董麗華 王曉艷 張文婧 李加梅 孫蕾

(日照市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 日照 276800)

自由基增多、脂質(zhì)過(guò)氧化、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)等可導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)，氧化應(yīng)激時(shí)機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧(ROS)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病的重要原因〔1，2〕。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度>200 nt不編碼蛋白的RNA分子，不僅參與了細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激與自由基、細(xì)胞凋亡等，還參與了神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育、功能完善和神經(jīng)系統(tǒng)損傷之后再生過(guò)程〔3，4〕。結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(CCAT)1是最先在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的一種LncRNA，定位于人染色體8q24.21上〔5〕，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)CCAT1表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移，并誘導(dǎo)凋亡〔7〕； CCAT1通過(guò)上調(diào)Livin抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡并增加細(xì)胞活力〔8〕。但CCAT1對(duì)氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)損傷的影響及其機(jī)制還尚不清楚。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3信號(hào)通路是細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中重要的信號(hào)通路，可調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和凋亡，研究發(fā)現(xiàn)維生素B1通過(guò)激活該信號(hào)通路可保護(hù)谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷〔9〕。烏司他丁通過(guò)激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路減輕了大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷〔10〕。但Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷的影響還尚未清楚。研究發(fā)現(xiàn)H2O2可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷〔11〕，因此，本研究用H2O2構(gòu)建PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活性及細(xì)胞凋亡率，測(cè)定丙二醛(MDA)含量變化和超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力。本文初步探討CCAT1在PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中作用，再進(jìn)一步探討CCAT1調(diào)控Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路研究CCAT1的抗氧化機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、過(guò)氧化氫、雷帕霉素(RAPA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒、Trizol試劑、熒光定量試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；二辛可寧酸(BCA)試劑盒、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素V/碘化丙啶(AV-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；MDA試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒、GSH-Px試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；抗體購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司；pcDNA-control、pcDNA-CCAT1載體由武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司構(gòu)建。Thermo FC酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；FACS caliber流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，含5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng)，每天換液1次，生長(zhǎng)至80%時(shí)用0.25%的胰酶消化后傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞處理和分組 用濃度分別為0、100、200、400 μmol/L的H2O2處理PC12細(xì)胞24 h作為不同濃度處理組，以未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為對(duì)照(control)組；將pcDNA-control、pcDNA-CCAT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞中后再用200 μmol/L的H2O2處理PC12細(xì)胞，記為H2O2+pcDNA-control組、 H2O2+pcDNA-CCAT1組；pcDNA-CCAT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞中后用200 μmol/L的H2O2處理PC12細(xì)胞后再用RAPA處理作為H2O2+pcDNA-CCAT1+RAPA組。具體轉(zhuǎn)染步驟按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.3MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后分別加入10 μl 5 mg/ml的MTT溶液，于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；1 000 r/min離心10 min，吸棄培養(yǎng)液，每孔加150 μl的DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。然后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度(A)值。細(xì)胞活性(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)CCAT1表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量使用說(shuō)明配制反應(yīng)體系，CCAT1以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，循環(huán)條件為95℃ 10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。CCAT1正向引物序列：5′-TTTATGCTTGAGCCTGA-3′，反向引物序列：5′-CTTGCCTGAAATACTTGC-3′；β-actin正向引物序列：5′-GGGAAATCGTGCGTACATTAA-3′，反向引物序列：5′-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3′。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化后用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后重懸。按照AV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別加入5 μl AV-FITC和10 μl PI，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm和發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處的熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。測(cè)濃度后上樣，SDS-PAGE 90 min轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉90 min后加入一抗4℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，再用TBST洗滌3次，每次5～10 min，顯影，定影，用Quantity One凝膠分析軟件處理，測(cè)各條帶吸光度值，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶吸光度值/β-actin條帶吸光度值。每個(gè)蛋白樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.7MDA試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒、GSH-Px試劑盒分別檢測(cè)MDA含量和SOD、CAT、GSH-Px活力 收集各組細(xì)胞，去上清，PBS洗3遍，消化，吹打，然后800 r/min離心10 min，得細(xì)胞沉淀，再用PBS洗3遍，吹打均勻后超聲10 min使細(xì)胞裂解，40 r/min離心10 min取上清，用于MDA含量和SOD、CAT、GSH-Px活力的測(cè)定，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.00軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1不同H2O2濃度對(duì)PC12細(xì)胞活力及CCAT1表達(dá)的影響 與0 μmol/L H2O2組相比，不同H2O2濃度組PC12細(xì)胞活力及CCAT1表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，H2O2可降低PC12細(xì)胞活力和CCAT1表達(dá)水平。

表1 不同H2O2濃度對(duì)PC12細(xì)胞增殖及CCAT1表達(dá)的影響

2.2CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與control組相比，H2O2組PC12細(xì)胞CCAT1表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)；與H2O2+pcDNA-control組相比，H2O2+pcDNA-CCAT1組PC12細(xì)胞CCAT1表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，Bcl-2表達(dá)水平顯著升高，Bax表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1，圖2，表2。可見(jiàn)，CCAT1過(guò)表達(dá)可抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

表2 CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖1 CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響

1～4：control組、H2O2組、H2O2+pcDNA-control組、H2O2+pcDNA-CCAT1組；下圖同圖2 CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響 與control組相比，H2O2組PC12細(xì)胞中MDA含量顯著升高，SOD、CAT、GSH-Px活力顯著降低(P<0.05)；與H2O2+pcDNA-control組相比，H2O2+pcDNA-CCAT1組PC12細(xì)胞中MDA含量顯著降低，SOD、CAT、GSH-Px活力顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表3?？梢?jiàn)，CCAT1過(guò)表達(dá)可降低H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。

表3 CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

2.4CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路的影響 與control組相比，H2O2組PC12細(xì)胞中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、STAT3、p-STAT3表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；與H2O2+pcDNA-control組相比，H2O2+pcDNA-CCAT1組PC12細(xì)胞中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、STAT3、p-STAT3表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表4，圖3?？梢?jiàn)，CCAT1過(guò)表達(dá)激活H2O2對(duì)PC12細(xì)胞Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路的抑制。

表4 CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路的影響

圖3 CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路的影響

2.5抑制Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與H2O2+pcDNA-CCAT1組相比，H2O2+pcDNA-CCAT1+RAPA組PC12細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bax表達(dá)水平顯著升高，Bcl2表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4，圖5，表5?？梢?jiàn)，抑制Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增殖促進(jìn)和凋亡抑制的作用。

圖4 抑制Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響

圖5 抑制Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表5 抑制Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.6抑制Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響 與H2O2+pcDNA-CCAT1組相比，H2O2+pcDNA-CCAT1+RAPA組PC12細(xì)胞中MDA含量顯著升高，SOD、CAT、GSH-Px活力顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表6。可見(jiàn)，抑制Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的抑制作用。

表6 抑制Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

3 討 論

機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激平衡狀態(tài)的破壞可造成體內(nèi)生物大分子損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而誘發(fā)包括神經(jīng)性疾病的發(fā)生。因此，降低機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可保護(hù)其引起的細(xì)胞損傷導(dǎo)致的相關(guān)疾病〔12，13〕。SOD、CAT、GSH-Px均是抗氧化酶，SOD是機(jī)體內(nèi)天然清除氧自由基的酶，CAT是一種末端氧化酶，能催化H2O2分解，GSH-Px是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑，也可清除自由基；脂質(zhì)過(guò)氧化物催化裂解產(chǎn)生MDA，MDA對(duì)細(xì)胞具有毒性作用，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，SOD可將MDA還原成H2O2，進(jìn)而被CAT和GSH-Px催化還原為對(duì)人體無(wú)害的水和氧氣，從而維持機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平〔14〕。本研究結(jié)果說(shuō)明H2O2可降低PC12細(xì)胞活力，促進(jìn)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。有研究顯示提高細(xì)胞中SOD、CAT、GSH-Px活性可改善心肌細(xì)胞氧化損傷〔15〕。五味子乙素可降低小鼠腦組織MDA含量，提高CAT、SOD和GSH-Px活性，從而減輕氧化損傷〔16〕。本研究結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)CCAT1可降低H2O2引起的氧化應(yīng)激水平。

有研究報(bào)道顯示右美托咪定通過(guò)上調(diào)CCAT1可保護(hù)肝細(xì)胞免受缺氧或缺血-再灌注損傷〔17〕。CCAT1在雙側(cè)坐骨神經(jīng)慢性收縮損傷大鼠中下調(diào)表達(dá)，上調(diào)CCAT1能減輕神經(jīng)性疼痛〔18〕。本研究結(jié)果說(shuō)明CCAT1過(guò)表達(dá)可抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，保護(hù)H2O2引起的氧化損傷。

Akt是一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)節(jié)點(diǎn)，mTOR是Akt下游的一個(gè)信號(hào)分子，活化的Akt可磷酸化mTOR，mTOR被激活后可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡〔19〕；STAT3可被活化的mTOR激活，活化的STAT3也可調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程〔20〕。有研究發(fā)現(xiàn)三磷酸腺苷可通過(guò)激活A(yù)kt/mTOR/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)〔21〕；miR-99b-5p抑制劑能夠上調(diào)Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)來(lái)修復(fù)損傷的脊髓神經(jīng)元〔22〕。白藜蘆醇可通過(guò)激活JAK2/STAT3和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，保護(hù)大腦缺血再灌注損傷〔23〕。本研究結(jié)果說(shuō)明H2O2可阻斷Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路，而過(guò)表達(dá)CCAT1激活A(yù)kt/mTOR/STAT3信號(hào)通路。且用Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路的抑制劑雷帕霉素處理后可逆轉(zhuǎn)CCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增殖促進(jìn)和凋亡、氧化應(yīng)激水平的抑制作用。結(jié)果表明CCAT1可能通過(guò)調(diào)控Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路影響細(xì)胞增殖、凋亡和氧化應(yīng)激。

綜上，過(guò)表達(dá)CCAT1可促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖、抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，其機(jī)制可能與Akt/mTOR/STAT3信號(hào)通路相關(guān)。