曾 東 牛 嬌 李長(zhǎng)義 常 津 牛光良▲

1.北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京 100039；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西太原 030001；3.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院，天津 300070；3.天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院納米醫(yī)學(xué)研究所，天津 300072

口腔表面麻醉劑具有操作簡(jiǎn)單、無(wú)痛、無(wú)損傷、減少患者對(duì)疼痛恐懼感和避免注射疼痛等優(yōu)點(diǎn)[1]。但是，目前商品化的表面麻醉劑普遍存在起效慢、作用表淺、麻醉效果不佳等缺點(diǎn)[1-3]，開(kāi)發(fā)滲透力強(qiáng)、起效快、麻醉效果好的表面麻醉劑一直是眾多研究者不斷探索的熱門研究課題之一[4-6]，尤其以脂質(zhì)體為載體的透皮給藥系統(tǒng)為近年來(lái)新的研究方向[2]。

本課題組與天津大學(xué)材料學(xué)院納米生物技術(shù)研究所共同自主研發(fā)了新型表面麻醉劑-載鹽酸利多卡因葡聚糖基納米高分子脂質(zhì)體（Lidocaine hydrochloride lysine -linoleic acid modified dextran polymeric lipid vesicles，LID-LLD-PLVs），其是以賴氨酸、亞油酸、葡聚糖和膽固醇合成的葡聚糖基納米高分子材料為載體，包載利多卡因（Lidocaine，LID）合成[7]，其各項(xiàng)理化性能良好[7]，并具有優(yōu)越的透皮性能，可有效增加LID的透皮量和滲透深度[8]。本課題組前期豚鼠皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)皮膚無(wú)刺激性，MTT 毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果為50、100 μg/ml的LID-LLD-PLVs 細(xì)胞毒性為0 級(jí)（待發(fā)表）。為了探討LID-LLD-PLVs的口腔黏膜麻醉效果，本研究以家兔下頜前牙唇側(cè)牙齦為給藥部位，通過(guò)針刺實(shí)驗(yàn)和頦神經(jīng)動(dòng)作電位實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

1.1.1 材料與試劑

LID-LLD-PLVs、載鹽酸利多卡因傳統(tǒng)脂質(zhì)體（Lidocaine hydrochloride conventional liposomes，LIDCLs），LID 含量2%，天津大學(xué)材料學(xué)院納米生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室自制；鹽酸利多卡因注射液（Lidocaine hydrochloride injection，LID-IJ），0.1 g/5 ml，批號(hào)：201 40312，上海禾豐制藥有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BL-420 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

新西蘭兔18 只，健康、口頜系統(tǒng)無(wú)異常，8 月齡，雌雄、顏色不限，體重（2.0±0.2）kg，購(gòu)于北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0003，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：11401400000479。常溫普通飼料飼養(yǎng)1 周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)藥物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將18 只兔按體重分層隨機(jī)分組的方法分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組6 只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牙齦針刺實(shí)驗(yàn)

將兔以仰臥位固定于兔手術(shù)臺(tái)，于下頜前牙唇側(cè)牙齦中間劃定約2 mm×5 mm的給藥區(qū)。陰性對(duì)照組在給藥區(qū)牙齦涂抹LID-IJ 0.5 ml、陽(yáng)性對(duì)照組在給藥區(qū)牙齦涂抹LID-CLs 0.5 ml、實(shí)驗(yàn)組在給藥區(qū)牙齦涂抹LID-LLD-PLVs 0.5 ml，每5 min 針刺給藥區(qū)牙齦，按上、下、左、右、中順序針刺5 下，兩針刺時(shí)距3～5 s，以開(kāi)頜反射為疼痛指征，記錄疼痛次數(shù)。疼痛≤2 次視為麻醉起效，疼痛≥3 次視為無(wú)效。記錄起效時(shí)間并計(jì)算持續(xù)時(shí)間，所有家兔均進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 頦神經(jīng)動(dòng)作電位實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 頦神經(jīng)分離 兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦（3 ml/kg）行全麻后取仰臥位，存在睫毛反射，但安靜不動(dòng)。室溫20℃，于下頜下緣中部?jī)?nèi)側(cè)約1 cm 處剃毛，碘伏消毒，平行下頜骨下緣作口外切口，于骨面剝離軟組織，在頦孔處暴露頦神經(jīng)。鈍性分離，接記錄電極并固定。下頜前牙唇側(cè)牙齦插入刺激電極，在刺激和記錄電極間下頜軟組織內(nèi)插入一針狀電極接地。見(jiàn)圖1。

圖1 頦神經(jīng)的分離

1.2.2.2 初始動(dòng)作電位記錄 連接BL-420 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，執(zhí)行“動(dòng)作電位引導(dǎo)”實(shí)驗(yàn)?zāi)K。參數(shù)設(shè)置為：調(diào)整刺激強(qiáng)度1 V，波寬1.0 ms，時(shí)間常數(shù)0.01 s，高頻濾波5 kHz。

1.2.2.3 給藥后動(dòng)作電位記錄 給藥方法同“1.2.1”，給藥后每隔5 min 給予1 次電刺激。記錄動(dòng)作電位幅度（action potential amplitude，APA），計(jì)算最大APA 抑制率[ 抑制率（%）=（用藥前APA -用藥后APA）×100 %/用藥前APA]及出現(xiàn)時(shí)間。所有兔子均進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組牙齦針刺實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

陰性對(duì)照組在給藥后90 min 內(nèi)未出現(xiàn)明顯麻醉效果。實(shí)驗(yàn)組起效時(shí)間為（26.67±5.16）min，低于陽(yáng)性對(duì)照組的（40.83±5.85）min，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.449，P ＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組麻醉持續(xù)時(shí)間為（34.17±3.76）min，與陽(yáng)性對(duì)照組[（29.17±6.65）min]比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.604，P ＞0.05）。

2.2 三組家兔頦神經(jīng)APA 抑制率比較

整體分析發(fā)現(xiàn)：組間比較、時(shí)間點(diǎn)比較及交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05），提示三組藥物作用的頦神經(jīng)APA 抑制率存在差異。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)比較：陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組50 min APA抑制率高于其他時(shí)間點(diǎn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05），實(shí)驗(yàn)組40 min APA 抑制率高于其他時(shí)間點(diǎn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；組間比較：實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)APA 抑制率高于陽(yáng)性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組50 min內(nèi)APA 抑制率高于陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 三組家兔頦神經(jīng)APA 抑制率比較（±s）

表1 三組家兔頦神經(jīng)APA 抑制率比較（±s）

注：與本組10 min 比較，aP ＜0.05；與本組20 min 比較，bP ＜0.05；與本組30 min 比較，cP ＜0.05；與本組40 min 比較，dP ＜0.05；與本組50 min 比較，eP ＜0.05；與本組60 min 比較，fP ＜0.05；與本組70 min 比較，gP ＜0.05；與本組80 min 比較，hP ＜0.05；與陰性對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，#P ＜0.05。APA：動(dòng)作電位幅度

3 討論

脂質(zhì)體作為藥物載體的透皮給藥系統(tǒng)已覆蓋很多領(lǐng)域藥物的研究[9-14]。在表面局麻藥的研究中尤以LID 脂質(zhì)體的研究居多，也早已有上市使用，但尚未解決透皮效率低、藥效僅限于皮膚/黏膜表面淺表[15-16]，麻醉難以顯效[17]等難題，部分藥物甚至因此停產(chǎn)。在口腔臨床中，因?yàn)楝F(xiàn)有表面麻醉藥對(duì)牙齦、上腭等角化黏膜的穿透力差，所以應(yīng)用更少。

以往關(guān)于口腔局麻藥麻醉效果的研究幾乎全部為人體實(shí)驗(yàn)[18-21]。因?yàn)長(zhǎng)ID-LLD-PLVs 為一新型制劑，尚未達(dá)到進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)條件，只能通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)其表面麻醉效果?？紤]到通過(guò)動(dòng)物的疼痛反應(yīng)來(lái)判斷麻醉效果容易出現(xiàn)較大誤差和動(dòng)物在清醒狀態(tài)下做出的抗拒、掙扎動(dòng)作會(huì)給疼痛反應(yīng)的判定造成干擾，所以本研究選擇針刺實(shí)驗(yàn)和頦神經(jīng)動(dòng)作電位實(shí)驗(yàn)來(lái)綜合評(píng)價(jià)LID-LLD-PLVs的口腔黏膜表面麻醉效果。

3.1 牙齦針刺實(shí)驗(yàn)

針刺實(shí)驗(yàn)是對(duì)局麻藥作用評(píng)價(jià)常用方法之一，多數(shù)研究者通常采用豚鼠背部針刺實(shí)驗(yàn)法[22]。但LIDLLD-PLVs 是擬用于口腔表面的麻醉藥，作用部位多為牙齦，為角化黏膜，比豚鼠的皮膚敏感性差，為了實(shí)驗(yàn)更有針對(duì)性，本研究選擇了家兔的下前牙唇側(cè)牙齦為給藥部位進(jìn)行針刺實(shí)驗(yàn)。本研究結(jié)果顯示，LID-IJ表面麻醉未顯效，LID-CLs和LID-LLD-PLVs 均具有表面麻醉效果，且以LID-LLD-PLVs 起效更快，持續(xù)時(shí)間兩者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因可能是LID-LLD-PLVs 滲透速度快于LID-CLs[8]，所以起效更快，但是滲透持續(xù)時(shí)間接近一致，所以麻醉效果持續(xù)時(shí)間比較無(wú)差異。

3.2 LID-LLD-PLVs 對(duì)家兔頦神經(jīng)動(dòng)作電位的影響

國(guó)內(nèi)外均有學(xué)者使用神經(jīng)電生理實(shí)驗(yàn)方法做局麻藥對(duì)牙髓疼痛的鎮(zhèn)痛作用研究[23-25]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多為貓、家兔和大鼠，實(shí)驗(yàn)方法多選用記錄二腹肌動(dòng)作電位或下牙槽神經(jīng)動(dòng)作電位。關(guān)于表面麻醉藥對(duì)牙齦等口腔黏膜鎮(zhèn)痛作用的電生理實(shí)驗(yàn)鮮見(jiàn)報(bào)道。家兔下頜前牙唇側(cè)牙齦受頦神經(jīng)支配，頦神經(jīng)為下牙槽神經(jīng)的終末支，選擇記錄頦神經(jīng)動(dòng)作電位比選擇記錄支配所有下頜牙齒、牙槽骨的下牙槽神經(jīng)動(dòng)作電位更加定位準(zhǔn)確、反應(yīng)靈敏。

頦神經(jīng)動(dòng)作電位實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LID-LLD-PLVs對(duì)頦神經(jīng)動(dòng)作電位抑制快、抑制效果強(qiáng)，提示其表面麻醉效果強(qiáng)于LID-CLs和LID-IJ，與針刺實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。LID-IJ 對(duì)頦神經(jīng)APA 有輕度抑制作用，但抑制作用較弱，持續(xù)時(shí)間具有一過(guò)性特點(diǎn)。這點(diǎn)與針刺實(shí)驗(yàn)結(jié)果稍有差異，分析原因可能為L(zhǎng)ID-IJ表面麻醉效果甚微和動(dòng)物的掙扎干擾了對(duì)疼痛反應(yīng)的判定。

本研究中，兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示新研制的LIDLLD-PLVs 較LID-CLs和LID-IJ 起效快、麻醉效果好，分析其原因可能為：LID-LLD-PLVs 具有兩親性[7]，更容易透過(guò)角質(zhì)層的屏障作用；粒徑小，為納米級(jí)，平均粒徑僅為54.1 nm[7]，所以相對(duì)于直徑為250 nm的LID-CLs 更容易穿透角質(zhì)層；具有較高的正電位，zeta電位為+27.40[7]，明顯高于LID-CLs（表面電位為+3.76），正電位越高越能更好地改變角質(zhì)層脂類分子的緊密排列[25]，增強(qiáng)其流動(dòng)性，形成滲透通路，而增加滲透速率；葡聚糖對(duì)脂質(zhì)體表面進(jìn)行修飾，能提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，促進(jìn)藥物滲透的能力。

新研制的口腔表面局麻藥LID-LLD-PLVs 起效較快，麻醉效果較好，具有良好的作為口腔黏膜表面麻醉劑的臨床應(yīng)用前景。