孫 燕，柳 永，李偉東，費驥慧，陳興江

(1.貴州省煙草科學研究院，貴州 貴陽 550001；2.杭州師范大學錢江學院，浙江 杭州 310036；3.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江 杭州 310023)

1 前 言

自然界中的細菌既可呈自由漂浮存在，亦可附著于某些表面形成生物膜[1]。不少抗菌劑雖能有效抑制自由漂浮的細菌，但不能很好地殺滅生物膜細菌[2-3]。細菌生物膜的本質(zhì)是微生物在基體表面形成的群落，群落被胞外多糖包圍，抗菌劑難以有效地穿透胞外多糖層的保護。殺滅生物膜中細菌所需抗菌劑的劑量，通常是消滅浮游細菌所需劑量的1000 倍[4-6]。更值得注意的是，許多醫(yī)學上的細菌感染是由于細菌生物膜引起的，如手術(shù)植入、未愈合的傷口感染、糖尿病以及囊性纖維化等[1-2]。因此，迫切需要啟動新的能夠根除細菌生物膜的抗菌模式的研究和應用。

NO是二十世紀八十年代后期發(fā)現(xiàn)的氣質(zhì)性細胞信使分子，除參與多種生理反應外，在哺乳動物對病原體的免疫應答反應中也發(fā)揮著重要作用[7]。NO的抗菌活性是由于其反應性副產(chǎn)物如三氧化二氮和過氧化亞硝酸鹽等所激發(fā)的亞硝化反應和氧化反應引起的，可最終導致細菌細胞膜的破裂[8]。目前，NO釋放材料已經(jīng)在病菌致滅領(lǐng)域出現(xiàn)了較廣泛的研究，原因是NO不會導致耐藥細菌產(chǎn)生。NO供體研究包括小分子親核NO，如二乙胺和精胺親核NO、大分子如殼聚糖親核NO[9-10]和超支化大分子親核NO等[11-12]。研究顯示多數(shù)親核NO供體的釋放不可控，釋放太快，緩釋效果并不明顯。溶菌酶(lysozyme，EC3.2.1.17)也是一種細菌難以產(chǎn)生耐受性的藥物，它水解的部位是細菌細胞壁上的通用肽聚糖結(jié)構(gòu)，形成細胞壁破損，導致細胞內(nèi)溶物外滲死亡。溶菌酶(以雞蛋白溶菌酶為例)等電點為10.8，在人體液pH值為7.4下帶正電荷，可與酸性病毒因子，如病毒外殼蛋白和核酸等結(jié)合，達到失活病毒的效果。有機整合NO和溶菌酶的抗菌作用，有可能形成雙重殺菌的高效殺菌劑。

本研究擬探索一種特異性抗菌的新途徑-NO和溶菌酶協(xié)同修飾的復合納米材料的制備改性，以獲得便于識別致病菌并及時釋放NO和溶菌酶的復合納米材料。為達到緩釋效果，研究選取兩種天然存在、可生物降解并可生物醫(yī)用的高分子材料，即N-(2-羥基)丙基-3-三甲基氯化銨殼聚糖(HTCC)和海藻酸鈉(SA)，作為載體材料。首先利用兩種大分子之間的離子交聯(lián)作用，制成負載溶菌酶的納米粒子，然后將負載溶菌酶的納米粒子與NO氣體在高壓下反應，最終制得協(xié)同負載溶菌酶和NO兩種藥物的納米材料。選取HTCC是因為可以規(guī)避純的殼聚糖的正電性與正常細胞表面存在豐富的靜電絡(luò)合作用，因為這種作用在體內(nèi)和體外都不可控，最終會在一定程度上導致細胞的毒性效應[13]。另外，HTCC具備永久正電性和生理環(huán)境下的水溶性，而且這種殼聚糖衍生物的抗菌活性在制藥學上有潛在的應用價值[14-15]。選擇SA是由于其可以與帶正電的多糖形成很好的離子交聯(lián)作用，制備成粒徑大小可控的納米粒子，并且對水溶性藥物的包封效果顯著[16]。

2 實 驗

2.1 材料與試劑

殼聚糖(CS，Mv=400 kDa，脫乙酰度≥90%),SA，溶菌酶(23500 U/mg),為生物純。冰醋酸、異丙醇、硝酸銀(AgNO3)、亞硝酸鈉、無水甲醇、2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTMAS)、磺胺和甲醇鈉等均為分析純。PBS緩沖溶液，化學純。溶菌酶檢測試劑盒、NO測定試劑盒(Griess試劑盒)、NO氣體(純度99.9%)，均為國產(chǎn)試劑。大腸桿菌DH5α菌株，煙草青枯菌FSQ、生防菌枯草芽孢桿菌BS136菌株和解淀粉芽孢桿菌BaS菌株為貴州省煙草科學院保存菌種。

2.2 溶菌酶負載HTCC/SA復合納米粒子的制備及表征方法

2.2.1HTCC的制備 參照文獻[17]的方法，合成HTCC：在150 mL三頸燒瓶中加入CS 4.0；GTMAC 3.6 g和60 mL蒸餾水。80 ℃下回流，恒溫攪拌(400 r/min，7 h)。反應結(jié)束，將產(chǎn)物裝入截留分子量14 kDa的透析袋中，于蒸餾水中透析，至透析液經(jīng)AgNO3(0.1 mol/L)檢測無白色沉淀時止。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后烘干得到粉末狀HTCC。

2.2.2負載溶菌酶的HTCC/SA復合納米粒子的制備 (1)將所制得的HTCC溶于蒸餾水中，配成1 mg/mL的HTCC溶液。

(2)將1 mg/mL的SA水溶液與1 mg/mL的溶菌酶水溶液按不同體積比混合，不斷攪拌至有微弱藍色熒光出現(xiàn)并穩(wěn)定存在，即得到SA/溶菌酶復合納米粒子溶液;取上述SA/溶菌酶復合納米粒子溶液，滴于1 mg/mL的HTCC溶液中，并不斷磁力攪拌，至有藍色熒光出現(xiàn)并穩(wěn)定存在(記為A納米溶液)。

(3)將A納米溶液低溫高速(4 ℃，20000 g)離心，去掉上清液，沉淀冷凍干燥，得到干燥的負載溶菌酶的HTCC/SA復合納米粒子。

2.2.3測定溶菌酶的載藥量和包封率 依照溶菌酶檢測試劑盒說明書進行 ①試劑配制：取菌粉1支，在勻漿管中，與1 mL菌粉溶劑輕緩研磨3 min，即得貯備菌液；將貯備菌液以菌粉溶劑稀釋20倍即得應用菌液；取2 mg標準品分散于1 mL蒸餾水中，混勻得到2 mg/mL的標準品貯備液，再取適量的標準品貯備液，用蒸餾水稀釋成不同濃度。將應用菌液及各種濃度的溶菌酶標準液置于0 ℃的冰水中預冷5 min以上。

②測定標準液的透光度，按表1進行操作。

表1 溶菌酶標準溶液的測試配方

37 ℃準確水浴15 min，立即取出置于0 ℃冰水浴中3 min，逐管于530 nm處，以蒸餾水為100%透光度，測各管透光度。

③按上述方法測定第2.2.2節(jié)(3)中上清液的透光度，根據(jù)標準曲線換算成游離溶菌酶的濃度。

④按式(1)、(2)計算包封率和載藥量，求3次求平均值：

包封率=(溶菌酶的總濃度-游離溶菌酶的濃度)/溶菌酶的總濃度×100%

(1)

載藥量=包封率×溶菌酶總質(zhì)量/納米粒子的質(zhì)量×100%

(2)

2.3 負載溶菌酶的HTCC/SA復合納米粒子接枝NO的制備

取少量負載溶菌酶的HTCC/SA復合納米粒子加入到甲醇鈉與無水甲醇(50 mL)溶液中，要求[Na+]/[NH]的物質(zhì)的量之比等于3。高壓反應釜先用N2鼓泡30 min，然后抽真空。接著再通NO，維持壓力0.6 MPa，室溫下攪拌反應4 d。反應完成后，通N2鼓泡30 min。過濾釜中產(chǎn)物，以無水甲醇洗滌3 次后，于室溫下真空干燥12 h，轉(zhuǎn)移至真空干燥器中-20 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 負載溶菌酶的HTCC/SA復合納米粒子的透射電鏡(TEM)觀測

采用懸滴法于噴涂超薄碳膜的銅網(wǎng)上制備透射電子顯微鏡觀測樣本，以2%磷塢酸溶液染色，并于室溫下自然風干。使用型號為A JEM-2010 JEOL的TEM對干態(tài)納米粒子的形貌、結(jié)構(gòu)與尺寸大小進行觀測。

2.5 溶菌酶/NO協(xié)同負載HTCC/SA復合納米粒子的紅外光譜(FTIR)分析

對負載NO前后的復合納米粒子樣品進行紅外光譜表征。采用KBr壓片法光譜掃描樣本：取少量干燥復合納米粒子粉末于瑪瑙研缽中，加入干燥的KBr粉末在紅外燈下充分研磨混合，壓片并進行紅外分析。紅外光譜的掃描精度為4 cm-1，掃描次數(shù)為32 次，掃描范圍為4000～400 cm-1。

2.6 溶菌酶/NO協(xié)同負載HTCC/SA復合納米粒子的差示掃描量熱(DSC)分析

HTCC/SA復合納米粒子的DSC測試：首先將溫度從室溫升到100 ℃，保持5 min；然后降低到-20 ℃，同樣保持5 min；再次從-20 ℃即熱到290 ℃，保持5 min，最后降回到25 ℃。升降溫速率均設(shè)為10 ℃/min。溶菌酶/NO協(xié)同負載HTCC/SA復合的米粒子的DSC測試：除不做升到100 ℃并保持5 min步驟外，其余操作同HTCC/SA復合納米粒子的DSC測試。

2.7 溶菌酶和NO的體外釋放

取10 mg協(xié)同負載溶菌酶/NO的HTCC/SA復合納米粒子樣品干粉于透析袋中，加入PBS緩沖液5 mL，放入盛有35 mL PBS緩沖液的密閉玻璃瓶中，在37 ℃的水浴下磁力攪拌釋放。每隔一定時間取樣2 mL，同時補充PBS緩沖溶液2 mL。

取出的1 mL樣品液用第2.2.3節(jié)中的測定透光度的方法來計算溶菌酶的釋放量。

用PBS緩沖溶液配制0～25 nmol的亞硝酸鈉標準溶液制備標準曲線。

取出的1 mL樣品液依次與GriessⅠ(1 mL)和GriessⅡ(1 mL)混合，在閉光的條件下，穩(wěn)定15 min后會觀察到紫色或紫紅色出現(xiàn)，此時NO已反應生成亞硝酸鹽，然后用紫外-可見分光光度計(UV-Vis)測定其540 nm處的吸光度，通過標準曲線測定NO釋放濃度。

2.8 復合納米粒子的體外抗菌效果分析

以革蘭氏陰性菌大腸桿菌DH5α菌株，煙草青枯菌FSQ菌株，革蘭氏陽性菌生防菌枯草芽孢桿菌BS136和解淀粉芽孢桿菌BaS菌株為實驗菌株。于超凈工作臺中，在直徑90 mm的培養(yǎng)皿中倒入約20 mL溶化的固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨 10.0 g/L，牛肉浸膏3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂粉15.0 g/L，pH值為7.3 ± 0.1，121 ℃高壓滅菌15 min)，靜置冷卻固化。向固化培養(yǎng)基上加入0.2 mL試驗菌株懸液(菌液濃度為OD600=0.1)，并將菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面，保持培養(yǎng)皿蓋敞開狀態(tài)下于超凈工作臺中吹干至表面無流動液體。最后在培養(yǎng)基上等距離取5個點，各放置直徑5 mm無菌濾紙圓片1 片，并在濾紙片上分別加入以下測試樣品溶液10 μL：(a)HTCC∶SA=15∶5、(b)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶1(NO接枝)、(c)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶3(NO接枝)、(d)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶5(NO接枝)和(e)濃度與(d)相同的溶菌酶水溶液。將培養(yǎng)皿置于生化培養(yǎng)箱中于30 ℃下倒置培養(yǎng)24 h，然后觀察記錄透明圈有無與大小。

3 結(jié)果與討論

3.1 復合納米粒子的FTIR分析

圖1是溶菌酶/NO雙重載藥復合納米粒子的紅外譜圖。圖中曲線a可見CS在1596 cm-1處有一個伯胺N-H的特征峰，而此峰在HTCC的紅外譜圖(曲線b)中消失，取而代之的是HTCC在1536 cm-1處出現(xiàn)了仲胺的特征峰。同時HTCC在1483 cm-1處出現(xiàn)了一個新的峰，這是季胺基團的甲基上的C-H反對稱彎曲振動，反映出CS的2位NH2上發(fā)生了反應，生成了仲胺鍵，表明季銨鹽改性殼聚糖成功，制得了HTCC。

圖1 復合納米粒子的紅外光譜圖

同時，SA在與HTCC復合后，HTCC與SA之間強的靜電作用導致HTCC在3440 cm-1處的羧基和氨基的伸縮振動峰向高波數(shù)移動并變窄，表明靜電作用消弱了HTCC中的分子內(nèi)氫鍵作用；經(jīng)過包埋溶菌酶后這個峰又重新變寬；溶菌酶在1530 cm-1處仲酰胺的C-N伸縮振動峰消失，在1624 cm-1處的羧基的不對稱伸縮振動向高波數(shù)移動，這表明溶菌酶是發(fā)生化學作用包埋在了HTCC/SA復合納米粒子中。而經(jīng)過NO修飾后的溶菌酶負載復合納米粒子紅外譜圖在1376和1319 cm-1處為N-N=O基團的N=O伸縮振動。

3.2 復合納米粒子中溶菌酶的包封率和載藥量

當HTCC∶SA∶Lys的質(zhì)量比=15∶5∶1時，納米粒子的包封率和載藥量分別為52.90%和6.80%；當HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶3時，包封率和載藥量分別為84.20%和27.81%；當HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶5時，包封率和載藥量分別為92.10%和46.20%。圖2結(jié)果顯示，隨著溶菌酶用量的增多，溶菌酶與SA之間的離子交聯(lián)作用加大，所以包封率和載藥量均逐漸增大。

圖2 復合納米粒子中溶菌酶的載藥量和包封率

3.3 復合納米粒子的TEM分析

圖3為HTCC/SA負載溶菌酶的復合納米粒子的TEM照片。從圖3(a)可見HTCC與SA進行離子復合形成的納米粒子尺寸較小，大約在40～200 nm左右，且形成的納米粒子結(jié)構(gòu)較致密，說明HTCC與SA之間的離子交聯(lián)作用較充分。當HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶1時(圖3(b))，可以清晰地看到形成的納米粒子尺寸變大，大部分都在300 nm左右，這說明溶菌酶與SA的離子交聯(lián)作用出現(xiàn)的同時，削弱了SA與HTCC之間的離子交聯(lián)作用，導致HTCC和SA通過離子交聯(lián)作用形成的納米粒子變得較松散，所以納米粒子尺寸明顯增加。隨溶菌酶濃度進一步增加，當HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶3時(圖3(c))，形成的納米粒子尺寸進一步增加到400～500 nm左右；當HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶5時(圖3(d))，由于溶菌酶與SA的離子交聯(lián)作用較顯著，直接導致SA與HTCC之間的作用進一步削弱，在TEM照片中甚至找不到形狀較規(guī)整的納米粒子。

圖3 不同復合納米粒子的TEM照片

3.4 復合納米粒子的DSC分析

從圖4A可見，負載Lys的HTCC/SA復合納米粒子系列產(chǎn)物都出現(xiàn)了HTCC的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(102 ℃)，同時在227 ℃都出現(xiàn)了放熱峰，可能是因為SA發(fā)生氧化反應導致，且與純的SA相比，此氧化反應溫度提前，峰形寬而矮，這可能是由于SA物理交聯(lián)所致。另一方面，Lys在200 ℃出現(xiàn)熔融吸熱峰(圖4B)，此峰在載藥納米粒子中消失，說明Lys很好地包裹進HTCC和SA組成的載藥系統(tǒng)中，且Lys在納米粒子中是以化學包埋的方式存在的，發(fā)生了化學鍵合作用。從圖4C結(jié)果看，負載Lys的HTCC/SA復合納米粒子進行NO接枝后，其DSC曲線與單純的負載Lys的HTCC/SA復合納米粒子有明顯的不同。接枝NO后的樣品(圖4C-b)在15 ℃和38 ℃左右分別出現(xiàn)一個較弱的吸熱峰；從50 到100 ℃還有一個是較強的吸熱峰。上述三個吸熱峰可能是納米粒子和NO分子之間的鍵解離作用導致的。

3.5 復合納米粒子的Lys體外釋放性能研究

選擇pH=7.4的PBS緩沖溶液作為釋放介質(zhì)，從釋放曲線圖5可以看出，首先出現(xiàn)一個Lys的突釋，釋放量達到了12%～15%左右。圖5c顯示Lys的最大突釋率為14.72%，之后連續(xù)緩慢釋放，60 h后達到23.50%。Lys的突釋是由于納米粒子表面吸附的Lys快速從納米粒子表面解吸造成的。接下來的幾十個小時釋放緩慢，這主要是由于Lys的釋放需要一個較復雜的過程，首先是介質(zhì)中的水分子通過納米粒子表面的空隙擴散滲透到納米粒子內(nèi)部，從而使得納米粒子在緩沖液中出現(xiàn)溶脹，然后納米粒子孔隙尺寸隨之變大，進而藥物分子才能有效擴散出來。納米粒子的這種特點有助于實現(xiàn)對藥物的控制釋放，從而達到緩慢恒速釋放。

圖5 復合納米粒子的Lys的體外釋放曲線圖

3.6 復合納米粒子中NO的體外釋放性能研究

選擇pH=7.4的PBS緩沖溶液作為釋放介質(zhì)，進行NO體外釋放研究(圖6)。從圖可見，納米粒子系列產(chǎn)物的NO釋放性能相似，釋放最大總量接近，集中在90～110 nmol/mg，其中NO的最大釋放總量為108.10 nmol/mg(圖6a)。另外要說明的是溶菌酶的載藥量和包封率對NO的釋放沒有明顯交互影響。

圖6 復合納米粒子中NO的體外釋放曲線圖

3.7 復合納米粒子體外抗菌性能研究

從圖7可以看出溶菌酶/NO雙重載藥復合納米材料，雖然在大腸桿菌DH5α的培養(yǎng)中，其抑菌圈不明顯，但是復合納米材料對另外三種菌株：青枯菌FSQ菌株、枯草桿菌BS136菌株和解淀粉芽孢桿菌BaS菌株均具有較好的抑菌活性。尤其對青枯菌FSQ的抑菌活性表現(xiàn)出明顯的溶菌酶濃度正相關(guān)性，如圖7中的d和e所示，這兩個不同樣品處理中溶菌酶濃度是相當?shù)?，但抑菌圈差異顯著，這反映出溶菌酶、NO修飾與HTCC在抑制青枯菌FSQ菌株上具有一定的協(xié)同增效作用。

圖7 溶菌酶/NO協(xié)同負載HTCC/SA復合納米粒子的抗菌圖(a)HTCC∶SA=15∶5；(b)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶1(NO接枝)；(c)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶3(NO接枝)；(d)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶5(NO接枝)；(e)與(d)濃度相等的Lys水溶液

4 結(jié) 論

本研究以HTCC/SA復合納米粒子作為藥物載體，先包埋溶菌酶，再接枝NO，研究了不同復合納米粒子的載藥量和包封率，對納米粒子進行了表征，并測定了溶菌酶和NO的體外釋放性能。研究結(jié)果表明：

1.復合納米粒子成功負載了溶菌酶。隨著溶菌酶用量的增多，包封率和載藥量逐漸增大。當HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶5時，包封率和載藥量分別達到最大值，為92.10%和46.20%。

2.HTCC存在NH仲胺基團，能夠負載NO可以形成N-N=O結(jié)構(gòu)。

3.溶菌酶的最大釋放百分率為23.50%，NO的最大釋放總量為108.10 nmol/mg。

4.復合納米粒子對青枯菌FSQ菌株、枯草芽孢桿菌BS136菌株、解淀粉芽孢桿菌BaS菌株均具有較好的抑制效果。