陳鋒 章曉云,2 陳躍平 廖建釗 周毅 李嘉駿 吳煒?shù)h

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2江西中醫(yī)藥大學(xué))

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變鈣化、軟骨下骨重塑、骨贅形成、滑膜炎癥和血管侵襲為特征的慢性退行性疾病〔1～3〕。伴隨全球人口老齡化的不斷發(fā)展，OA發(fā)病率逐年遞增，已成為全球范圍內(nèi)的公共健康問(wèn)題〔4〕。研究表明，OA的發(fā)生與創(chuàng)傷、遺傳、衰老、肥胖等多種因素有關(guān)，但具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前臨床上非手術(shù)治療方法包括口服硫酸氨基葡萄糖、皮質(zhì)類固醇、透明質(zhì)酸鈉、多西環(huán)素和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑等，雖然這些藥物均有不同程度的療效，但均無(wú)法完全阻斷OA的進(jìn)展〔5,6〕；而手術(shù)治療雖能矯正關(guān)節(jié)畸形、改善關(guān)節(jié)功能，但存在術(shù)后感染、血栓和二次手術(shù)等潛在風(fēng)險(xiǎn)〔7,8〕。因此，全面挖掘OA的潛在發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，具有非常重要的意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長(zhǎng)度大于200nt且不能編碼蛋白的RNA。首次發(fā)現(xiàn)時(shí)認(rèn)為其沒(méi)有編碼功能，被定義成遺傳暗物質(zhì)。但近年研究證實(shí)LncRNA在生命活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔9〕。研究表明LncRNA在OA發(fā)展過(guò)程中可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(CeRNA)調(diào)節(jié)微小RNA(miRNA)的表達(dá)模式和生物學(xué)特征〔10～12〕。即LncRNA可以海綿吸附miRNA來(lái)影響信使RNA(mRNA)的表達(dá)，從而參與OA的免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞代謝等生物學(xué)過(guò)程。因此本研究通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘與OA相關(guān)的芯片,借助R語(yǔ)言分析差異基因,并構(gòu)建LncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)來(lái)深入研究LncRNA在CeRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用機(jī)制。

1 資料和方法

1.1篩選OA的相關(guān)芯片 以“Osteoarthritis”、“Genome-wide Expression Profiles”為關(guān)鍵詞，在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與OA相關(guān)的芯片,獲得編號(hào)為GSE51588的芯片矩陣文件和編號(hào)為GPL13497的基因注釋文件,該芯片中包含50個(gè)樣本,包括40例OA患者的關(guān)節(jié)組織和10例健康對(duì)照。

1.2芯片數(shù)據(jù)分析 利用Perl對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因重注釋，并利用R語(yǔ)言校正、分類，limma包對(duì)編碼蛋白質(zhì)的mRNA及LncRNA進(jìn)行差異分析，設(shè)置差異倍數(shù)(FC)>0.5，P<0.05，最后運(yùn)用pheatmap包對(duì)存在差異的LncRNA繪制差異熱圖。

1.3LncRNA、miRNA、mRNA互作預(yù)測(cè) 利用mircode數(shù)據(jù)庫(kù)篩選與差異LncRNA互作的miRNA。再?gòu)墓矓?shù)據(jù)庫(kù)(miRTarBase、TargetScan、miRDB)預(yù)測(cè)與miRNA互作的靶基因，取3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)均能預(yù)測(cè)到的靶基因，與步驟1.2所得的差異mRNA取交集。整合得到LncRNA-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)入Cytoscape繪制CeRNA網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為進(jìn)一步探究OA的Hub基因，將差異基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫(kù)中，限定研究物種為“Homo Sapiens”獲得蛋白互作關(guān)系，設(shè)置連接評(píng)分>0.97，再導(dǎo)出蛋白互作關(guān)系的數(shù)據(jù)文件，選取文件中的node1、node2和連接評(píng)分三列導(dǎo)入到Cytoscape中，最后利用Cytoscape軟件的“Network Analyzer”工具進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并根據(jù)度值篩選出Hub基因。

1.5Hub基因與核心LncRNA的相關(guān)性分析 選取CeRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中度值最高的LncRNA與其互作的Hub基因，保留各自對(duì)應(yīng)的疾病組數(shù)據(jù)，利用R語(yǔ)言對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正后，設(shè)置相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值>0.4，P<0.01，最后運(yùn)用limma包對(duì)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因繪圖。

1.6GO與KEGG富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能富集分析，研究OA的主要生物功能；對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，研究OA的主要信號(hào)通路，P<0.05代表富集結(jié)果顯著。最后利用R語(yǔ)言繪制GO和KEGG富集分析氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1差異mRNA及LncRNA 利用R語(yǔ)言對(duì)芯片進(jìn)行基因重注釋和數(shù)據(jù)校正后，再對(duì)其進(jìn)行差異分析。結(jié)果顯示，與健康對(duì)照者相比，OA患者的膝關(guān)節(jié)組織中共存在3 292個(gè)明顯改變的mRNA，其中上調(diào)1 476個(gè)，下調(diào)1 816個(gè)；共存在67個(gè)明顯改變的LncRNA，其中上調(diào)45個(gè)，下調(diào)22個(gè)。在上調(diào)和下調(diào)的LncRNA中分別選取最顯著的5個(gè)來(lái)繪制差異熱圖，見(jiàn)圖1。

圖1 差異LncRNA在不同樣本中的表達(dá)

2.2CeRNA網(wǎng)絡(luò) 利用mircode等數(shù)據(jù)庫(kù)共預(yù)測(cè)到208個(gè)miRNA和1 936個(gè)mRNA，將預(yù)測(cè)到的mRNA與芯片中的3 292個(gè)差異mRNA取交集，再刪除不在該互作關(guān)系中的miRNA、LncRNA，整合后得到LncRNA-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)。將該網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape中繪制CeRNA網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。網(wǎng)絡(luò)中共包括310個(gè)節(jié)點(diǎn)(54個(gè)LncRNA節(jié)點(diǎn)、38個(gè)miRNA節(jié)點(diǎn)、218個(gè)mRNA節(jié)點(diǎn))和1 085條邊，每條邊表示LncRNA與miRNA、miRNA與mRNA之間的關(guān)系。該網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5位的LncRNA為鉀電壓門(mén)控通道亞家族Q成員1反義鏈(KCNQ1OT)1、X 染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄本基因(XIST)(度值36)、反義Opa反應(yīng)蛋白5RNA1 (OIP5-AS)1(度值33)、淋巴細(xì)胞白血病缺失基因(DLEU)1(度值27)、慢性淋巴細(xì)胞白血病上調(diào)(CLLU)1(度值27)。

圖2 CeRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.3PPI網(wǎng)絡(luò) 借助String數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。圖中共包含30個(gè)節(jié)點(diǎn)、41條邊，其中節(jié)點(diǎn)代表蛋白基因，邊則代表蛋白基因間的互作關(guān)系，節(jié)點(diǎn)大小及顏色深淺表示其度值的大小，節(jié)點(diǎn)越大相應(yīng)的度值越大，顏色由黃變橙相應(yīng)的度值則由小變大，邊的粗細(xì)反映連接評(píng)分，邊越粗，評(píng)分越高。度值排名前5的蛋白基因?yàn)樾盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活劑(STAT)3(度值6)、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白(GRB)2(度值6)、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)1(度值6)、叉頭家族(FOX)O3(度值5)、原癌基因MYC(度值5)。這些度值較大的蛋白基因在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵的作用，為該網(wǎng)絡(luò)的Hub基因。

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.4共表達(dá)結(jié)果 選取CeRNA中度值最高的LncRNA(KCNQ1OT1、XIST)與Hub基因(STAT3、GRB2、MAPK1、FOXO3、MYC)分析其表達(dá)的相關(guān)性。除XIST與MAPK1之間呈正相關(guān)，其余均呈負(fù)相關(guān)，選取負(fù)相關(guān)部分存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)據(jù)進(jìn)行展示，見(jiàn)圖4。

圖4 共表達(dá)結(jié)果

2.5GO富集分析和KEGG富集分析 為探究更具體的功能模式,利用DAIVD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中的218個(gè)差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO富集分析共得到237個(gè)條目,KEGG富集分析共得到45條信號(hào)通路,根據(jù)P值排序,選取P值最顯著的前20個(gè)條目以氣泡圖的形式展現(xiàn),見(jiàn)圖5。圖中橫坐標(biāo)為該通路富集的基因占人體總基因的比例，氣泡越大代表該通路富集的基因數(shù)越多，顏色越紅則代表富集程度越顯著。分析結(jié)果顯示,骨關(guān)節(jié)炎的生物過(guò)程主要包括對(duì)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、肌細(xì)胞的增殖等；信號(hào)通路主要涉及PI3K-AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路等。

圖5 GO和KEGG信號(hào)通路可視化結(jié)果

3 討 論

在OA的研究過(guò)程中，針對(duì)骨代謝、基質(zhì)降解、氧化應(yīng)激和免疫炎癥反應(yīng)等方面的治療均已應(yīng)用于臨床，但其療效并不理想〔13〕。而LncRNA在介導(dǎo)OA發(fā)病機(jī)制中起著重要調(diào)控作用，通過(guò)基因測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在軟骨分化過(guò)程中表達(dá)量發(fā)生改變的LncRNA高達(dá)數(shù)千個(gè)〔14,15〕。因此，深入研究LncRNA在OA發(fā)生發(fā)展中的作用及其調(diào)控機(jī)制意義重大。

本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合DAVID功能富集分析軟件，通過(guò)生物信息技術(shù)篩選調(diào)控差異表達(dá)miRNA的上游LncRNA及miRNA作用的下游靶基因，旨在探討OA發(fā)展中LncRNA表現(xiàn)出的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模式。CeRNA網(wǎng)絡(luò)分析得出有54個(gè)LncRNA、38個(gè)miRNA和218個(gè)mRNA與OA發(fā)生發(fā)展相關(guān)。對(duì)差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行GO和KEGG富集分析，得出這些基因所富集的功能主要包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控、營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、肌細(xì)胞的增殖等生物學(xué)過(guò)程，涉及PI3K-AKT、MAPK、mTOR等信號(hào)通路，這些通路在OA發(fā)生發(fā)展中均起著重要的作用〔16〕。

通過(guò)分析共得到5個(gè)關(guān)鍵LncRNA(KCNQ1OT1、XIST、OIP5-AS1、DLEU1、CLLU1)，與之互作的mRNA在GO和KEGG通路分析中均顯示與OA高度相關(guān)。這些結(jié)果表明，在OA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，上述LncRNA可能發(fā)揮著重要作用。研究表明，KCNQ1OT1與miR-200a存在潛在結(jié)合位點(diǎn)，而在CeRNA網(wǎng)絡(luò)中Hub基因FOXO3又是miR-200a的潛在靶基因。KCNQ1OT1可通過(guò)作用miR-200a影響FOXO3的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞自噬、衰老、凋亡和炎癥反應(yīng)等〔17〕；XIST在細(xì)胞增殖、分化和基因組維持中起著關(guān)鍵作用，研究表明降低XIST的表達(dá)，可顯著降低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的增殖和遷移能力，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生〔18～20〕。研究表明沉默OIP5-AS1能顯著抑制細(xì)胞增殖活性，通過(guò)上調(diào)OIP5-AS1可調(diào)節(jié)miR-410的表達(dá)，并進(jìn)一步調(diào)控靶基因KLF10，從而介導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖〔21,22〕；DLEU1和CLLU1可在轉(zhuǎn)錄中、轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳等方面調(diào)控基因的表達(dá)，參與膠質(zhì)瘤、骨肉瘤、宮頸癌等疾病的發(fā)展進(jìn)程，但其在OA中的潛在作用尚無(wú)相關(guān)研究，這就為今后通過(guò)作用DLEU1和CLLU1治療OA提供新的方向和線索〔23,24〕。

本研究結(jié)果說(shuō)明OA的作用機(jī)制無(wú)法依靠某個(gè)特定靶點(diǎn)來(lái)調(diào)控，且各基因間存在錯(cuò)綜復(fù)雜的互作關(guān)系：LncRNA與miRNA結(jié)合，通過(guò)隔離mRNA而下調(diào)miRNA的結(jié)合，最終促進(jìn)mRNA的表達(dá)。STAT3是一類參與成骨細(xì)胞增殖、分化、炎癥和免疫反應(yīng)的特異性基因，通過(guò)激活STAT3信號(hào)通路不僅能刺激MSC成骨分化，還參與Cdc42等生物因子介導(dǎo)的軟骨損傷過(guò)程。這表明STAT3在OA的軟骨下骨硬化和軟骨損傷過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，因此抑制STAT3表達(dá)是阻止關(guān)節(jié)損傷進(jìn)入不可逆階段的重要干預(yù)措施,對(duì)治療OA意義重大〔25,26〕；GRB2作為一種銜接蛋白，經(jīng)研究證實(shí)與PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)存在密切關(guān)聯(lián)，沉默GRB2能夠抑制上述通路的活化，進(jìn)而減少組織的炎性浸潤(rùn)發(fā)揮保護(hù)作用，GRB2有望成為OA治療的重要靶點(diǎn)〔27〕；MAPK1參與了細(xì)胞增殖分化、應(yīng)激反應(yīng)等活動(dòng)，在細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用〔28〕；MYC作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控CyclinD1、CyclinE及P27等細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，與軟骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡密切相關(guān)〔29〕。本研究表明通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK1、FOXO3及MYC水平減少細(xì)胞凋亡，并通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3及GRB2表達(dá)，降低炎癥因子等物質(zhì)的水平，從而改善OA的炎癥癥狀及軟骨退變情況。這些特異性指標(biāo)蛋白的篩選可為進(jìn)一步研究OA的臨床或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供可靠的檢測(cè)指標(biāo)，不僅能有效縮短實(shí)驗(yàn)周期，還可降低實(shí)驗(yàn)成本。但闡明LncRNA-miRNA-mRNA間的互作關(guān)系及LncRNA在OA中的作用機(jī)制是未來(lái)研究的重點(diǎn)。