申屠銀洪，李歡歡，趙曉莉，毛 靖，林 麗，毛春芹，李 鵬，許金國(guó)*，陸兔林*

經(jīng)典名方旋覆代赭湯的指紋圖譜及功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)預(yù)測(cè)分析

申屠銀洪1，李歡歡2，趙曉莉2，毛 靖2，林 麗2，毛春芹2，李 鵬3，許金國(guó)2*，陸兔林2*

1. 浙江桐君堂中藥飲片有限公司，浙江 桐廬 311500 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 3. 南京海陵中藥制藥工藝技術(shù)研究有限公司，江蘇 南京 210023

基于指紋圖譜及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，建立旋覆代赭湯（Xuanfu Daizhe Decoction，XDD）的指紋圖譜分析方法，并對(duì)其功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，為XDD質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。運(yùn)用HPLC色譜法建立旋覆代赭湯物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)應(yīng)實(shí)物（material standard corresponding material，XDD/MSCM）指紋圖譜分析方法，匹配共有峰，并對(duì)各共有峰進(jìn)行歸屬分析，基于文獻(xiàn)及指紋圖譜篩選XDD活性成分，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)建立“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步佐證XDD功效成分選擇的合理性。建立了XDD/MSCM指紋圖譜分析方法，對(duì)多批次XDD/MSCM樣品進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)定36個(gè)共有峰，通過(guò)對(duì)照品指認(rèn)出甘草苷、1,5--二咖啡?？鼘幩帷⑷藚⒃碥誖g1、人參皂苷Re、1--乙酰旋覆花內(nèi)酯、人參皂苷Rb1、甘草酸、6-姜辣素8個(gè)色譜峰，各批次樣品相似度均＞0.90，且36個(gè)共有峰均能明確歸屬到旋覆花、人參、生姜、甘草4味飲片；采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)甘草苷、1,5--二咖啡?？鼘幩帷⑷藚⒃碥誖g1、人參皂苷Re、1--乙酰旋覆花內(nèi)酯、人參皂苷Rb1、甘草酸、6-姜辣素8個(gè)藥效成分進(jìn)行機(jī)制預(yù)測(cè)，富集的通路中含磷脂酰肌醇-3-羥激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3- hydroxykinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信號(hào)通路等與止嘔及抗炎作用相關(guān)。建立的XDD指紋圖譜分析方法穩(wěn)定可行，通過(guò)歸屬分析明確色譜峰的來(lái)源，為XDD后續(xù)制劑的研究提供參照基準(zhǔn)，且結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)XDD 8個(gè)成分與XDD功效屬性密切相關(guān)，可作為其潛在的功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)，為XDD指標(biāo)成分選擇的合理性提供依據(jù)，同時(shí)為經(jīng)典名方的研究提供參考。

經(jīng)典名方；旋覆代赭湯；指紋圖譜；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)；質(zhì)量控制；甘草苷；1,5--二咖啡?？鼘幩?；人參皂苷；1--乙酰旋覆花內(nèi)酯；甘草酸；6-姜辣素；旋覆花；人參；生姜；甘草；PI3K-Akt；HIF-1

經(jīng)典名方是指來(lái)源于古代中醫(yī)典籍收載的至今仍廣泛應(yīng)用且療效確切的中藥方劑，彰顯了中醫(yī)藥治療疾病的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。為了全面利用中醫(yī)藥財(cái)富服務(wù)于人類健康，2018年國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》[1]，并以《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)的申報(bào)資料要求（征求意見稿）》（以下簡(jiǎn)稱《申報(bào)資料要求》）[2]指導(dǎo)經(jīng)典名方的開展。

經(jīng)典名方的研究主要集中在如何還原古方原貌，并對(duì)其進(jìn)行全面的質(zhì)量控制。為了加強(qiáng)對(duì)經(jīng)典名方的質(zhì)量監(jiān)管，要求創(chuàng)建“藥材-飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)應(yīng)實(shí)物（material standard corresponding material，MSCM）-制劑”全過(guò)程的質(zhì)量控制措施，指紋圖譜被列為評(píng)價(jià)中藥的重要方法。

旋覆代赭湯（Xuanfu Daizhe Decoction，XDD）出自東漢張仲景《傷寒論》一書，全方由旋覆花、人參、生姜、代赭、甘草（炙）、半夏（洗）、大棗（擘）7味藥組成，具有降逆化痰、益氣和胃之功[3]，現(xiàn)代藥理研究表明其具有止嘔、抗炎等作用[4]。本實(shí)驗(yàn)按照《申報(bào)資料要求》旨在建立旋覆代赭湯物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)應(yīng)實(shí)物（XDD/MSCM）指紋圖譜分析方法，并對(duì)共有峰進(jìn)行歸屬分析，明確飲片與MSCM的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，以期形成穩(wěn)定可行的物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，分析XDD質(zhì)量控制指標(biāo)選擇的合理性，探索XDD潛在的功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)，為XDD質(zhì)量控制及制劑的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀，配四元低壓梯度泵，在線脫氣裝置，自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD檢測(cè)器，色譜工作站，美國(guó)安捷倫公司；MS-105D電子天平，梅特勒-托利多集團(tuán)；TD1002C電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；MG-H21S011多功能電陶爐，廣東美的生活電器制造有限公司；HH-2K4恒溫水浴鍋，鞏義市英峪予華儀器廠；KQ-500B超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；砂鍋，江西舒雅陶瓷有限公司。

1.2 試藥

試劑：乙腈，HPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司；磷酸，HPLC級(jí)，阿拉丁試劑有限公司；甲醇，HPLC級(jí)，江蘇漢邦科技有限公司；甲醇，分析純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；正丁醇，分析純，上海申博化工有限公司；水為娃哈哈純凈水。

對(duì)照品：甘草苷（批號(hào)P25J7F18328，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）、1,5--二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)P26F9F54633，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），上海源葉生物科技有限公司；甘草酸單銨鹽（批號(hào)110731-202021，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥96.2%）、6-姜辣素（批號(hào)111833-201806，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.9%）、人參皂苷Rg1（批號(hào)110703-201832，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥93.4%）、人參皂苷Re（批號(hào)110754-201827，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥93.9%）、人參皂苷Rb1（批號(hào)110704- 201827，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥93.1%），中國(guó)藥品生物制劑檢定研究院；1--乙酰旋覆花內(nèi)酯（批號(hào)CFS201802，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），武漢天植物技術(shù)有限公司。

XDD 7味原料藥材各采集不少于3個(gè)產(chǎn)地，每個(gè)產(chǎn)地不少于5批，總批次不少于15批，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院陳建偉教授鑒定旋覆花為菊科植物旋覆花Thunb的干燥頭狀花序；人參為五加科植物人參C. A. Mey.的干燥根和根莖；生姜為姜科植物姜Rosc.的新鮮根莖；代赭石為氧化物類礦物剛玉族赤鐵礦，主含F(xiàn)e2O3；甘草為豆科植物甘草Fisch的干燥根和根莖；半夏為天南星科植物半夏(Thunb.) Breit的干燥塊莖；大棗為鼠李科棗屬植物棗Mill的干燥成熟果實(shí)[5]。按照《中國(guó)藥典》2015年版各藥材項(xiàng)下檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合資源考證優(yōu)選藥材產(chǎn)地，最終優(yōu)選的各藥材產(chǎn)地分別為旋覆花（山東東平）、人參（吉林撫松）、生姜（云南蒙自）、代赭石（河北宣化、河北平山）、甘草（甘肅民勤）、半夏（江蘇泰州）、大棗（山東新泰）。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期研究及《中國(guó)藥典》2015年版及全國(guó)炮制規(guī)范指導(dǎo)下優(yōu)化的炮制工藝參數(shù)，其中甘草（炙）為炒甘草，半夏（洗）為姜半夏。將優(yōu)選產(chǎn)地的藥材炮制成對(duì)應(yīng)的15批飲片，飲片經(jīng)檢查均符合《中國(guó)藥典》2015年版各飲片項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)，利用Excel中RANDBETWEEN函數(shù)生成隨機(jī)數(shù)，將旋覆花、人參、生姜、代赭石、甘草、姜半夏、大棗7味飲片的不同批次隨機(jī)組合制備XDD/MSCM，批次組合具體信息見表1。

表1 XDD/MSCM隨機(jī)組合

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

按處方量分別稱取旋覆花9 g，人參6 g，生姜15 g，代赭石3 g，甘草9 g，姜半夏7.5 g，大棗12 g的各味飲片，加水2000 mL，浸泡60 min，以武火（2200 W）煮沸后，半開蓋，調(diào)節(jié)火力至1000 W，保持微沸并煮至1200 mL，趁熱用100目篩濾過(guò)，濾液繼續(xù)煎煮至600 mL，放冷，即得XDD/MSCM。

取XDD/MSCM 10 mL，精密量取，正丁醇萃取3次，每次10 mL，合并正丁醇液，蒸干，加甲醇溶解至2 mL，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇配制成含甘草苷318.0 μg/mL、甘草酸121.2 μg/mL、6-姜辣素44.0 μg/mL、1,5--二咖啡?？鼘幩?32.3 μg/mL、1--乙酰旋覆花內(nèi)酯39.6 μg/mL、人參皂苷Rg1412.0 μg/mL、人參皂苷Re 436.0 μg/mL、人參皂苷Rb1407.2 μg/mL混合對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～10 min，5%～15%乙腈；10～15 min，15%～21%乙腈；15～25 min，21%～22%乙腈；25～28 min，22%～25%乙腈；28～52 min，25%～28%乙腈；52～60 min，28%～36%乙腈；60～75 min，36%～43%乙腈；75～90 min，43%～46%乙腈；90～95 min，46%～58%乙腈；95～103 min，58%～70%乙腈；103～113 min，70%～95%乙腈；113～115 min，95%～5%乙腈；體積流量1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取XDD/MSCM供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄指紋色譜圖。以峰型最佳且穩(wěn)定的30號(hào)峰（6-姜辣素）為參照峰，各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于0.11%，相對(duì)峰面積RSD值均小于3.31%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取XDD/MSCM供試品溶液，平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣HPLC分析，記錄指紋色譜圖。以30號(hào)峰（6-姜辣素）為參照峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于0.09%，相對(duì)峰面積RSD值均小于7.57%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取XDD/MSCM供試品溶液，室溫放置0、2、4、8、12、24 h后，在上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄指紋色譜圖。以30號(hào)峰（6-姜辣素）為參照峰，各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于0.22%，相對(duì)峰面積RSD值均小于3.55%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 XDD/MSCM指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

按照“2.1”項(xiàng)下方法制備18批XDD/MSCM供試品溶液，并按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，并記錄色譜圖。色譜圖依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012A）軟件。以S1號(hào)樣品的指紋圖譜作為參照譜，采用中位數(shù)法，進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，得到18批樣品疊加圖及共有模式圖，結(jié)果見圖1、2-A。確定了36個(gè)共有峰，經(jīng)與化學(xué)對(duì)照品（圖2-B）的色譜行為進(jìn)行比較，可鑒定出其中8個(gè)色譜峰，分別為7號(hào)峰甘草苷、14號(hào)峰1,5--二咖啡?？鼘幩?、19號(hào)峰人參皂苷Rg1、20號(hào)峰人參皂苷Re、22號(hào)峰1--乙酰旋覆花內(nèi)酯、25號(hào)峰人參皂苷Rb1、29號(hào)峰甘草酸、30號(hào)峰6-姜辣素。

與對(duì)照指紋圖譜相比為參照?qǐng)D譜，設(shè)其相似度為1.000，計(jì)算18批XDD/MSCM的相似度，結(jié)果見表2，各批次樣品指紋圖譜相似度大于0.90，得到的XDD/MSCM指紋圖譜相似度良好，表明各批次的物質(zhì)群基本一致，上述方法穩(wěn)定、可行，形成的物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)照?qǐng)D譜能夠作為衡量XDD制劑的標(biāo)準(zhǔn)參照物。

圖1 18批XDD/MSCMHPLC指紋圖譜疊加圖

7-甘草苷 14-1,5-O-二咖啡酰奎寧酸 19-人參皂苷Rg1 20-人參皂苷Re 22-1-O-乙酰旋覆花內(nèi)酯 25-人參皂苷Rb1 29-甘草酸 30-6-姜辣素

表2 18批XDD/MSCM指紋圖譜相似度

2.6 XDD/MSCM共有峰的歸屬研究

按供試品制備方法，分別制備單味飲片供試品溶液、缺單味飲片供試品溶液及XDD/MSCM供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下指紋圖譜條件進(jìn)行檢測(cè)，分別將7味飲片單味飲片供試品溶液、缺單味飲片供試品溶液和XDD/MSCM供試品溶液色譜圖進(jìn)行比對(duì)，XDD/MSCM指紋圖譜中共有20個(gè)峰來(lái)自旋覆花，XDD/MSCM指紋圖譜中共有3個(gè)峰來(lái)自人參，XDD/MSCM指紋圖譜中共有3個(gè)峰來(lái)自生姜，XDD/MSCM指紋圖譜中共有14個(gè)峰來(lái)自甘草，XDD/MSCM指紋圖譜未有峰來(lái)自代赭石、姜半夏、大棗，結(jié)果見圖3。

對(duì)XDD/MSCM進(jìn)行飲片歸屬分析，結(jié)果見表3，XDD/MSCM指紋圖譜中36個(gè)共有峰，經(jīng)對(duì)照品指認(rèn)明確8個(gè)色譜峰，分別為7號(hào)峰甘草苷、14號(hào)峰1,5--二咖啡?？鼘幩?、19號(hào)峰人參皂苷Rg1、20號(hào)峰人參皂苷Re、22號(hào)峰1--乙酰旋覆花內(nèi)酯、25號(hào)峰人參皂苷Rb1、29號(hào)峰甘草酸、30號(hào)峰6-姜辣素，且36個(gè)峰可以在原料飲片中找到明確歸屬，分別為1、3～5、8～17、22～24、26、27、34號(hào)峰來(lái)自旋覆花；19、20、25號(hào)峰來(lái)自人參；30、35、36號(hào)峰來(lái)自生姜；2、6、7、16～18、21、27～29、31～33、35號(hào)峰來(lái)自甘草；其中16、17、27號(hào)峰為旋覆花與甘草所共有，35號(hào)峰為甘草與生姜所共有，表明XDD/MSCM的主要物質(zhì)群均可清晰地追溯到飲片歸屬明確。

從色譜峰個(gè)數(shù)與峰強(qiáng)度看，旋覆花與甘草對(duì)指紋圖譜的貢獻(xiàn)最大，方中人參主要含皂苷類物質(zhì)，為末端吸收，在本指紋圖譜條件下只能檢出3個(gè)色譜峰，生姜主要含揮發(fā)油和姜辣素，在本指紋圖譜條件下只能檢出3個(gè)色譜峰，代赭石是礦物藥，不適用于紫外下檢出，姜半夏主要含淀粉、氨基酸，而且由于經(jīng)過(guò)沸水多次泡洗，其中水溶性成分有不同程度的損失，在水煎液中含量極少，大棗中指標(biāo)性成分齊墩果酸、白樺脂酸等物質(zhì)極性較小，由飲片轉(zhuǎn)移至水煎液的量極少，且多糖、氨基酸類物質(zhì)，在此色譜條件下不能檢出色譜峰。因此，代赭石、姜半夏、大棗3味飲片，為本實(shí)驗(yàn)條件下難以獲得的指紋圖譜信息。

圖3 XDD色譜峰歸屬色譜圖

表3 XDD/MSCM共有峰歸屬

2.7 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的XDD功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)預(yù)測(cè)分析

2.7.1 基于可測(cè)性及可溯性的活性成分篩選 根據(jù)文獻(xiàn)研究，旋覆花為XDD君藥，其主要活性成分為倍半萜及有機(jī)酸類化合物[6]，包含1--乙酰旋覆花內(nèi)酯、旋覆花素及1,5--二咖啡先奎寧酸等成分[7-8]，具有抗腫瘤、抗炎等藥理活性[9-10]；人參的主要活性成分為人參皂苷，包含人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rf等[11-12]，具有抗炎、抗癌、抗抑郁和增強(qiáng)記憶力等作用[13-14]；生姜中含6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚等姜辣素類主要活性成分[15]，具有抗氧化、改善脂質(zhì)代謝、抗炎、抗腫瘤、降血糖等活性[16-17]；甘草的化學(xué)成分以黃酮類和三萜類為主[18]，甘草苷及甘草酸分別具有清熱解毒、抗炎鎮(zhèn)咳的功效[19]；代赭石主要含有鐵元素，是良好的補(bǔ)鐵劑[20]；半夏主含生物堿及氨基酸類[21]；大棗的化學(xué)成分以多糖為主[22]。藥典標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下XDD組方藥味的質(zhì)量控制指標(biāo)為人參中的人參皂苷Rg1、Re、Rb1，生姜中的6-姜辣素，甘草中的甘草苷和甘草酸，另外，旋覆花、代赭石、半夏及大棗無(wú)質(zhì)量控制指標(biāo)，僅以藥典項(xiàng)下的質(zhì)量控制指標(biāo)作為XDD的指標(biāo)選擇難以全面反映復(fù)方的整體特征及療效?；谖墨I(xiàn)研究結(jié)合指紋圖譜的可測(cè)性及可溯性，確定指紋圖譜所指認(rèn)的甘草苷、1,5--二咖啡?？鼘幩?、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、1--乙酰旋覆花內(nèi)酯、人參皂苷Rb1、甘草酸、6-姜辣素等8個(gè)活性成分為候選化合物。通過(guò)Pubchem Compound化合物數(shù)據(jù)庫(kù)（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取8個(gè)候選化合物的Canonical SMILES編號(hào)，為后續(xù)XDD“成分-靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建做準(zhǔn)備。

2.7.2 XDD活性靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將8個(gè)成分的Canonical SMILES號(hào)分別導(dǎo)入Swiss Target Prediction（http:// www.swisstargetprediction.ch/）結(jié)合Drug Bank（https://www.drugbank.ca/）及BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選8個(gè)成分的作用靶點(diǎn)，通過(guò)Uniprot（https://www. uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白和基因信息校正，篩選出物種為“homo sapiens”的靶點(diǎn)，即為8個(gè)成分的潛在靶點(diǎn)，最終獲得8個(gè)化合物共涉及87個(gè)作用靶點(diǎn)蛋白（共計(jì)120次）。

將獲得的87個(gè)靶點(diǎn)蛋白上傳至STRING 11.0在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org），選擇物種為“homo sapiens”，選取最高置信度蛋白交互參數(shù)評(píng)分值＞0.9的蛋白互作數(shù)據(jù)，篩選到49個(gè)靶點(diǎn)，將結(jié)果以TSV文本格式導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，見圖4，并利用Cytoscape 3.7.1軟件中的“Network Analyzer”功能對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，?jì)算選取介數(shù)中心性（betweenness centrality）、接近中心性（closeness centrality）和度值（degree）3個(gè)重要拓?fù)鋮?shù)均大于中位數(shù)的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，經(jīng)篩選得到11個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，見表4，其中度（degree）值最高的STAT3能與16個(gè)蛋白發(fā)生相互作用。

圖4 蛋白-蛋白相互作用 (PPI)網(wǎng)絡(luò)

2.7.3 XDD活性成分京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析 采用David v 6.7數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)49個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG生物通路富集分析，根據(jù)＜0.05、FDR＜0.05篩選出22條，見圖5，包含癌癥通路、花生四乙烯代謝通路、環(huán)磷酸腺苷（cyclic AMP，cAMP）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3-羥激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路及低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信號(hào)通路等，表明49個(gè)靶點(diǎn)可能通過(guò)調(diào)控這些通路發(fā)揮治療疾病效果。

2.7.4 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將篩選到的XDD8個(gè)活性成分、87個(gè)作用靶點(diǎn)、22條信號(hào)通路運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“成分-靶 點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖6。由圖6可知，XDD中8個(gè)活性成分通過(guò)作用于多靶點(diǎn)在不同的信號(hào)通路中發(fā)揮作用，且成分、靶點(diǎn)、通路間存在錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，顯示了中藥復(fù)方治療疾病作用機(jī)制的復(fù)雜性。

表4 PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及其拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)

圖5 XDDKEGG通路富集結(jié)果

2.7.5 整合分析 經(jīng)典名方XDD主治胃虛痰阻氣逆證，具有降逆化痰、益氣和胃的之功，現(xiàn)代藥理研究表明其具有止嘔及抗炎等功效，臨床主要用于治療反流性食管炎[23-24]、膽汁反流性胃炎[25]、頑固性呃逆[26-27]、化療后嘔吐[28]、慢性咽炎[29]、美尼爾綜合征[30]等疾病，本研究基于可測(cè)性及可溯性篩選到甘草苷、1,5--二咖啡?？鼘幩帷⑷藚⒃碥誖g1、人參皂苷Re、1--乙酰旋覆花內(nèi)酯、人參皂苷Rb1、甘草酸、6-姜辣素8個(gè)成分，在網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到87個(gè)潛在靶點(diǎn)，其中置信度蛋白交互參數(shù)評(píng)分值＞0.9的蛋白互作數(shù)據(jù)有49個(gè)靶點(diǎn)，STAT3、PTGS2、JUN、VEGFA、MMP2、MMP9、MMP1、MMP3、HTR1A、PTAFR、STAT1共11個(gè)為關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中藥物可通過(guò)抑制STAT3靶點(diǎn)效應(yīng)以緩解炎性腸病、胃癌等所導(dǎo)致的嘔吐、腹瀉現(xiàn)象[31-32]，PTGS2靶點(diǎn)可作用于血管及神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)而緩解疼痛伴有嘔吐、胃腸道消化不良等狀況[33]，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是一個(gè)蛋白酶家族，MMP1、MMP2、MMP3、MMP9等被視為損傷修復(fù)、癌癥侵襲、血管生成、正常組織重建的重要因子，研究發(fā)現(xiàn)抑制該家族蛋白酶的表達(dá)可改善藥物導(dǎo)致惡心，嘔吐，肝功能異常和血小板減少等副作用的產(chǎn)生[31,34]，以上靶點(diǎn)均與XDD臨床治療的表型相一致。

圖6 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

XDD的主要功效為止嘔、抗炎。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，包含癌癥通路、花生四烯酸代謝通路、cAMP信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路及HIF-1信號(hào)通路等22條通路。通過(guò)對(duì)相關(guān)的通路進(jìn)行整理分析發(fā)現(xiàn)，其中TNF，又稱為TNF-α，是一類具有多種生物效應(yīng)的細(xì)胞因子，有學(xué)者在大鼠急性反流性食管炎模型中證明了由于胃腸反流物的刺激，食管黏膜中TNF-α含量增高，并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞活化進(jìn)而產(chǎn)生活性氧族及脂質(zhì)過(guò)氧化作用，導(dǎo)致食管炎癥反應(yīng)的發(fā)生[35]，符小聰?shù)萚36]研究發(fā)現(xiàn)癌癥通路、癌癥中蛋白多糖通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF及HIF-1信號(hào)通路在XDD治療反流性食管炎中具有重要作用，進(jìn)一步預(yù)測(cè)XDD可通過(guò)以上通路治療反流性食管炎疾??；膽汁反流性胃炎的發(fā)生、發(fā)展與胃黏膜的炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，有研究表示膽汁反流性胃炎患者炎癥因子TNF-α亦處于高水平[37-38]，同時(shí)韓俊玲發(fā)現(xiàn)含旋覆花的中藥復(fù)方一方面直接作用于胃黏膜加強(qiáng)防御功能，亦可通過(guò)調(diào)節(jié)胃黏膜TNF-α的表達(dá)而發(fā)揮胃黏膜保護(hù)作用，對(duì)消除或減輕胃黏膜充血和水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、胃小凹增生以及腸上皮化生有良好的作用[39]，另外，花生四烯酸代謝通路是存在于血小板和胃黏膜上皮細(xì)胞的共同通路，既往研究表明，該通路脂質(zhì)代謝物廣泛參與血小板功能調(diào)控，并與胃黏膜損傷與修復(fù)密切相關(guān)[40]，cAMP與膽汁反流性胃炎的治療效果呈正相關(guān)，其可以促進(jìn)細(xì)胞正常代謝，抑制胃粘膜腸化，增強(qiáng)胃粘膜屏障作用[41]，表明XDD可能通過(guò)TNF-α、花生四烯酸、cAMP等通路治療膽汁反流性胃炎；HIF-1信號(hào)通路是通過(guò)促進(jìn)HIF-1激活與有氧糖酵解中涉及的血管生成，紅細(xì)胞生成和關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)，參與調(diào)節(jié)平滑肌的收縮與舒張，緩解嘔吐癥狀的產(chǎn)生[42]，預(yù)測(cè)其在頑固性呃逆的治療中具有重要作用；PI3K-Akt信號(hào)通路途徑是人類癌癥中最常見的活化異常途徑，病理激活可以通過(guò)多種機(jī)制沿著信號(hào)通路在多個(gè)水平上發(fā)生，包括點(diǎn)突變，擴(kuò)增和腫瘤抑制基因的失活，該途徑也是已知的抗性途徑，因?yàn)樗梢员皇荏w酪氨酸激酶和其他癌癥基因激活，PI3K-Akt抑制劑可下調(diào)PI3K-Akt途徑進(jìn)而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和衰老，促進(jìn)血小板的生成，可以緩解化療后嘔吐等副作用癥狀的發(fā)生[43-45]，可能是XDD治療化療后嘔吐的關(guān)鍵通路。由此可見，XDD中關(guān)鍵效應(yīng)成分可作用于多靶點(diǎn)，干預(yù)多個(gè)通路發(fā)揮止嘔、抗炎的治療效應(yīng)，進(jìn)而治療反流性食管炎、膽汁反流性胃炎、頑固性呃逆等疾病。

基于指紋圖譜及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，這8個(gè)成分具傳遞性及溯源性，且與XDD主治功效相關(guān)，初步預(yù)測(cè)其為XDD止嘔及抗炎的潛在功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)，為XDD的質(zhì)量控制指標(biāo)成分選擇的合理性提供參考依據(jù)。

3 討論

本研究考察了波長(zhǎng)、流動(dòng)相組成、體積流量、柱溫等XDD物質(zhì)基準(zhǔn)HPLC指紋圖譜色譜條件。其中，波長(zhǎng)的選擇是本實(shí)驗(yàn)考慮的重點(diǎn)，XDD的指紋圖譜旨在同一檢測(cè)波長(zhǎng)體現(xiàn)全方的特征，并對(duì)其中的藥味進(jìn)行成分表征，且同一波長(zhǎng)檢測(cè)在單波長(zhǎng)掃描的HPLC上均可方便檢測(cè)，保證了分析方法建立的實(shí)用性，基于現(xiàn)行藥典及文獻(xiàn)梳理，對(duì)XDD/MSCM樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，著重考察了203、237、254、280 nm 4個(gè)條件下的波長(zhǎng)，由于代赭石屬于礦物藥在紫外光譜中沒有特征吸收峰[46]，半夏及大棗中含氨基酸及糖類等大極性分子較多[21,47]、表征難度大，經(jīng)各單味飲片煎液與MSCM樣品對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在203 nm下旋覆花、人參、生姜及甘草指紋輪廓均能得到表征，因此，選擇203 nm作為XDD物質(zhì)基準(zhǔn)的波長(zhǎng)。

XDD/MSCM提取液直接進(jìn)樣，方中人參及生姜色譜峰面積較小，難以達(dá)到檢測(cè)線，若進(jìn)行濃縮則易造成雜質(zhì)殘留，鑒于此原因，選擇以正丁醇萃取，并進(jìn)行5倍濃縮進(jìn)行供試品溶液制備，同時(shí)經(jīng)比對(duì)甲醇、乙醇、正丁醇3種溶劑，色譜峰僅在前3 min出現(xiàn)差異，且甲醇及乙醇制備得到的樣品色譜峰基線不及正丁醇，且考慮到處方中人參占比較低，較低的峰面積在紫外檢測(cè)中容易產(chǎn)生誤差，使得檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，因此最終確定以正丁醇為溶劑，對(duì)樣品進(jìn)行濃縮為供試品制備方法。

通過(guò)建立XDD/MSCMHPLC指紋圖譜，首次全面表征了經(jīng)典名方旋覆代赭湯的整體樣貌，同時(shí)對(duì)比MSCM樣品與各飲片單煎液及缺單味飲片陰性煎液樣品，明晰共有峰的歸屬，在歸屬分析中某些共有峰為多味飲片所共有，進(jìn)一步表明中藥化學(xué)成分及復(fù)方配伍的復(fù)雜性。

同時(shí)將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與指紋圖譜相結(jié)合，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)建立“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，揭示XDD功效關(guān)聯(lián)性的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)，為XDD發(fā)揮止嘔、抗炎作用機(jī)制的闡釋提供了思路，為XDD質(zhì)量控制指標(biāo)成分選擇的合理性進(jìn)行了驗(yàn)證。

本研究所建立的XDD/MSCM HPLC指紋圖譜分析方法，以普適性及科學(xué)性較高的液相色譜為技術(shù)手段，綜合考慮各味飲片的特性，對(duì)復(fù)方整體化學(xué)輪廓進(jìn)行表征，建立XDD/MSCM指紋圖譜質(zhì)量控制方法，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)其止嘔及抗炎的功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，為XDD整體質(zhì)量控制及后續(xù)的制劑開發(fā)與研究奠定基礎(chǔ)，保證制劑產(chǎn)品達(dá)到與原方發(fā)揮臨床療效的內(nèi)在一致性，同時(shí)為經(jīng)典名方的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

方中難以獲得代赭石、姜半夏、大棗色譜峰信息，由于代赭石為礦物藥，姜半夏和大棗分別含氨基酸及多糖類成分，分析難度大，且姜半夏及大棗飲片在中藥復(fù)方的研究中均存在無(wú)法表征的難題，在研究中曾嘗試運(yùn)用薄層色譜進(jìn)行表征，但陰性中均存在干擾，后續(xù)研究計(jì)劃對(duì)代赭石運(yùn)用原子吸收光譜測(cè)定鐵元素，將嘗試對(duì)姜半夏在大極性流動(dòng)相比例中進(jìn)行單獨(dú)摸索以表征其中的氨基酸類成分，對(duì)大棗中的多糖水解及衍生化處理，以體現(xiàn)大棗在復(fù)方中的痕跡，同時(shí)，亦可選取優(yōu)質(zhì)代赭石、半夏、大棗藥材，配合規(guī)范的制備過(guò)程管理，標(biāo)準(zhǔn)化的工藝參數(shù)控制其飲片質(zhì)量，有助于控制XDD質(zhì)量，為經(jīng)典名方XDD的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Predictive analysis of fingerprints and efficacy related substances of classical prescription Xuanfu Daizhe Decoction

SHEN-TU Yin-hong1, LI Huan-huan2, ZHAO Xiao-li2, MAO Jing2, LIN Li2, MAO Chun-qin2, LI Peng3, XU Jin-guo2, LU Tu-lin2

1. Zhejiang Tongjuntang Traditional Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., Tonglu 311500, China 2. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 3. Nanjing Hailing of Chinese Medicine Pharmaceutical Technology Research Co., Ltd., Nanjing 210023, China

Based on fingerprints and network pharmacology, the fingerprint analysis method of Xuanfu Daizhe Decoction (旋覆代赭湯, XDD) is established, and its efficacy related substances are predicted and analyzed, which provides a reference for the quality control of XDD.HPLC method was used to establish the fingerprint analysis method of XDD material standard corresponding material (XDD/MSCM) and the common peaks were matched, at the same time, the attribution analysis of each common peak was performed. The active ingredients of XDD were screened based on literature and fingerprints, and The “component-target-pathway” network was established through network pharmacology, which further supported the rationality of functional components selection for XDD.A method for fingerprint analysis of XDD/MSCM was established. The samples of multiple batches of XDD/MSCM were determined. A total of 36 common peaks were calibrated. Eight chromatographic peaks including liquiritin and 1,5-di--caffeoylquinic acid, ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, 1--acetyl britannilactone, ginsenoside Rb1, glycyrrhizic acid, 6-gingerol could be determined by reference substance. The similarity of the sub-samples were > 0.90, and the 36 common peaks could be clearly assigned to four pieces of Xuanfuhua (), Renshen (et), Shengjiang (), and Gancao (et). The mechanism of eight medicinal ingredients of liquiritin and 1,5-di--caffeoylquinic acid, ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, 1--acetyl britannilactone, ginsenoside Rb1, glycyrrhizic acid, 6-gingerol was predicted by network pharmacology, and the enriched pathway contained phosphatidylinositol- 3-hydroxykinase-protein kinase B (PI3K-Akt) signaling pathway, hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) signaling pathway related to anti-vomiting and anti-inflammatory effects.The fingerprint analysis method of XDD established in this study is stable and feasible. The source of the chromatographic peaks is clarified through the attribution analysis, which provides a reference for the study of subsequent preparations of XDD. In addition, combined with network pharmacology, it was found that eight components were closely related to the efficacy properties of XDD, which could be used as potential efficacy related substances, providing a basis for the rationality of the selection of index components of XDD, and providing a reference for the study of classical formulas.

classical prescription; Xuanfu Daizhe Decoction; fingerprint chrom-atography; network pharmacology; efficacy related substances; quality control; liquiritin; 1,5-di--caffeoylquinic acid; ginsenoside; 1--acetyl britannilactone; glycyrrhizic acid; 6-gingerol;;et;;et; PI3K-Akt; HIF-1

R283.6

A

0253 - 2670(2021)16 - 4825 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.007

2021-03-31

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1707000）；南京市棲霞區(qū)產(chǎn)學(xué)研合作及科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目

申屠銀洪，男，執(zhí)業(yè)中藥師，主要從事中藥及飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究管理。E-mail: st.yh@163.com

許金國(guó)，男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥炮制及中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: 300024@njucm.edu.cn

陸兔林，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制及中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: ltl2021@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]