冉亨勇，蒲 軍，李明輝，何 毅

(1.邛崍市醫(yī)療中心醫(yī)院腫瘤科，四川邛崍 610000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，四川瀘州 646000)

白藜蘆醇(Resveratrol，Res)化學(xué)名為3，4′，5-三羥基-1，2-二苯乙烯，是一種天然抗氧化物和環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)抑制劑。Res在預(yù)防慢性炎性疾病、抗冠心病、癌癥預(yù)防等方面發(fā)揮重要作用[1]，其機(jī)制與清除自由基，抑制COX-2表達(dá)，誘導(dǎo)一氧化氮合成酶合成，抑制脂氧合酶與蛋白激酶C表達(dá)，抑制脂質(zhì)過氧化等有關(guān)[2]。男性前列腺癌發(fā)病率較高，美國前列腺癌發(fā)病率位居男性腫瘤第2位，我國前列腺癌發(fā)病率也較高[3]。炎癥與前列腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，急性或慢性炎癥不僅會(huì)導(dǎo)致癌變，還參與前列腺癌進(jìn)展[4]。Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)是人體參與炎癥的主要受體，其中TLR4能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子或上調(diào)抗凋亡信號(hào)等一系列效應(yīng)[5]。TLR4信號(hào)通路參與前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，主要與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的抗原性、增強(qiáng)機(jī)體對其免疫清除能力、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、免疫逃逸、凋亡抵抗和侵襲能力等有關(guān)。已有研究報(bào)道，TLR4在人前列腺癌PC3細(xì)胞中通過核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和白細(xì)胞介素(IL)-8的分泌，影響人前列腺癌PC3細(xì)胞的生存[6]。盡管Res對前列腺癌有防治作用，但較少有研究探討其影響前列腺癌細(xì)胞凋亡的作用與調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系，故本研究探討Res是否通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)蛋白和炎性因子表達(dá)影響前列腺癌細(xì)胞凋亡，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)，Res(成都普思生物科技股份有限公司)；TAK242(美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒、Hochest33342熒光染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗人β-actin、TLR4、NF-κB、Bcl-2、Bax單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(英國Abcam公司)；IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人前列腺癌PC3細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，選用RPMI1640培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清后在37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。Res純度為99%，超聲助溶于超純水中。實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞分為陰性對照組，Res高、中、低劑量組，TLR4阻斷劑組。陰性對照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不做其他處理；Res各劑量組分別給予40、20、10 μmol/L Res處理48 h；TLR4阻斷劑組給予1 μg/mL TAK242處理48 h。

1.2.2CCK-8法檢測Res對人前列腺癌PC3細(xì)胞株細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞常規(guī)胰酶消化后制成懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/L，將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔90 μL，在37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)48 h，細(xì)胞處理后每孔加入CCK8試劑10 μL繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測各孔吸光度值(A值)，計(jì)算細(xì)胞生長存活率，細(xì)胞存活率=A給藥組/A陰性對照組×100%。

1.2.3Hochest33342熒光染色檢測人前列腺癌PC3細(xì)胞株細(xì)胞凋亡

收集細(xì)胞懸浮液于1 mL培養(yǎng)基中，加入10 μL Hochest33342儲(chǔ)存液(100 mg/L，蒸餾水溶解)，染色15 min；將細(xì)胞置于冰上冷卻后，離心，去上清液，將細(xì)胞重懸于1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加人5 μL碘化丙啶(PI)儲(chǔ)存液(1 g/L，蒸餾水溶解)，混勻，避光放置10 min后熒光顯微鏡觀察。

1.2.4Western blot檢測人前列腺癌PC3細(xì)胞株TLR4、NF-κB、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)

細(xì)胞處理后棄上清液，每孔加入50 μL裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度，計(jì)算樣品加樣量。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠，每孔上樣20 μL，100 V電泳90 min，200 mA轉(zhuǎn)膜90 min，5%牛血清清蛋白(BSA)封閉1.h，一抗按1∶1 000稀釋后同膜一起轉(zhuǎn)入抗體封閉盒內(nèi)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜4次，每次10 min。加入二抗1∶2 000，孵育1 h，洗膜4次，每次10 min，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液顯影，以β-actin為內(nèi)參，蛋白條帶灰度值用Image proplus6.0軟件測定，根據(jù)TLR4/β-actin和NF-κB/β-actin條帶灰度值比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5ELISA法檢測人前列腺癌PC3細(xì)胞株IL-6和TNF-α表達(dá)

每孔調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105/L，接種于96孔板，處理細(xì)胞后取細(xì)胞上清液按1 000×g離心10 min，每孔加入樣品稀釋液40 μL，待測樣品10 μL，酶標(biāo)板輕輕晃動(dòng)，37 ℃孵育30 min，撕掉封板膜，棄去液體，甩干，加滿洗滌液，靜置30 s后甩干，反復(fù)3次，每孔加入酶標(biāo)液50 μL，37 ℃孵育30 min，洗滌3次，加顯色液A 50 μL，顯色液B 50 μL，搖勻，37 ℃避光顯色，加終止液50 μL，空白調(diào)零，酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Res對人前列腺癌PC3細(xì)胞株增殖的影響

Res各劑量組人前列腺癌PC3細(xì)胞株的細(xì)胞存活率為70.10%～78.35%；與陰性對照組相比，10 μmol/L及以上Res劑量組能抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞株增殖，呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 Res對人前列腺PC3細(xì)胞株增殖影響

2.2 Res對人前列腺癌PC3細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陰性對照組細(xì)胞呈淺藍(lán)色，凋亡細(xì)胞較少；Res各劑量組可見凋亡細(xì)胞呈亮藍(lán)色，并可見細(xì)胞核固縮、核碎裂等現(xiàn)象。Res各劑量組抑制Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)Bax表達(dá)，各劑量組Bcl-2/Bax比值降低，除Res 10 μmol/L組外，與陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、2，表2。

A：陰性對照組；B：TLR4阻斷劑組；C：Res 40 μmol/L組；D：Res 20 μmol/L組，E：Res 10 μmol/L組。圖1 Res對人前列腺癌PC3細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響(Hochest33342熒光染色，×400)

圖2 Res對人前列腺癌PC3細(xì)胞株細(xì)胞Bcl-2/Bax表達(dá)的影響

2.3 Res對人前列腺癌PC3細(xì)胞株細(xì)胞TLR4及NF-κB表達(dá)的影響

Res各劑量組、TLR4阻斷劑組TLR4相對表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；Res 20、40 μmol/L劑量組、TLR4阻斷劑組NF-κB相對表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；Res各劑量組與TLR4阻斷劑組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3、表2。

圖3 Res對人前列腺癌PC3細(xì)胞株細(xì)胞TLR4及NF-κB表達(dá)的影響

表2 Res對人前列腺癌PC3細(xì)胞株TLR4、NF-κB表達(dá)及Bcl-2/Bax的影響

2.4 Res對人前列腺癌PC3細(xì)胞株炎性因子表達(dá)的影響

與陰性對照組比較，Res各劑量組IL-6、TNF-α水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 Res對人前列腺癌PC3細(xì)胞株IL-6和TNF-α表達(dá)的影響

續(xù)表3 Res對人前列腺癌PC3細(xì)胞株IL-6和TNF-α表達(dá)的影響

3 討 論

前列腺癌是目前男性發(fā)病率較高的腫瘤之一，尤其在北美和歐洲地區(qū)[7]。目前其治療仍以手術(shù)、化療等方式為主。盡管近年來不斷有新的化療藥物被批準(zhǔn)用于治療前列腺癌，如多西他賽、卡巴西他賽，但前列腺癌仍是男性因癌癥死亡的第五大原因，占男性癌癥病死率的6.6%[8]；而在亞洲國家，前列腺癌1年、5年和10年存活率分別為81.0%、61.9%和36.2%[9]。

大量臨床試驗(yàn)表明，中藥在預(yù)防前列腺癌方面具有積極作用，許多從中草藥提取的化合物已被證明可通過不同途徑抑制前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展，有望在未來用于前列腺癌的臨床治療[10]。Res的抗炎、抗氧化和抗腫瘤作用一直是腫瘤防治的研究熱點(diǎn)，目前已有研究證實(shí)Res對癌癥的防治具有有益作用，而且不良反應(yīng)少。一項(xiàng)為期10年的流行病學(xué)研究表明，通過食用葡萄而非葡萄酒攝入Res的女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)降低了50%以上[11]。Res的一些Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行中。本研究結(jié)果顯示，10 μmol/L及以上濃度的Res即可抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞株的生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示Res具有抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞株生長，促進(jìn)其凋亡的作用。

凋亡蛋白Bcl-2/Bax是反映凋亡發(fā)生、發(fā)展的經(jīng)典蛋白，因此進(jìn)一步分析Res對凋亡蛋白Bcl-2/Bax是否產(chǎn)生影響。Bcl-2具有抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞生存期的作用。Bax則是促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白，具有對抗Bcl-2蛋白抑制細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2與Bax形成二聚體的比例決定了細(xì)胞凋亡與存活的狀態(tài)，即當(dāng)Bcl-2/Bax比值增加，細(xì)胞存活率高，Bcl-2/Bax比值降低，細(xì)胞存活率則降低[12]。本研究結(jié)果顯示，Res能抑制Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)Bax表達(dá)，降低了Bcl-2/Bax比例，提示Res促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞凋亡的作用與此有關(guān)。

臨床前研究表明，慢性炎癥與前列腺癌進(jìn)展有關(guān)，如在前列腺腫瘤標(biāo)本和切除的組織中發(fā)現(xiàn)慢性炎癥，其他分子、實(shí)驗(yàn)和臨床的證據(jù)也表明慢性炎癥和前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[13]，提示炎癥可能是前列腺癌發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素。炎性介質(zhì)被認(rèn)為是參與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的因素，有可能成為治療干預(yù)的靶點(diǎn)；而炎癥相關(guān)的白細(xì)胞局部浸潤、信號(hào)分子(包括細(xì)胞因子和趨化因子)產(chǎn)生，則與下游效應(yīng)器如NF-κB、Wnt通路激活有關(guān)[14]。TLR4信號(hào)通路也是參與炎癥發(fā)生、發(fā)展的重要通路，已有研究顯示前列腺癌細(xì)胞中TLR2、4、9的激活可能促進(jìn)腫瘤生長[15]。故本研究進(jìn)一步分析Res是否通過影響TLR4通路蛋白表達(dá)，影響下游炎性因子，從而達(dá)到抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的作用。因此，檢測了TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-α的表達(dá)。結(jié)果顯示，Res干預(yù)后前列腺癌細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)水平明顯降低，與使用TLR4抑制劑相似，同時(shí)下游NF-κB蛋白表達(dá)水平和炎性因子(IL-6、TNF-α)表達(dá)水平也明顯降低，提示Res抑制腫瘤細(xì)胞生長可能與阻斷TLR4，以及抑制下游NF-κB蛋白表達(dá)和炎性因子IL-6和TNF-α表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，Res能抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，可能與抑制TLR4、NF -κB蛋白，下調(diào)Bcl-2/Bax比值，減少炎性因子IL-6和TNF-α表達(dá)有關(guān)，其是否涉及其他信號(hào)通路尚有待進(jìn)一步研究。