活性玻璃可以促進血管化效應，并產(chǎn)生良好的抗菌性[17]；同時銅摻雜生物活性陶瓷或修飾人工關(guān)節(jié)涂層，能高效控制感染和抑菌[18]。

據(jù)此，此次實驗擬利用自主設(shè)計的同軸雙噴頭微球制備系統(tǒng)，通過具有高效抗感染活性的銅元素低劑量選擇性摻雜，構(gòu)建組分分布可調(diào)、內(nèi)部微孔和降解速率可控的核-殼結(jié)構(gòu)型多孔性生物活性陶瓷微球，以期實現(xiàn)該類微球材料抗菌活性成分的可控緩釋，從而構(gòu)建有利于感染性骨缺損高效修復的新型活性材料。

2 實 驗

課題組自行設(shè)計的生物陶瓷微球制備系統(tǒng)(圖1)，具有同軸核-殼結(jié)構(gòu)雙層噴頭和微流控系統(tǒng)，可以同步實現(xiàn)不同層的組成成分分布的自主調(diào)節(jié)以及微觀結(jié)構(gòu)的精確剪裁，以期獲得生物陶瓷微球的無機離子釋放劑量水平和顆粒尺度階段性可調(diào)控功能。

圖1 A: 同軸核-殼結(jié)構(gòu)雙層噴頭結(jié)構(gòu)示意圖；B：核-殼結(jié)構(gòu)多孔性生物活性陶瓷微球示意圖；C: 核-殼結(jié)構(gòu)生物陶瓷微球的制備流程圖

實驗用試劑有：分析純的海藻酸鈉(NaAlg)；造孔劑為單分散聚苯乙烯微球(Polystyrene，PS)，粒徑為15 μm左右，所需相關(guān)試劑均為外購。

2.1 生物活性陶瓷粉體材料制備

首先，制備鎂部分取代鈣(取代率6%)的非計量比硅灰石粉體(記為Mg6)：分別配制硝酸鈣-硝酸鎂混合溶液和硅酸鈉溶液，將混合溶液的pH值調(diào)至10.0左右后，逐滴加入到持續(xù)攪拌的硅酸鈉溶液中，待滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌陳化12 h以上，然后對沉淀溶液抽濾，用去離子水和無水乙醇對白色沉淀物各洗滌3次，再進行干燥和850 ℃煅燒處理，最后將得到的Mg6粉體在乙醇介質(zhì)中球磨6 h，獲得顆粒度不超過10 μm的超細粉體。其次，按類似步驟制備銅取代鈣離子分別為4%和10%的非計量比硅灰石粉體(記為Cu4、Cu10)，即將硝酸銅替換硝酸鎂，其它合成步驟和工藝條件不變，對制備所得的Cu4、Cu10粉體進行球磨處理，制備得到顆粒度不超過10 μm的超細粉體。

2.2 核-殼結(jié)構(gòu)生物活性陶瓷微球制備

將9 g生物陶瓷粉體(Mg6、Cu4、Cu10)加入到20 mL 含5% NaAlg的水溶液中，充分攪拌使粉體均勻分散后形成糊狀物。然后，利用圖1所示的陶瓷微球制備核-殼噴頭及儲料裝置，將上述糊狀物分別裝于與核、殼層噴頭鏈接的儲料泵，啟動蠕動泵將糊狀物從核-殼結(jié)構(gòu)噴頭擠出，從而形成核-殼結(jié)構(gòu)的漿料微滴。一旦微滴滴落到含硝酸鈣的接收液中，利用海藻酸根與鈣離子的螯合交聯(lián)作用迅速硬化成型，漿料微滴的微球顆粒形態(tài)得以維持。從而可以制備出由Cu4、Cu10為核層、Mg6為殼層的核-殼結(jié)構(gòu)微球，分別記為Cu4@Mg6和Cu10@Mg6。

與上述步驟類似，向殼層漿料中預先均勻混合PS微球造孔劑(直徑為15 μm)，且保持陶瓷粉體與造孔劑的質(zhì)量比為6∶1，按類似步驟和過程可以制備得到殼層含量高密度微孔道的核-殼結(jié)構(gòu)微球，并記為Cu4@Mg6-15 μm和Cu10@Mg6-15 μm。

將上述各種微球持續(xù)浸泡2 h后，再用去離子水洗滌3次，然后依次在60 ℃干燥12 h和1120 ℃燒結(jié)3 h，燒結(jié)過程的升溫速率為3 ℃/min。待隨爐溫降至室溫后，得到各種核-殼結(jié)構(gòu)型硅酸鈣陶瓷微球材料。

2.3 微球的成分與結(jié)構(gòu)的測試與表征

使用數(shù)碼相機(Leica)對微球外觀進行拍照，采用游標卡尺和電子顯微鏡(SEM，Ultra 55)分別測量燒結(jié)前后的微球粒徑和觀察其斷面微結(jié)構(gòu)特征，采用X射線衍射(XRD，MaxRC)儀分析評估燒結(jié)后的陶瓷微球樣品的物相組成，采用電感-火焰等離子體發(fā)射光譜法(ICP-OES，iCAP 6000 series)測試粉體中Cu、Mg、Ca等元素的含量。

2.4 體外降解及離子釋放實驗

各種核-殼結(jié)構(gòu)陶瓷微球分別稱取0.20 g樣品并分別加入10 mL Tris緩沖溶液中(pH～7.25)，放入37 ℃恒溫箱。在預定時間點各取1.0 mL浸泡介質(zhì)的上清液，加入到9.0 mL稀鹽酸溶液中，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OMS)測試浸泡樣品上清液中的Ca、Cu、Si和Mg濃度。浸泡4周后取出微球樣品，用去離子水、無水乙醇各洗滌3次，放入80 ℃烘箱中干燥處理，然后稱量，根據(jù)浸泡前、后的微球質(zhì)量變化，借助公式計算其質(zhì)量失重率。

2.5 體外抑菌實驗

體外抑菌實驗分兩種方案進行。方案1(體外接觸抑菌試驗)：制好5份固體瓊脂培養(yǎng)基，用100 μL 移液槍均勻吸取10 μL金葡菌懸液并在塑料試管中稀釋10倍，取100 mL稀釋菌液滴于各個瓊脂培養(yǎng)基上，取涂布棒放于酒精燈燈焰上灼烤15～20 s充分滅菌，再用100 μL移液槍均勻吸取100 μL稀釋菌液并滴加于培養(yǎng)基上，用涂布棒將稀釋菌液均勻涂抹于固體瓊脂培養(yǎng)基表面。取等量核-殼結(jié)構(gòu)(Cu4@Mg6-15 μm，Cu10@Mg6-15 μm)及殼-核結(jié)構(gòu)(Cu4@Mg6，Cu10@Mg6)為實驗組，以Mg6@Mg6為對照組，并依次放置于各相應培養(yǎng)基上，然后用移液槍依次吸取等量PBS緩沖液并滴于微球表面，直至PBS溶液完全淹沒微球。通過定期滴加PBS緩沖液持續(xù)微球表面濕潤，在預定時間點觀察銅摻雜微球抑菌效果。

方案2(微球浸出液抑菌實驗)：準備10份固體瓊脂培養(yǎng)基，備用。分別向10 mL容量塑料試管中加入10 mL滅菌蒸餾水，再用100 μL移液槍吸取金葡菌菌液10 μL注入該試管中，充分震蕩混勻，使金葡菌菌液稀釋。然后，分別吸取100 μL稀釋菌液依次滴加在各個瓊脂培養(yǎng)基上，再取涂布棒炙烤15～20 s充分消毒后，用其將菌液均勻涂抹于培養(yǎng)基上，再培養(yǎng)24 h后取出，備用。

準備10份PBS微球浸出液，具體步驟為：分別取0.20 g 5種陶瓷微球加入到10 mL PBS溶液中，并在37 ℃下分別浸泡24和72 h，取出微球，備用。將分別浸泡微球24和72 h后的各5組PBS浸出液加入到瓊脂上特定的細胞接種區(qū)域(見圖6)，即可得到10份不同分組的瓊脂培養(yǎng)基，并將這些培養(yǎng)基放置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，次日依次觀察各組瓊脂培養(yǎng)基上的細菌生長情況。同時，各組的PBS浸出液均取0.5 mL上清液，加入9.5 mL稀鹽酸稀釋20倍后用于送樣，檢測微球PBC浸出液中Cu離子的濃度。

2.6 體外細菌黏附實驗

向250 mL小燒杯中加入100 mL蒸餾水，再加入0.25 g肉湯瓊脂粉末，充分攪拌、溶解后將該肉湯瓊脂溶液高壓滅菌處理20 min，備用。用無菌注射器抽取2 mL無菌肉湯培養(yǎng)液依次等量加入到5組10 mL塑料試管里，用100 μL移液槍均勻吸取10 μL金葡菌懸液并在試管中稀釋10倍備用，用移液槍吸取100 μL金葡菌稀釋菌液依次等量滴加于上述5組試管中，再取5種微球各5粒，依次等量加入到對應的含有肉湯培養(yǎng)液的試管中，將試管放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。3天后取出5支試管，用無菌塑料吸管依次充分吸干5支試管內(nèi)的肉湯培養(yǎng)液，然后再依次往試管內(nèi)加入若干戊二醛溶液使之淹沒微球，之后將這5支試管放入4 ℃冰箱靜置24 h，充分固定金葡菌。最后，用鑷子依次夾出5支試管里的微球，用吸水紙充分吸盡微球表面的戊二醛殘留液，待微球充分干燥后，使用SEM觀察微球表面的細菌黏附情況。

3 實驗結(jié)果

3.1 形貌觀察和微結(jié)構(gòu)分析

從圖2可見，實驗所制的陶瓷顆粒呈球形，顆粒尺寸較均勻。將干燥后的微球沿縱軸切開，可見微球內(nèi)部核層、殼層的界限層次分明，并且干燥后各組顆粒的球形形態(tài)保持穩(wěn)定。燒結(jié)后，各組微球均發(fā)生了收縮，如圖2(B～F)可見燒結(jié)微球燒粒徑均在2～3 mm之間，單相微球、核-殼結(jié)構(gòu)微球及殼層造孔的微球在燒結(jié)中球形形態(tài)維持良好，各組微球粒度為(2.5±0.2)mm。

圖2 (A)核-殼結(jié)構(gòu)陶瓷微球燒結(jié)前大體外觀及其剖面圖;(B～F)1120 ℃煅燒后核-殼結(jié)構(gòu)微球外觀圖，分別為Mg6@Mg6、Cu4@Mg6、Cu10@Mg6、Cu4@Mg6-15 μm及Cu10@Mg6-15 μm

圖3為陶瓷微球顆粒斷面形貌和微觀結(jié)構(gòu)。從圖可見，陶瓷微球整體截面的宏觀形貌差異并不大，可能是5種陶瓷微球核-殼層組分均為硅灰石，因而難以觀察到Mg、Cu的摻雜所引起的細微差別。事實上，燒結(jié)后各組分晶粒形貌類似，因而難以觀察到文獻所述[30]的核-殼層因燒結(jié)收縮造成的間隙。從圖3(D2、E2)觀察可知，引入PS微球造孔劑會在殼層內(nèi)形成大小均一、形態(tài)較為一致的圓形孔隙。從圖3(A2-E2)對比觀察發(fā)現(xiàn)，兩組經(jīng)造孔的陶瓷微球較其他未造孔的三組陶瓷微球的殼層結(jié)構(gòu)也更為疏松，表明造孔劑加入達到了殼層微孔調(diào)節(jié)的目的?？傊ㄟ^SEM觀察表明，同軸核-殼噴頭系統(tǒng)可以制備出具有良好球形形態(tài)的核-殼結(jié)構(gòu)非計量比硅灰石生物陶瓷微球，并且特定組分內(nèi)部微結(jié)構(gòu)可調(diào)可控。

圖3 1120 ℃煅燒后的不同放大倍數(shù)元素摻雜核-殼結(jié)構(gòu)生物陶瓷微球的斷面掃描電鏡圖片(A1～A3:Mg6@Mg6；B1～B3：Cu4@Mg6；C1～C3: Cu10@Mg6；D1～D3：Cu4@Mg6-15 μm；E1～E3: Cu10@Mg6-15 μm)

3.2 核殼結(jié)構(gòu)生物活性陶瓷體外降解行為分析

圖4為多種陶瓷微球的體外降解離子釋放測試結(jié)果。如圖4A所示，從Ca釋放速率可見，Mg6@Mg6顯示出最快的降解速率，Cu摻雜的硅灰石核-殼結(jié)構(gòu)陶瓷微球(Cu4@Mg6和Cu10@Mg6)則顯著抑制了硅灰石的降解速率。從Si的釋放濃度變化也表明純硅灰石核-殼結(jié)構(gòu)陶瓷微球(Mg6@Mg6)表現(xiàn)出較快的降解速率，Cu摻雜的核-殼結(jié)構(gòu)陶瓷微球(Cu4@Mg6，Cu10@Mg6)的Si釋放則較為緩慢(圖4B)。另一方面，隨著Cu摻雜取代率的增加，從核-殼結(jié)構(gòu)微球中釋放Cu離子濃度增大則更為快速，裝有Cu10@Mg6的緩沖液中Cu離子釋放濃度增大較快(圖4D)。同時，對比Cu4@Mg6和Cu4@Mg6-15 μm，Cu10@Mg6和Cu10@Mg6-15 μm，后者都表現(xiàn)出了更快的Cu2+釋放速率，這是由于殼層經(jīng)造孔后，其質(zhì)地相較于致密微球更為疏松，降解更快，同時其核層組分與模擬體液接觸面積更大，共同促進了其核層Cu2+高效釋放。再次，通過核-殼結(jié)構(gòu)設(shè)計的的Cu4@Mg6、Cu10@Mg6則能夠穩(wěn)定地釋放Mg離子，盡管其釋放速率低于Mg6@Mg6(圖4C)。由此表明，Cu摻雜核-殼結(jié)構(gòu)陶瓷微球能夠控制其降解速率，并且Cu摻雜取代不同的陶瓷微球能夠進一步調(diào)節(jié)殼層關(guān)鍵組分的降解速率。

圖4 各組微球在Tris-HCl緩沖液內(nèi)浸泡的離子釋放濃度曲線圖，分別為(A)Ca2+;(B)Si2+;(C)Mg2+;(D)Cu2+

依據(jù)體外浸泡實驗結(jié)果分析，對該系列殼層造孔和非造孔的各組核-殼結(jié)構(gòu)型陶瓷微球進行系統(tǒng)的體外抑菌實驗研究。采用將微球置于金黃色葡萄球菌菌株平板中進行直接接觸抑菌法來評價微球的抑菌能力。將培養(yǎng)1～5天后對抑菌圈后進行拍照，如圖5所示。從肉眼觀察可見，各組微球均未見出現(xiàn)明顯抑菌圈，綜合分析考慮主要是因為在較干燥的條件下不利于Cu、Mg等活性離子的持續(xù)及有效釋放。

圖5 不同組別核-殼結(jié)構(gòu)生物陶瓷微球直接接觸抑菌實驗，所用細菌為金黃色葡萄球菌

微球PBS浸出液抑菌實驗結(jié)果(見圖6)顯示，將殼層造孔和非造孔的各組分別浸泡在PBS緩沖液中一段時間后得到的各組浸出液以用于抑菌，均顯示出程度不一的抑菌性能。同時各組浸出液Cu離子濃度送樣結(jié)果表明：Mg6@Mg6浸出液的Cu離子濃度為0，Cu4@Mg6浸出液的Cu離子濃度為20 mg/L，Cu10@Mg6浸出液的Cu離子濃度為32 mg/L，Cu4@Mg6-15 μm浸出液的Cu離子濃度為26 mg/L，Cu10@Mg6-15 μm浸出液的Cu離子濃度為50 mg/L。從圖6還可見，各組滴加浸出液的區(qū)域均出現(xiàn)了一個明顯的圓形圈，不同的是滴加了Mg6@Mg6的微球在24和72 h地圓形圈內(nèi)部均有明顯的細菌長入。但是，Cu摻雜的各組微球在24 和72 h均出現(xiàn)了大小不一的較為明顯的抑菌圈。進一步分析可知，殼層未經(jīng)造孔時，其浸出液顯示出較為相似的抑菌效果，但均明顯劣于外殼層造孔組。對于殼層造孔的微球組，在24和72 h后皆可見銅摻雜含量更高的Cu10@Mg6-15 μm微球獲得了最佳的抑菌效果。因此，通過對微球核心摻銅量及外殼層微孔結(jié)構(gòu)的調(diào)控，可有效介導材料抑菌離子的釋放。

圖6 不同組別核-殼結(jié)構(gòu)生物陶瓷微球PBS浸出液抑菌實驗結(jié)果

從圖7可見，Mg6@Mg6微球表面可觀察到大量呈葡萄串珠樣黏附于其表面的金葡菌，顆粒邊界分明，分布密度很大。在SEM高倍鏡下愈加可清晰地見到該組微球的局部長滿了顆粒分明，邊界清晰的金葡菌。對比觀察其他實驗組，在較低倍鏡下Cu4@Mg6表面黏附的金葡菌數(shù)量顯著少于Mg6@Mg6組，并且從分布密度上相比較亦可看出Cu4@Mg6表面菌落較稀疏。對比Cu10@Mg6和Cu4@Mg6發(fā)現(xiàn)，前者表面金葡菌黏附密度更低，表明核層摻雜的Cu2+含量越高，抑菌效果越好。將Cu4@Mg6-15 μm和Cu10@Mg6-15 μm微球組與其他組微球?qū)Ρ瓤梢?，這兩組微球上表面僅有少量細菌黏附生長，側(cè)面則幾乎無細菌黏附，表現(xiàn)出較強的抑菌能力，進一步證明了殼層造孔的Cu摻雜陶瓷微球具有更佳的抑菌效果。

圖7 體外抑菌實驗金黃色葡萄球菌微球黏附情況電鏡掃描圖(上兩行為正面觀，下兩行為側(cè)面觀)

4 實驗討論

骨損傷修復材料的生物活性和降解性是影響骨再生修復效率的重要因素。近年來很多研究證明某些鈣-硅基生物陶瓷表現(xiàn)出顯著優(yōu)于鈣-磷基陶瓷的骨傳導活性和骨生成活性，并且能調(diào)節(jié)免疫反應和介導血管、新骨高效再生[19]，降解的無機離子組合物對骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)產(chǎn)生誘導活性效應，顯著促進內(nèi)皮細胞增殖及多種血管化細胞因子的高效表達[20]；如果添加ZnO、CuO等成分，還能夠調(diào)控創(chuàng)傷內(nèi)的炎性反應并防控感染[21-22]。一些含鎂的鈣-硅基生物陶瓷，如透輝石、鎂黃長石被證實具有良好成骨活性[23]，本課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)利用摻鎂工藝可以避免硅灰石過快降解并且能夠顯著提高材料的力學強度[24]，因此，如何有效地利用鈣-硅基生物活性材料的生物學功能，并且利用Cu2+優(yōu)良的抑菌能力，通過核殼組分選擇性Cu2+、Mg2+摻雜思路，可以巧妙地實現(xiàn)Cu2+釋放速率的控制以及發(fā)揮抗感染功能。

人工材料的孔道微結(jié)構(gòu)特征直接影響骨再生效率。以冰晶模板法、三維打印技術(shù)等對孔尺度或者力學性能可調(diào)性方面各有優(yōu)勢，甚至有利于研究孔尺度與血管化、骨再生發(fā)生之間的關(guān)系[25-26]。但是，這些制備工藝因難以對陶瓷孔道壁的降解速率進行動態(tài)剪裁及生物活性精細調(diào)控。而球形堆砌體可形成完全貫通的多孔孔道，并有利于養(yǎng)分傳輸、細胞遷移、血管化等[27]。國內(nèi)外學者也相繼制備出幾種磷酸鈣、硅酸鈣鹽陶瓷微球，并在骨修復、治療性藥物緩釋等方面開展了研究[28-29]。但是依據(jù)球形緊密堆積理論，相同尺度的微球堆砌體孔隙率往往比較有限(≤32%)，而且常規(guī)高溫燒結(jié)的陶瓷微球，骨缺損內(nèi)較為穩(wěn)定，降解緩慢，則會出現(xiàn)孔道拓展效率緩慢和骨再生效率低下等問題。在前期研究中采用自主設(shè)計的微球制備裝置，成功建立了多層化復相陶瓷微球制備的技術(shù)方案，制備了具有階段波動性降解特征的系列核-殼機構(gòu)生物活性陶瓷微球[30]。本研究升級了同軸核-殼結(jié)構(gòu)雙層噴頭及微流控系統(tǒng)，并通過異質(zhì)離子Cu、Mg選擇性摻雜和外殼層造孔等技術(shù)方案，成功實現(xiàn)了該類微球材料核心層抗菌活性離子的可控緩釋。

作為骨缺損填充材料的陶瓷微球，其內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)諸如內(nèi)部介孔結(jié)構(gòu)、孔隙貫通率、孔隙大小等均對材料的降解性能及促成骨能力有重要影響[31]。理論上，具有多孔結(jié)構(gòu)的微球材料相比致密微球材料，與體液接觸面積大，離子溶出速度加快，同時微球外部的微孔結(jié)構(gòu)有利于吞噬細胞吸附，加速陶瓷材料降解[32]。這次研究深入探討了微球的顆粒度、各層微結(jié)構(gòu)及組成成分、外殼層造孔等參數(shù)對無機離子釋放劑量的調(diào)控作用規(guī)律，發(fā)現(xiàn)摻鎂硅灰石殼層微孔結(jié)構(gòu)剪裁可以增加核心層銅離子等抑菌成分釋放，因而Cu10@Mg6-15 μm的銅離子釋放得以進一步加速，并最終獲得了最佳的長期抑菌效果。

以Cu4@Mg6、Cu10@Mg6、Cu4@Mg6-15 μm和Cu10@Mg6-15 μm為實驗組，以Mg6@Mg6為對照組，在直接接觸抑菌實驗中，各組微球均未見明顯抑菌圈出現(xiàn)，初步分析表明干燥條件下不利于銅離子釋放。反之，將各組微球浸出液進行抑菌分析，含銅離子浸提液組均出現(xiàn)了一個明顯的抑菌圈，但是Mg6@Mg6微球在第3天仍舊有細菌長入并最終完全覆蓋培養(yǎng)皿。進一步通過細菌黏附實驗分析還發(fā)現(xiàn)，殼層含有高度微孔的Cu4@Mg6-15 μm和Cu10@Mg6-15 μm表現(xiàn)出了優(yōu)良的抑菌效果，與其他組微球?qū)Ρ瓤梢姡搩山M微球上表面僅有少量細菌黏附生長，側(cè)面則幾乎無細菌黏附，可見優(yōu)化外殼層的多孔結(jié)構(gòu)比單純提高核層銅離子摻雜率更有利于活性離子釋放。

總之，球形顆粒陶瓷材料具有易于塑形，植入便捷等優(yōu)勢，并且其堆積體內(nèi)含有完全貫通的孔道，有利于活性離子釋放、成骨相關(guān)細胞遷移和新骨長入[33]，本研究對于臨床上各種類型的感染性骨缺損治療修復具有重要的意義。不僅如此，該類陶瓷微球材料緩慢降解所釋放Cu2+已被廣泛證實具備較強的促進血管化和抑菌能力[17-18]，可有效抑制多種細菌的增殖，長期抗感染性能突出，同時較低劑量的銅元素對人體的影響也甚微，這些優(yōu)良的生物學功效為該類生物陶瓷微球材料治療難治性感染性骨缺損奠定了基礎(chǔ)。

5 結(jié) 論

本研究通過同軸核-殼陶瓷微球制備系統(tǒng)制備出核-殼結(jié)構(gòu)生物活性的陶瓷微球，并結(jié)合有機超細微球致孔工藝，在陶瓷微球的殼層成功構(gòu)建出具有一定抑菌性能的微孔結(jié)構(gòu)，制備得到的陶瓷微球尺寸均一，球形形態(tài)良好。同時，體外抑菌實驗和微球細菌黏附實驗證實Cu10@Mg6-15 μm獲得了最佳的抑菌效果。本研究構(gòu)建的殼層微孔調(diào)節(jié)的核-殼結(jié)構(gòu)型陶瓷微球，能夠幫助解決抗感染離子可控緩釋以及長期抑菌的優(yōu)良效果，為骨科臨床上棘手的感染性骨缺損的治療提供了新的材料和解決方案。