譚忠 賀延斌 李篤竽

(海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心，海南 ?？?570206)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)屬于腦損傷外在的表現(xiàn)，指患者手術(shù)后發(fā)生思維和記憶障礙，嚴(yán)重影響預(yù)后轉(zhuǎn)歸和生活質(zhì)量，尤以患者的POCD癥狀為重〔1〕。研究表明，POCD的發(fā)生與機(jī)體氧化應(yīng)激的水平過高關(guān)系密切〔2〕。右美托咪定是腎上腺素受體激動(dòng)劑，其有劑量依賴性鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用，其有遏制氧化應(yīng)激的功效〔3，4〕。研究表明，右美托咪定可減輕患者圍術(shù)期炎性反應(yīng)〔5，6〕。自噬是細(xì)胞進(jìn)化過程中高度保守的、用于降解和回收利用細(xì)胞內(nèi)受損傷或衰老的細(xì)胞器及一些生物大分子的過程，以維持細(xì)胞自身的穩(wěn)定，與機(jī)體多種生理和病理生理過程關(guān)系密切。前期研究表明，自噬水平升高可能參與腦損傷過程。本文研究全身麻醉輸注右美托咪定對(duì)患者神經(jīng)外科手術(shù)后的氧化應(yīng)激和認(rèn)知功能及自噬水平的影響，探討其減輕腦損傷的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 篩選2017年1月至2018年12月而且在全身麻醉下?lián)衿谛猩窠?jīng)外科手術(shù)的老年受試者60例。入組標(biāo)準(zhǔn)：① 60～70歲患者；②在全身麻醉下?lián)衿谛猩窠?jīng)外科手術(shù)，術(shù)中切除腦組織病灶者(試驗(yàn)所需腦組織樣本從手術(shù)過程中病情需要切除的腦組織的標(biāo)本塊中獲得)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前認(rèn)知功能異常者；②酗酒史者；③藥物濫用史者；④嚴(yán)重肝腎疾病者；⑤全身麻醉禁忌證者；⑥視聽缺陷者；⑦精神病患者。倫理學(xué)考量：①簽署知情同意書；②保護(hù)受試者的隱私權(quán)；③遵循《渥太華工作組關(guān)于臨床試驗(yàn)注冊(cè)的聲明》。

1.2分組 2×2析因設(shè)計(jì)：即所在用藥因素(2水平：右美托咪定、生理鹽水)和手術(shù)時(shí)程因素(2水平：1～2 h、>2且≤4 h)的所有組合(共4組各15例)。

1.3方法 受試者禁食8 h，禁飲4 h，術(shù)前 30 min肌注阿托品 0.5 mg。入手術(shù)室后，行常規(guī)監(jiān)測(cè)，面罩吸氧(氧流量2 L/min)，開放外周靜脈，靜脈注射順式阿曲庫銨0.2 mg/kg及芬太尼2 μg/kg，異丙酚1.5 mg/kg，3 min后行氣管插管，行機(jī)械通氣，吸入七氟烷0.6最高容許濃度(MAC)維持全身麻醉。術(shù)中持續(xù)泵注右美托咪定注射液(批號(hào)：13082012，江蘇 恒瑞制藥有限公司)，其以2 g/(kg·h)劑量注射10 min后以0.4 g/(kg·h)的速度維持至術(shù)畢。

1.4檢測(cè)外周血中超氧化物歧化酶(SOD) 術(shù)后第3天，采集外周靜脈血5 ml，3 000 r/min 離心10 min置-80℃保存。使用人SOD酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定試劑盒(北京方程佰金科技有限公司)利用ELISA檢測(cè)SOD含量。

1.5檢測(cè)活性氧(ROS)的含量 術(shù)后第3天，采集外周靜脈血5 ml，血液樣本經(jīng)3 000 r/min 離心10 min后取血清，放保存-80℃冰箱保存。ROS濃度嚴(yán)格按照Fenton ROS ELISA試劑盒操作規(guī)程檢測(cè)，使用蒸餾水調(diào)定零點(diǎn)，測(cè)定吸光度值，計(jì)算ROS 的濃度。

1.6檢測(cè)腦組織中神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的含量 取腦組織樣本0.5 cm3，經(jīng)3 000 r/min 離心10 min后取上清液，-80℃冰箱保存。NSE的含量嚴(yán)格按照Fenton NSE ELISA 試劑盒操作規(guī)程檢測(cè)，使用蒸餾水調(diào)定零點(diǎn)，測(cè)定吸光度值，計(jì)算NSE的濃度。

1.7檢測(cè)腦組織中自噬標(biāo)記性分子(LC3Ⅱ)的含量 取腦組織樣本0.5 cm3，經(jīng)3 000 r/min 離心10 min后取上清液，-80℃冰箱保存。LC3Ⅱ的含量嚴(yán)格按照Fenton LC3Ⅱ ELISA 試劑盒操作規(guī)程檢測(cè)，使用蒸餾水調(diào)定零點(diǎn)，測(cè)定吸光度值，計(jì)算LC3Ⅱ的濃度。

1.8使用Rey聽覺性語詞學(xué)習(xí)測(cè)驗(yàn)(AVLT)〔7〕進(jìn)行神經(jīng)心理學(xué)評(píng)估 術(shù)后第3天，使用Rey聽覺性語詞學(xué)習(xí)測(cè)驗(yàn)進(jìn)行早期神經(jīng)心理學(xué)評(píng)估，其是國際POCD研究協(xié)作組推薦的檢測(cè)POCD的4 類測(cè)驗(yàn)。

1.9使用貝克抑郁量表(BDI)〔8〕行神經(jīng)心理學(xué)評(píng)估 術(shù)后第3天，使用BDI進(jìn)行早期神經(jīng)心理學(xué)評(píng)估，正常分值為10分，11～15分為輕度抑郁，>15且≤25分為抑郁，>25分為嚴(yán)重抑郁。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1受試者外周血SOD含量 使用右美托咪定者較生理鹽水者外周血SOD含量高(P=0.019)；手術(shù)時(shí)程因素對(duì)受試者的外周血SOD含量無明顯影響(P=0.141)；兩因素間無交互作用(F= 4.625，P=0.269)。見表1。

表1 受試者外周血SOD、ROS含量比較

2.2ROS的含量 使用右美托咪定者較外周血ROS含量明顯低于生理鹽水者(P=0.023)；手術(shù)時(shí)程因素對(duì)受試者的外周血ROS含量無明顯影響(P=0.139)；兩因素間無交互作用(F=5.936，P=0.095)。見表1。

2.3受試者腦組織NSE比較 使用右美托咪定者腦組織NSE含量明顯低于生理鹽水者(P=0.014)；手術(shù)時(shí)程因素對(duì)受試者的腦組織NSE含量無明業(yè)影響(P=0.061)；兩因素間無交互作用(F=9.074，P=0.072)。見表2。

表2 患者腦組織NSE、IC3Ⅱ含量比較

2.4受試者腦組織LC3Ⅱ含量的比較 使用右美托咪定者較腦組織LC3Ⅱ含量明顯低于生理鹽水者(P=0.009)；手術(shù)時(shí)程因素對(duì)受試者的腦組織LC3Ⅱ含量無明顯影響(P=0.208)；兩因素間無交互作用(F=22.871，P=0.126)。見表2。

2.5Rey聽覺性語詞學(xué)習(xí)測(cè)驗(yàn) 使用右美托咪定者較生理鹽水者Rey聽覺性語詞學(xué)習(xí)測(cè)驗(yàn)分值明顯低(P=0.019)；手術(shù)時(shí)程因素對(duì)受試者的Rey聽覺性語詞學(xué)習(xí)測(cè)驗(yàn)分值無明顯影響(P=0.091)；兩因素間無交互作用(F=2.625，P=0.119)。見表3。

表3 受試者Rey聽覺性語詞學(xué)習(xí)及BDI測(cè)驗(yàn)(分，

2.6BDI量表測(cè)驗(yàn) 使用右美托咪定者較BDI量表測(cè)驗(yàn)分值明顯低于生理鹽水者(P=0.023)；手術(shù)時(shí)程因素對(duì)受試者的BDI量表測(cè)驗(yàn)分值無明顯影響(P=0.118)；兩因素間無交互作用(F=5.906，P=0.065)。

3 討 論

手術(shù)創(chuàng)傷可以誘發(fā)自由基明顯增多。手術(shù)屬于強(qiáng)應(yīng)激，其能造成線粒體受損；手術(shù)過程中，容易形成細(xì)胞因子瀑布，誘發(fā)呼吸爆發(fā)；機(jī)體外周血中兒茶酚胺濃度上調(diào)，其可啟動(dòng)自身氧化。手術(shù)作為強(qiáng)應(yīng)激刺激，其誘發(fā)的氧化應(yīng)激可能夠造成神經(jīng)元Glu濃度顯著升高，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性毒性，最終使得腦功能發(fā)生不同程度障礙，患者即表現(xiàn)為認(rèn)知功能損傷〔9，10〕。究其原因，神經(jīng)元耗費(fèi)與其重量完全不成比例的大量氧氣〔11〕，而且神經(jīng)元中含有大量不飽和脂肪酸，所以神經(jīng)元對(duì)自由基的攻擊非常敏感〔12〕。ROS除了能夠直接引起神經(jīng)元氧化損傷外，其還可以通過造成蛋白質(zhì)巰基的氧化，進(jìn)而抑制神經(jīng)元正常攝取興奮性氨基酸(EAA)〔13〕，導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性毒性，其抑制細(xì)胞質(zhì)膜上Na+-K+-ATP酶活性，使神經(jīng)元發(fā)生過度興奮。此外，ROS還導(dǎo)致神經(jīng)元線粒體膜電位下降，使得神經(jīng)元內(nèi)的DNA發(fā)生氧化，最終造成細(xì)胞凋亡〔14〕甚或死亡。

右美托咪定是 α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，可作用于交感神經(jīng)調(diào)控兒茶酚胺等的釋放，從而抑制手術(shù)的應(yīng)激反應(yīng)。右美托咪定可抑制氧自由基的生成，從而遏制機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)〔15～17〕。本研究顯示，患者神經(jīng)外科手術(shù)中使用右美托咪定者的氧化應(yīng)激水平較低和認(rèn)知功能較佳，SOD主要清除超氧陰離子來完成，而手術(shù)應(yīng)激會(huì)引起機(jī)體抗氧化酶活性的下降。本研究結(jié)果表明，右美托咪定能夠清除自由基，保護(hù)細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜，維持細(xì)胞能量代謝平衡和細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)正常，減少神經(jīng)元興奮性毒性損傷造成的腦功能障礙。此外，右美托咪定能夠降低神經(jīng)元的氧代謝率、拮抗氧化反應(yīng)〔18〕，而且其可以抑制神經(jīng)元凋亡過程的啟動(dòng)，從而減輕神經(jīng)元缺血-再灌注損傷。

LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母ATG8基因的同源物，位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體形成〔17〕。LC分為LC3 Ⅰ和LC3 Ⅱ，自噬未發(fā)生時(shí)細(xì)胞內(nèi)LC3經(jīng)加工形成胞質(zhì)可溶性LC3 Ⅰ常規(guī)表達(dá)。自噬發(fā)生時(shí)LC3 Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾過程與自噬膜表面的脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3 Ⅱ，LC3 Ⅱ位于自噬體膜上，其含量與自噬泡數(shù)量呈正比，因此LC3Ⅱ的表達(dá)與自噬水平密切相關(guān)〔18〕。本研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)創(chuàng)傷后受試者腦組織LC3 Ⅱ表達(dá)增強(qiáng)，即手術(shù)后患者的自噬水平增強(qiáng)。缺血、缺氧可誘發(fā)受試動(dòng)物神經(jīng)元自噬水平升高，如缺少自噬形成的必要基因At97則神經(jīng)元死亡可被阻止。本研究結(jié)果表明，使用右美托咪定對(duì)受試者的腦組織LC3 Ⅱ表達(dá)具有顯著影響，即使用右美托咪定者較生理鹽水者腦組織LC3 Ⅱ表達(dá)低。這說明右美托咪定可抑制創(chuàng)傷引起的神經(jīng)元LC3 Ⅱ表達(dá)上調(diào)，提示右美托咪定減輕圍術(shù)期腦損傷的機(jī)制與抑制神經(jīng)元自噬有關(guān)。

綜上，全身麻醉輸注右美托咪定降低患者神經(jīng)外科手術(shù)后的氧化應(yīng)激并改善其認(rèn)知功能，而且右美托咪定減輕圍術(shù)期腦損傷的機(jī)制可能與抑制神經(jīng)元自噬有關(guān)。