廖建青 呂靜 張英杰 謝邦 馬富文 王琦

1云南中醫(yī)藥大學(xué)（昆明650500）；2云南省中醫(yī)醫(yī)院（昆明650021）

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是常見于中老年人的一種慢性骨關(guān)節(jié)疾患，與年齡、性別、肥胖、居住環(huán)境潮濕陰暗、站姿工作習(xí)慣、重體力勞動(dòng)職業(yè)、膝關(guān)節(jié)外傷史、基因等因素相關(guān)［1?3］。其主要臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形、失去活動(dòng)能力，疼痛可在活動(dòng)時(shí)、上下樓梯時(shí)加重，關(guān)節(jié)局部有壓痛［4］。相關(guān)研究顯示，我國(guó)人口老齡化比例不斷上升，40 歲以上中老年人KOA 總患病率為17.0%，且隨年齡增長(zhǎng)患病率呈不斷上升的趨勢(shì)［5?6］。晚期膝骨關(guān)節(jié)炎主要以手術(shù)治療為主［7］，而早中期多數(shù)患者更愿意選擇中醫(yī)藥保守治療。因此，在中醫(yī)藥中尋找安全有效防治KOA 的藥物，以提高患者的生活質(zhì)量、延長(zhǎng)壽命成為現(xiàn)代中醫(yī)藥研究的一大熱點(diǎn)。研究表明PI3K/AKT 信號(hào)傳導(dǎo)通路在KOA 的發(fā)病機(jī)制中尤為重要，對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、凋亡具有重要的調(diào)控作用［8?9］，本課題基于PI3K/AKT 信號(hào)傳導(dǎo)途徑來探討具有活血通絡(luò)作用的骨痹合劑防治KOA 的分子機(jī)制，從現(xiàn)代分子生物學(xué)角度揭示KOA 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制與中醫(yī)學(xué)論治“活血通絡(luò)，通則不痛”相關(guān)理論的內(nèi)在關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)C57 小鼠60 只，體質(zhì)量（19.6±0.6）g，購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017?0001。小鼠置于IVC 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房中，隨機(jī)每籠5 只。正常飼養(yǎng)，常規(guī)飲食，室溫20～24 ℃，相對(duì)濕度42%～53%，日照時(shí)間為每天10～12 h，空氣流通。本研究通過云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，倫理批件號(hào)：動(dòng)物2016?001。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 甲苯胺藍(lán)染液（Aladdin T104232）；蘇木素染液（珠海貝索BA4097）；Tunel試劑盒（南京凱基生物KGA704）；DAB 顯色劑（DAKO K5007）；TEMED（Alladin T105496）；甘氨酸（Solarbio G8200）；蛋白酶抑制劑cocktail（Roche 4693116001）；HRP 抗小鼠抗體（Beyotime A0216）；HRP 抗兔抗體（Beyotime A0208）；HRP 抗山羊抗體（Beyotime A0181）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 組織脫水機(jī)PQT?A、組織包埋機(jī)PBM?A、組織攤片機(jī)PHY?Ⅲ（常州普瑞斯星醫(yī)療器械有限公司）；病理切片機(jī)RM2235（上海徠卡儀器有限公司）；顯微鏡（日本尼康，NIKON H550S）；濕法轉(zhuǎn)膜儀170?3930 Bio?Rad。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥物 骨痹合劑（滇藥制字（Z）04A01888）由云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供；氨糖美辛腸溶片（國(guó)藥準(zhǔn)字H20023171）購(gòu)自上海華中藥業(yè)有限公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動(dòng)物模型制備 取10 周齡SPF 級(jí)C57 雄性小鼠60 只，4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，小鼠膝關(guān)節(jié)部位剃毛、備皮消毒，取髕旁內(nèi)側(cè)切口顯露膝關(guān)節(jié)，切斷前交叉韌帶，止血，關(guān)節(jié)腔逐層閉合。術(shù)后3 d 每天予每只小鼠肌肉注射青霉素（8 萬單位/kg）以預(yù)防感染。

1.5.2 動(dòng)物分組、給藥及取材切片 造模8 周后，60 只小鼠稱重記錄并隨機(jī)分為骨痹合劑組、氨糖美辛組、生理鹽水組3 組，每組20 只。自由進(jìn)食飲水1 周后，骨痹合劑組小鼠予骨痹合劑13 mL/（kg·次）灌胃，氨糖美辛組小鼠予19.5 mg/（kg·次）灌胃，對(duì)照組予等體積生理鹽水灌胃；每日上、下午各一次。灌胃8 周后小鼠4%戊巴比妥鈉腹腔過麻處死，分離膝關(guān)節(jié)并保留其相連的脛骨和股骨，取下雙膝關(guān)節(jié)，固定新鮮組織于4%多聚甲醛24 h 以上，將膝關(guān)節(jié)組織部位用手術(shù)刀修平整后，對(duì)應(yīng)標(biāo)簽置于脫水盒中，再放入脫水機(jī)內(nèi)依次梯度酒精予脫水、浸蠟、包埋處理。-20 ℃凍臺(tái)冷卻，蠟?zāi)毯笕〕鲂拚?，切片，片? μm。于攤片機(jī)40 ℃溫水上將切片組織展平后用載玻片撈起，烤片，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 甲苯胺藍(lán)染色 石蠟切片至水，置于60 ℃溫箱用0.5%甲苯胺藍(lán)染色40 min，95%乙醇鏡下控制分色，將切片依次放入無水乙醇Ⅰ5 min ?無水乙醇Ⅱ5 min?二甲苯Ⅰ5 min ?二甲苯Ⅱ5 min 中脫水透明，取出稍晾干后中性樹膠封片，顯微鏡下鏡檢，并作圖像采集分析。

1.5.4 Tunel 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 石蠟切片至水，滴加蛋白酶K 工作液覆蓋組織，37 ℃溫箱孵育30 min，置于PBS 中洗3 次，每次5 min。切片稍甩干滴加破膜工作液覆蓋組織，重復(fù)上述操作。采用Tunel 試劑盒按照說明書操作進(jìn)行細(xì)胞凋亡鑒定，細(xì)胞凋亡結(jié)果判定：切片中軟骨細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白的表達(dá) 取分離好的軟骨組織約50 mg，研磨收集骨粉加入1 000 μL RIPA 裂解液，在冰上裂解30 min，離心，取上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，-20 ℃保存，測(cè)定蛋白含量。清洗玻璃板、灌膠、上樣，電泳，終止電泳，轉(zhuǎn)膜。膜晾干后，TBS 浸濕，再移至含有封閉液（5%脫脂奶粉TBST 溶液）的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h。用含5% BSA 的TBST溶液按照1∶1 000 稀釋于4 ℃孵育過夜。用TBST按照1∶5 000 稀釋，室溫下孵育2 h 后，用TBST 在室溫下脫色搖床上洗3 次，每次10 min；進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，于Tanon5200 化學(xué)發(fā)光成像儀下拍照，獲取圖片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組之間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲苯胺藍(lán)對(duì)各組軟骨細(xì)胞的染色情況 與生理鹽水組比較，骨痹合劑組與氨糖美辛組軟骨組織有明顯改善，甲苯胺藍(lán)染色較深，見圖1。

圖1 各組軟骨細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色的不同表達(dá)情況Fig.1 Different expressions of toluidine blue staining in chondrocytes of each group

2.2 Tunel 法檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞凋亡情況 與生理鹽水組相比較，骨痹合劑組與氨糖美辛組軟骨組織細(xì)胞凋亡明顯減少（P<0.01），見表1、圖2。

圖2 Tunel 檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞凋亡水平的表達(dá)Fig.2 Expression of apoptotic level of chondrocytes in each group detected by TUNEL

表1 各組200 倍視野下凋亡細(xì)胞數(shù)目Tab.1 The number of apoptotic cells in each group at 200 times field of vision ±s

表1 各組200 倍視野下凋亡細(xì)胞數(shù)目Tab.1 The number of apoptotic cells in each group at 200 times field of vision ±s

注：**表示P<0.01

組別凋亡細(xì)胞數(shù)目生理鹽水組27.67±4.04骨痹合劑組11.00±4.36**氨糖美辛組11.67±3.06**

2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)各組PI3K、AKT 和mTOR 蛋白的表達(dá) 與生理鹽水組比較，骨痹合劑組小鼠關(guān)節(jié)軟骨中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達(dá)下降（均P< 0.05）；氨糖美辛組小鼠關(guān)節(jié)軟骨中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達(dá)均下降（P<0.01），見圖3。

圖3 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞內(nèi)PI3K、AKT、mTOR 蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of PI3K/Akt /mTOR protein in chondrocytes of the each group detected by Western blotting

3 討論

本研究主要通過切斷前交叉韌帶法以建立KOA 小鼠模型。膝關(guān)節(jié)炎的造模方法主要有關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)（Hulth 法、前交叉韌帶切斷法、半月板切除法、軟骨缺損法、破壞關(guān)節(jié)穩(wěn)定術(shù)、破壞關(guān)節(jié)血液循環(huán)術(shù)），非手術(shù)方法（關(guān)節(jié)制動(dòng)、寒冷刺激、關(guān)節(jié)撞擊）；關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物法（尿激酶型纖溶酶原激活物、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶等）［10］。通過甲苯胺藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)生理鹽水組中軟骨表面缺損，染色基本缺失，Tunel 法檢測(cè)到軟骨表面大量細(xì)胞凋亡，說明本次造模KOA 凋亡模型成功。在動(dòng)物試驗(yàn)中公認(rèn)的造模方式多樣，但整個(gè)造模過程對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成了極大痛苦，如何能減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的痛苦而取得需要的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，是未來?shí)驗(yàn)研究的方向所在，如何通過正常的軟骨細(xì)胞運(yùn)用藥物誘導(dǎo)或物理作用的方式取得成功實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，本課題將在進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行研究。

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎主要以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)椴±硖卣鳎m然正常軟骨細(xì)胞也存在凋亡現(xiàn)象，但應(yīng)激狀態(tài)下的軟骨細(xì)胞過度凋亡會(huì)導(dǎo)致軟骨基質(zhì)變化，以致軟骨發(fā)生退行性改變［11］。細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的一種細(xì)胞程序性死亡的過程，參與生理和病理過程，而PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路為調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖生長(zhǎng)、凋亡及軟骨細(xì)胞外基質(zhì)重塑方面的一條重要通路［12］。PI3K 是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，由調(diào)節(jié)亞基p85 和催化亞基p110 構(gòu)成［13］，AKT 又稱PKB（protein kinase B），是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，能調(diào)控各種不同細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成。當(dāng)PI3K 接收細(xì)胞膜上的各種傳入信號(hào)后直接或間接激活下游部位的AKT，后者磷酸化作用于P53、NF?κB 及Caspase?9 而發(fā)揮特異性的生物學(xué)作用［14?15］。XU等［16］研究發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/AKT/NF?κB 信號(hào)通路的激活能抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，減輕骨性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)。段志遠(yuǎn)等［17］研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素可顯著降低PI3K、AKT 及NF?κB 蛋白的表達(dá)，緩解KOA 大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變。NF?κB 是PI3K/AKT 下游靶蛋白之一，是參與炎癥、免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)通路［18］。XUE 等［19］研究發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/AKT 通路能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，減輕炎癥反應(yīng)。細(xì)胞自噬參與了關(guān)節(jié)軟骨退化的過程，而mTOR 是自噬的主要負(fù)性調(diào)節(jié)因子，mTOR 通路被抑制可誘導(dǎo)自噬，從而起到保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用［20?21］。mTOR 也具有調(diào)控KOA 關(guān)節(jié)軟骨退變的作用［22］。因此，mTOR 是細(xì)胞凋亡及自噬信號(hào)傳導(dǎo)通路的交匯點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞的凋亡和自噬都具有關(guān)鍵性的調(diào)控作用［23?24］。

我院骨傷科在多年來運(yùn)用中醫(yī)藥治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的學(xué)術(shù)思想及臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用具有活血通絡(luò)作用的骨痹合劑進(jìn)行治療，其主要成分包括當(dāng)歸、丹參、紅花、桂枝、桑寄生、地龍、杜仲、枸杞、蒼術(shù)、細(xì)辛等十多味藥物，全方以活血通絡(luò)為主，又兼祛風(fēng)除濕、補(bǔ)益肝腎。前期臨床試驗(yàn)和基礎(chǔ)研究表明以具有活血通絡(luò)作用的骨痹合劑治療KOA 作用機(jī)理是通過改善軟骨退變過程中的軟骨機(jī)制代謝、抑制氧自由基損傷、軟骨細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子等多種生物學(xué)效應(yīng)，從多途徑、多靶點(diǎn)延緩軟骨退變，控制KOA 進(jìn)展［25］，但其具體作用機(jī)制尚未明確。本次課題研究結(jié)果顯示：甲苯胺藍(lán)染色中，生理鹽水組中軟骨表面可見缺損，軟骨表面大量細(xì)胞凋亡；而骨痹合劑組與氨糖美辛組染色較深，軟骨組織有明顯改善，細(xì)胞凋亡明顯減少（P<0.01），說明骨痹合劑能減少KOA 軟骨細(xì)胞凋亡；相比生理鹽水組，骨痹合劑組小鼠關(guān)節(jié)軟骨中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達(dá)均下降（均P< 0.05）；氨糖美辛組小鼠關(guān)節(jié)軟骨中PI3K、AKT和mTOR 蛋白表達(dá)均下降（P< 0.01），說明具有活血通絡(luò)作用的骨痹合劑能下調(diào)PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達(dá)，抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路，從而減少軟骨細(xì)胞凋亡，緩解KOA 小鼠的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，具有活血通絡(luò)作用的骨痹合劑對(duì)KOA 小鼠軟骨細(xì)胞具有明顯的改善作用，其作用機(jī)制是下調(diào)PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達(dá)，抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路，從而減少軟骨細(xì)胞凋亡，以緩解膝骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)一步發(fā)展。