敖雪仁 廖 聰 馬凱敏 沈國(guó)喜

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院外科，廣東廣州 510385

甲狀腺癌來(lái)源于甲狀腺上皮細(xì)胞，是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一[1-2]。全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，2018 年全球甲狀腺癌的診斷患者約占全部癌癥的3.2%[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）PANDAR 是一種新型LncRNA，在多種癌癥中均有高表達(dá)，如舌鱗狀細(xì)胞癌、胃癌等[4-5]。有研究顯示，LncRNA PANDAR 在人類癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，具有多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及侵襲、誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞基因再編輯等[6]。微小RNA（microRNA，miRNA）具有多種生物學(xué)功能，如與靶基因mRNA 互補(bǔ)結(jié)合進(jìn)而抑制其基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)翻譯，進(jìn)而在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、分化、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程[7]。miR-637 在多種腫瘤組織中均表達(dá)下調(diào)，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌等[8-9]，可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有一定抑癌作用。因此，本研究分析兩個(gè)指標(biāo)在甲狀腺癌中的表達(dá)及其與患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，為患者治療提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年1 月至2017 年2 月于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院住院治療的甲狀腺癌患者82例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理診斷甲狀腺癌；②首次患?。虎叟R床病理資料完整并接受隨訪，且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有同系統(tǒng)其他相關(guān)疾病，如甲狀腺功能減退癥等；②患有重要臟器疾病，如冠心病等；③患有其他惡性腫瘤。

1.2 研究方法

收集術(shù)中獲取的甲狀腺癌組織及癌旁正常組織（距腫瘤組織邊緣超過(guò)5 cm，經(jīng)病理證實(shí)），冷凍保存并立即送檢。取100 mg 組織標(biāo)本，應(yīng)用TRIzol 法提取總RNA（試劑盒購(gòu)于Biosharp 公司，貨號(hào)：20160911），使用紫外分光光度儀檢測(cè)RNA 濃度，符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA 凍存?zhèn)溆?。使用RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)于日本TaKaRa 公司，貨號(hào)：20141112）將提取出的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系：Enzyme Mix 1 μl、5×RT Buffer 4 μl、Primer Mix 4 μl、ddH2O 11 μl，共20 μl 體系；反應(yīng)條件：37℃60 min，90℃30 s。以cDNA 為模板，使用PCR 擴(kuò)增試劑盒（購(gòu)于蘇州泓迅生物科技股份有限公司，貨號(hào)：20151107）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，所有引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成，LncRNA PANDAR 正向引物：5’-CTGTTAAGGTGGTGGCATTG-3’，反向引物：5’-GGAGGCTCATACTGGCTGAT-3’；內(nèi)參GAPDH 正向引物：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，反向引物：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；miR-637 正向引物：5’-AGCCCACACACTACAGGCA-3’，反向引物：5’-GCACAAAAGCAGTACGACCT-3’；內(nèi)參U6 正向引物：5’-CCACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3’，反向引物：5’-ACTCCGACCTTCACCTTCCC-3’；反應(yīng)體系：10 μl 2×SYBR Green，1 μl 20×TaqDNA 聚合酶，上下游引物各0.5 μl和8 μl ddH2O。qPCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，55℃變性1 min，72℃延伸10 s，共40 個(gè)循環(huán)。最后結(jié)果以2-ΔΔCt來(lái)計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)化LncRNA PANDAR 與miR-637的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo)

比較甲狀腺癌組織與癌旁正常組織中LncRNA PANDAR 與miR-637的表達(dá)，分析二者間的相關(guān)性；分析甲狀腺癌組織中LncRNA PANDAR 與miR-637與臨床病理特征的關(guān)系；以LncRNA PANDAR的表達(dá)中位數(shù)3.24 為臨界值，分為L(zhǎng)ncRNA PANDAR 高表達(dá)組43例，LncRNA PANDAR 低表達(dá)組39例，以miR-637的表達(dá)中位數(shù)5.13 為臨界值，分為miR-637高表達(dá)組44例和miR-637 低表達(dá)組38例，從患者出院日起，每1～3 個(gè)月隨訪1 次，包括門診或電話兩種隨訪方式，隨訪時(shí)間為3～36 個(gè)月，隨訪至終止時(shí)間或患者死亡，隨訪時(shí)間截止至2020 年2 月。比較高、低表達(dá)組患者預(yù)后3 年生存率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 線性相關(guān)分析，采用Kaplan-Meier檢驗(yàn)分析LncRNA PANDAR、miR-637 與患者預(yù)后的關(guān)系。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA PANDAR 與miR-637的表達(dá)及相關(guān)性分析

甲狀腺癌組織中LncRNA PANDAR的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織，miR-637的相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織（P ＜0.05）。見表1。Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，LncRNA PANDAR 與miR-637的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.634，P ＜0.05）。見表1。

表1 癌組織及癌旁組織LncRNA PANDAR與miR-637的相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表1 癌組織及癌旁組織LncRNA PANDAR與miR-637的相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：LncRNA：長(zhǎng)鏈非編碼RNA；miR-637：微小RNA-637

2.2 甲狀腺癌組織中LncRNA PANDAR 及miR-637與臨床參數(shù)的關(guān)系

甲狀腺癌組織中LncRNA PANDAR、miR-637的表達(dá)與腫瘤TNM 分期、淋巴轉(zhuǎn)移、細(xì)胞分化程度有關(guān)（P ＜0.05），與患者性別、年齡、病理類型、病灶特點(diǎn)及腫瘤直徑無(wú)關(guān)（P ＞0.05）。見表2。

表2 甲狀腺組織中LncRNA PANDAR 及miR-637與臨床參考的關(guān)系（±s）

表2 甲狀腺組織中LncRNA PANDAR 及miR-637與臨床參考的關(guān)系（±s）

注：LncRNA：長(zhǎng)鏈非編碼RNA；miR-637：微小RNA-637

2.3 LncRNA PANDAR、miR-637表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

82例甲狀腺癌患者均隨訪成功，無(wú)失訪患者。隨訪3 年內(nèi)，共有16例患者死亡。LncRNA PANDAR 高表達(dá)組3 年總體生存率（overall survival，OS）為69.77%（30/43），LncRNA PANDAR 低表達(dá)組3 年OS 為92.31%（36/39），Kaplan-Meier 分析顯示，LncRNA PANDAR高表達(dá)組3 年OS 低于LncRNA PANDAR 低表達(dá)組（χ2=5.726，P=0.032）。miR-637 高表達(dá)組3 年OS為86.36%（38/44），miR-637 低表達(dá)組3 年OS 為73.68%（28/38），Kaplan-Meier 分析顯示，兩組患者3 年生存率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.710，P=0.059）。見圖1。

圖1 不同表達(dá)LncRNA PANDAR、miR-637 患者3 年生存率

3 討論

LncRNA 是一個(gè)長(zhǎng)度約為200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄本[10-11]。最近的研究顯示，LncRNA 在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，如胃癌、乳腺癌等[12-13]，通過(guò)影響、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。LncRNA PANDAR 是CDKN1A 反義DNA 損傷激活RNA的啟動(dòng)子，染色體位置為6p21.2，是近些年來(lái)的研究熱點(diǎn)。有研究顯示，乳腺癌組織中LncRNA PANDAR表達(dá)上調(diào)，其可通過(guò)促進(jìn)p16（INK4A）的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移等過(guò)程的發(fā)生[14]。同時(shí)，LncRNA PANDAR 在膀胱癌組織中也呈高表達(dá)狀態(tài)，且LncRNA PANDAR的上調(diào)與腫瘤分期、淋巴轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)[15]。本研究顯示，LncRNA PANDAR 在甲狀腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，并且LncRNA PANDAR表達(dá)與甲狀腺癌患者TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞分化程度相關(guān)，提示LncRNA PANDAR 可能參與了甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。LncRNA PANDAR 可通過(guò)上調(diào)波形蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和MMP9的表達(dá)，下調(diào)E-鈣黏蛋白表達(dá)來(lái)促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，進(jìn)而提升腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)了腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展[16-17]。此外，LncRNA PANDAR 還可以激活腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子信號(hào)通路PI3K/AKT，上調(diào)PI3K的表達(dá)，刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，上調(diào)B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2 基因（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，減少腫瘤細(xì)胞的凋亡數(shù)量，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及分化，提高腫瘤細(xì)胞的惡性程度，進(jìn)而影響甲狀腺癌的進(jìn)展[18]。

miRNA 是一種長(zhǎng)度約為20 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可以與靶基因mRNA的3’UTR 區(qū)結(jié)合，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)程，進(jìn)而參與細(xì)胞生理過(guò)程[19-20]。異常表達(dá)的miRNA 可影響多種生物學(xué)過(guò)程，如表達(dá)異常的miRNA 可以以原癌基因的形式促進(jìn)腫瘤的形成[21]。miR-637 是較早發(fā)現(xiàn)的miRNA 之一，位于染色體19p13.3，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如miR-637 可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄激活因子3 進(jìn)而抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展[22]。本研究結(jié)果顯示，miR-637 在甲狀腺癌組織中表達(dá)降低，并與細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM 分期相關(guān)，初步顯示miR-637 在甲狀腺癌細(xì)胞增殖、分化病理過(guò)程中發(fā)揮作用。AKT1 是P13K/Akt 信號(hào)通路中的上游蛋白，其磷酸化過(guò)程激活了該通路并調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。已有研究證實(shí)，miR-637 可直接與AKT1的3’-UTR 結(jié)合，介導(dǎo)AKT1的降解并下調(diào)其表達(dá)水平，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄因子Foxo1、細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，最終抑制了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程，抑制了腫瘤的惡性進(jìn)展[23]。此外，miR-637 還可抑制Bcl-2 并上調(diào)促凋亡因子Bax的表達(dá)，提示其亦具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能，有顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及向周圍組織轉(zhuǎn)移的能力[24-25]。

Kaplan-Meier 生存曲線分析結(jié)果顯示，LncRNA PANDAR 低表達(dá)組術(shù)后3 年生存率高于LncRNA PANDAR 高表達(dá)組，而不同表達(dá)水平的miR-637 對(duì)患者術(shù)后3 年生存率無(wú)明顯影響。初步證實(shí)了LncRNA PANDAR 與甲狀腺癌患者術(shù)后不良預(yù)后相關(guān)，具有作為預(yù)測(cè)甲狀腺癌患者預(yù)后的潛能。本研究結(jié)果還顯示，LncRNA PANDAR 與miR-637 呈負(fù)相關(guān)，LncRNA PANDAR 可激活信號(hào)通路PI3K/AKT，上調(diào)PI3K 及AKT的表達(dá)，從而對(duì)腫瘤的發(fā)展起到了促進(jìn)作用[18]，而miR-637 卻可抑制PI3K/AKT 通路中的蛋白AKT1的表達(dá)，提示miR-637 對(duì)PI3K/AKT 信號(hào)通路亦具有一定的抑制作用[23]，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及分化過(guò)程，因此推測(cè)LncRNA PANDAR 與miR-637 具有負(fù)相關(guān)性，但是具體的作用機(jī)制還需在后續(xù)細(xì)胞水平進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，甲狀腺癌組織中LncRNA PANDAR呈高表達(dá)、miR-637 呈低表達(dá)，與細(xì)胞分化程度、腫瘤TNM 分期及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，檢測(cè)兩個(gè)指標(biāo)的表達(dá)有助于甲狀腺癌患者病情的判斷。