王艷萍 李文靜 洪 博

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006

肝硬化是功能性肝結(jié)構(gòu)被非功能性纖維化組織逐漸替代為特征的終末期肝臟紊亂[1]。腹水是肝硬化最常見的并發(fā)癥，腹水的出現(xiàn)是肝硬化患者不良預(yù)后的一個標(biāo)志，3 年病死率高達(dá)50%[2]。因此，提高肝硬化患者的生活質(zhì)量，減少肝硬化腹水（簡稱“肝腹水”）的并發(fā)癥及病死率變得越來越重要。

肝腹水相當(dāng)于中醫(yī)“膨脹”“單腹脹”范疇。對于肝腹水的治療，中醫(yī)多采用“利水”“逐水”等方法。十棗湯由甘遂、芫花、大戟和大棗組成，是峻下逐水的代表性方劑[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)十棗湯在臨床上多用于治療腹水[4-5]，但對十棗湯抗肝腹水的作用機(jī)制少有研究。

1 材料與方法

1.1 十棗湯中化合物的收集

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫[6]檢索十棗湯活性成分。

1.2 活性化合物與靶點(diǎn)篩選

通過口服生物利用度（oral bioavailability，OB），≥30%藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18[7-8]對十棗湯中化合物進(jìn)行篩選并得到靶點(diǎn)。UniProt 數(shù)據(jù)庫對得到的靶點(diǎn)進(jìn)行基因名轉(zhuǎn)換。

1.3 肝腹水作用靶點(diǎn)篩選

以“l(fā)iver cirrhosis”為關(guān)鍵詞在GeneCards[9]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，根據(jù)疾病與靶點(diǎn)間的相關(guān)度進(jìn)行篩選，選出相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）的構(gòu)建

利用Venny 2.1 在線軟件作圖工具平臺對十棗湯成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，得到十棗湯抗-肝腹水交集靶點(diǎn)。將其導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.5 基因富集通路可視化分析

將藥物-疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO 與KEGG 通路富集分析，在微生信在線作圖平臺進(jìn)行可視化。

1.6 藥物-化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物、化合物、十棗湯-疾病靶點(diǎn)及KEGG 信號通路導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 中，構(gòu)建藥物-化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 十棗湯活性成分與靶點(diǎn)收集

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集十棗湯中“甘遂”“芫花”“大棗”“京大戟”化合物共244 個。其中滿足OB≥30%，DL≥0.18的成分共58 個，包含靶點(diǎn)217 個。十棗湯活性成分信息見表1。

表1 十棗湯部分活性成分

2.2 肝腹水靶點(diǎn)

通過Genecards 數(shù)據(jù)庫獲得肝腹水相關(guān)靶點(diǎn)2001 個，按得分≥5 選取后得到914 個靶點(diǎn)。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)

十棗湯-肝腹水交集靶點(diǎn)共99 個，見圖1。交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖2。圖中共87 個節(jié)點(diǎn)，419 條邊，平均局部聚類系數(shù)為0.479，平均節(jié)點(diǎn)度為8.46。

圖1 十棗湯-肝腹水交集靶點(diǎn)Venn 圖

圖2 十棗湯抗肝腹水蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 靶點(diǎn)通路可視化

十棗湯可能通過蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子等結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡等過程發(fā)揮抗肝腹水作用，見圖3（封四）。99 個靶點(diǎn)共得到160 條KEGG 通路，最重要的KEGG 信號通路有10 條，見圖4（封四）。

圖3 GO富集分析圖

圖4 KEGG通路富集分析圖

2.5 藥物-化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

藥物-代合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)中包括4 種藥材，25 個化合物，138 個節(jié)點(diǎn)及617 條邊，排名前三的化合物為槲皮素、木犀草素、山柰酚，分別能與148、41、30 個靶點(diǎn)相互作用。對靶點(diǎn)進(jìn)行分析，排名前五的靶點(diǎn)為PTGS2、RXRA、CASP3、AKT1 與JUN。對通路進(jìn)行分析，排名前三的通路為癌癥信號通路、乙型肝炎通路、PI3K/AKT 信號通路。見圖5。

圖5 十棗湯中化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

本研究初步篩選出槲皮素、山柰酚、木犀草素等25 個活性成分，最終構(gòu)建出具有138 個節(jié)點(diǎn)與617 條邊的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)圖，闡釋了中藥復(fù)方制劑治療疾病具有多成分、多靶點(diǎn)、多路徑的特點(diǎn)。

從靶點(diǎn)方面：①PTGS2 在慢性丙型肝炎患者的活檢肝臟樣本中過表達(dá)，導(dǎo)致進(jìn)行性肝纖維化，從而導(dǎo)致肝硬化及肝癌[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)[12]，小鼠肝硬化中COX2 基因表達(dá)水平和lncRNACOX2 核糖核酸表達(dá)水平均有所增加。②CASP3 能夠產(chǎn)生促炎癥、血液動力學(xué)活性的微泡，這些微泡在肝臟內(nèi)產(chǎn)生重要的生物學(xué)效應(yīng)[13]。CASP3 與裂解的CASP3 在肝纖維化形成過程中發(fā)揮重要的作用[14]。③JUN 在小鼠模型中成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)非常重要，同時，JUN 能夠促進(jìn)肝細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖[15-16]。④AKT 被激活后，能夠磷酸化下游的mTOR 等靶蛋白，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化與凋亡[17-18]。

從通路方面：①乙型肝炎通路：大量的研究已經(jīng)顯示[19-20]，慢性乙肝演變成為肝硬化，關(guān)鍵的致病機(jī)制主要是病毒和機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)共同作用的結(jié)果。目前已經(jīng)有研究證實(shí)[21]，慢性乙肝患者中Treg/Th17 平衡失調(diào)可以導(dǎo)致持續(xù)性乙肝病毒感染和炎癥性肝損傷。②PI3K/AKT 信號通路：研究顯示[22]，隨著肝星狀細(xì)胞的激活、增殖，并且細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟中的合成或降解失衡，會導(dǎo)致肝纖維化，而PI3K/AKT 信號通路在此過程中具有重要作用。此外，PI3K/AKT 信號通路還可以使轉(zhuǎn)化生長因子-β 誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致肝硬化[23]。③微小核糖核酸在肝臟中參與肝細(xì)胞的增長及應(yīng)激反應(yīng)等，可反映肝臟中肝細(xì)胞和肝組織的狀態(tài)，在肝硬化和肝癌的發(fā)展中起到重要作用[24]。尤其是miR21 會誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致肝硬化[25]。