王雅瓊，劉吉宏，李軍喬，白世俊

(1. 青海民族大學(xué) 生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院, 西寧 810007； 2.青海省生物技術(shù)與分析測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-青藏高原蕨麻研究中心, 西寧 810007； 3. 西寧市氣象局, 西寧 810016)

蕨麻(PotentillaanserinaL.)是多年生草本植物，屬于薔薇科(Rosacrae)委陵菜屬(Potentilla)。在高原地區(qū)生長(zhǎng)的蕨麻，其地下根系膨大，富含淀粉、蛋白質(zhì)、多糖、總黃酮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和有效成分[1]，因具有抗缺氧、保肝護(hù)肝、降低血脂及膽固醇、提高機(jī)體免疫力、抑制病菌等作用，在《晶珠本草》《四部醫(yī)典》中均有記載，民間常將其作為食品、保健品和藏藥使用[2]。蕨麻作為青海省的特色農(nóng)產(chǎn)品，為青海省農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展創(chuàng)造了條件，但對(duì)野生蕨麻的無(wú)序采挖對(duì)自然環(huán)境產(chǎn)生了很大的破壞。基于此，本課題組先后培育了3個(gè)人工栽培新品種。在長(zhǎng)期的人工種植條件下，蕨麻的產(chǎn)量和品質(zhì)有所下降，由于土壤健康對(duì)植物的高效優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)至關(guān)重要，為了尋找蕨麻連作的影響因素，本課題組展開(kāi)了對(duì)根際土壤的研究。

根際是指植物根系周圍的特殊土壤，作為土壤水分和養(yǎng)分進(jìn)入植物根系的門戶，是受根系自身的生命活動(dòng)影響最直接、最強(qiáng)烈的區(qū)域[3]。植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量與根際土壤營(yíng)養(yǎng)狀況和微生物群落結(jié)構(gòu)等因素密切相關(guān)。其中，根際真菌對(duì)植物產(chǎn)生強(qiáng)烈影響，腐生真菌產(chǎn)生的胞外酶能夠分解和調(diào)動(dòng)植物凋落物[4]，外生菌根真菌能夠與植物共生[5]，叢枝菌根真菌通過(guò)改變土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度促進(jìn)植物養(yǎng)分獲取[6]，病原菌通過(guò)造成植物病害使植物種群數(shù)量發(fā)生改變[7]。植物對(duì)根際真菌也會(huì)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，例如，根對(duì)水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的富集和根部的脫落物給真菌群落創(chuàng)造的特殊生境[4]。

本研究以青藏高原蕨麻研究中心審定的作物新品種“青海蕨麻2號(hào)”為試驗(yàn)對(duì)象，測(cè)定蕨麻根際土壤的養(yǎng)分含量和真菌多樣性，探討蕨麻生長(zhǎng)和環(huán)境條件對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為蕨麻人工高產(chǎn)栽培中健康土壤的構(gòu)建提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣區(qū)概況

采樣區(qū)位于青海省湟源縣日月鄉(xiāng)(36°31′30″ N～36°32′40″ N，101°7′51″ E～101°10′24″ E)，該區(qū)屬大陸性高原溫帶半干旱氣候，四季分明，晝夜溫差大，2018年年均氣溫4.8 ℃，年降水量515.4 mm。采樣地設(shè)在“青海蕨麻2號(hào)”試驗(yàn)種植區(qū)，3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)區(qū)的種植年限分別為連作1年、4年和8年。2018年4月進(jìn)行播種，所有肥料作底肥一次施入，不追肥。

1.2 樣品采集

蕨麻利用塊根進(jìn)行無(wú)性繁殖，分別在蕨麻萌芽期、開(kāi)花期、塊根膨大期和塊根收獲期進(jìn)行4次采樣。采樣方法為隨機(jī)采樣法，在同一生長(zhǎng)周期的不同實(shí)驗(yàn)區(qū)里分別隨機(jī)設(shè)置3個(gè)樣方，每個(gè)樣方內(nèi)選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的蕨麻5株，利用抖土法取樣，5個(gè)土樣混合均勻后代表一個(gè)樣品，3個(gè)樣方采集的樣品代表3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將采集的樣品用滅菌自封袋密封置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，去除雜質(zhì)，過(guò)2 mm篩后平均分為兩份，一份自然風(fēng)干用于土壤養(yǎng)分測(cè)定，另一份置于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存，用于真菌群落分析[8]。采用國(guó)標(biāo)方法測(cè)定土壤中全氮、全磷、全鉀、速效氮、有效磷和速效鉀含量。

1.3 DNA提取與建庫(kù)

使用QIAampPowerFecal DNA試劑盒(QIAGEN，德國(guó))從0.5 g土壤樣品中提取DNA。使用正向引物86F，5′-GTGARTCATCGAATCTTT-3′和反向引物805R，5′-GATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′[9]通過(guò)PCR擴(kuò)增真菌ITS rDNA V2區(qū)。PCR反應(yīng)體系包括：5 μL 5 × GC緩沖液，0.5 μL KAPA dNTP Mix，0.5 μLTaqDNA聚合酶，0.5 μL引物(10 pmol/L)和50 ～100 ng模板DNA混合成25 μL體系。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；25個(gè)循環(huán),95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；最后72 ℃再延伸5 min。使用AMPure XP磁珠純化PCR產(chǎn)物，去除游離引物和引物二聚體等。使用上述引物擴(kuò)增PCR純化的產(chǎn)物，其中每個(gè)樣品用獨(dú)特的八堿基序列條形碼來(lái)進(jìn)行區(qū)分。然后，配置25 μL PCR反應(yīng)體系包括，5 μL 5 × GC緩沖液，0.75 μL KAPA dNTP Mix，0.5 μLTaqDNA聚合酶，1.5 μL引物(10 pmol/L)和5 μL純化產(chǎn)物。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，然后8個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件同上。通過(guò)AMPure XP磁珠純化擴(kuò)增產(chǎn)物形成文庫(kù)，使用Illumina MiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)完成測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)分析

采用FLASH將測(cè)序得到的雙端序列進(jìn)行拼接。對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾fastq_quality_filter(-p 90-q 25-Q33FASTX Toolkit 0.0.14)，過(guò)濾后的序列與參考數(shù)據(jù)庫(kù)USEARCH作比對(duì)，去除嵌合體得到優(yōu)化序列。通過(guò)隨機(jī)減法，根據(jù)樣本的最小值對(duì)每個(gè)樣本的讀取次數(shù)進(jìn)行歸一化。根據(jù)97%的序列相似性水平，利用QIIME的Uclust算法進(jìn)行OTU聚類分析，基于UNITE參考數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)每個(gè)樣品的OTUs進(jìn)行物種分類學(xué)注釋。基于加權(quán)和非加權(quán)Unifrac距離矩陣計(jì)算樣本的Alpha和Beta多樣性。同時(shí)，我們使用線性判別分析(LDA)效應(yīng)大小(LEfSe)方法來(lái)識(shí)別群體間豐度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的物種[10]。主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA)采用CANOCO 5.0軟件進(jìn)行；皮爾森相關(guān)性分析和單因素方差分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 采樣地土壤養(yǎng)分特征

分析不同種植年限、不同生長(zhǎng)周期蕨麻根際土壤的營(yíng)養(yǎng)狀況，對(duì)全氮、全磷、全鉀、速效氮、有效磷和速效鉀進(jìn)行主成分分析(圖1)。結(jié)果表明，PCA1和PCA2共同解釋了總變異的93.82%，可以全面顯示研究區(qū)域土壤營(yíng)養(yǎng)狀況的分異特征。不同種植年限的土壤營(yíng)養(yǎng)狀況沿PCA1明顯分開(kāi)，存在顯著差異，對(duì)第1主成分起主要作用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為全氮，而速效鉀對(duì)第2主成分的貢獻(xiàn)較大。

○：連作1年；△：連作4年；□：連作8年。紅色：萌芽期；黃色：開(kāi)花期；綠色：塊根膨大期；藍(lán)色：塊根收獲期。圖1 3個(gè)蕨麻種植試驗(yàn)田土壤營(yíng)養(yǎng)因素主成分分析Figure 1 Principal component analysis of the nutritional variables measured at the three planting fields of Potentilla anserina L.

2.2 蕨麻根際土壤中真菌的群落結(jié)構(gòu)

通過(guò)Illumina測(cè)序平臺(tái)，蕨麻根際土壤中共獲得1 023 967條序列，各個(gè)樣品的序列范圍為27 460～29 626條。按照97%閾值聚類后的OTUs數(shù)目為700個(gè)，分屬于5個(gè)門，14個(gè)綱，31個(gè)目，42個(gè)科和64個(gè)屬。在所有OTUs中，有43%無(wú)法注釋到真菌門，5個(gè)已知真菌門分別為子囊菌門，擔(dān)子菌門，壺菌門，球囊菌門和接合菌門，其中，子囊菌門種類最豐富，有292個(gè)OTUs(590 998條序列)，之后依次為51個(gè)OTUs(21 500條序列)，7個(gè)OTUs(8 809條序列)，26個(gè)OTUs(4 012條序列)和23個(gè)OTUs(72 654條序列)，見(jiàn)圖2(a)。

在64個(gè)真菌屬中，平均相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)真菌屬有5個(gè)[圖2(b)和圖3(a)]，分別是莖點(diǎn)霉屬(Phoma)、光黑殼屬(Preussia)、Cadophora、鐮孢菌屬(Fusarium)和被孢霉屬(Mortierella)；平均相對(duì)豐度在0.1%～1%的真菌屬有12個(gè)，見(jiàn)圖3(b)。由圖2(b)可知，5個(gè)優(yōu)勢(shì)屬的豐度在不同種植年限、不同生長(zhǎng)階段均存在差異，在連作1年的根際土中鐮孢菌屬占優(yōu)勢(shì)，連作4年的根際土中Cadophora和被孢霉屬占優(yōu)勢(shì)，連作8年的根際土中被孢霉屬占優(yōu)勢(shì)。由此可見(jiàn)，連作能夠改變蕨麻根際土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)，優(yōu)勢(shì)真菌屬及其豐度均發(fā)生了變化。

每個(gè)柱形代表3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值。圖2 蕨麻種植試驗(yàn)田土壤真菌門(a)和優(yōu)勢(shì)真菌屬(b)的相對(duì)豐度 Figure 2 Relative abundances of the fungal phyla (a) and dominantfungal genera (b)across all samples collected from plantingfields of Potentilla anserina L.

(a)平均相對(duì)豐度>1%的真菌屬；(b)平均相對(duì)豐度> 0.1%的真菌屬。誤差條顯示每個(gè)平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖3 蕨麻種植試驗(yàn)田土壤真菌屬的平均相對(duì)豐度Figure 3 Average relative abundance of fungal genera in across all samples collected from planting fields of Potentilla anserina L.

2.3 蕨麻根際土壤中真菌的α-多樣性

用Good’s coverage，Chao 1和Shannon多樣性指數(shù)來(lái)估算和比較蕨麻根際土壤中真菌群落的多樣性。Good’s coverage指數(shù)的變化范圍是99.66%～99.79%，表明測(cè)序的結(jié)果覆蓋了主要的真菌類群。Shannon和Chao 1指數(shù)的變化范圍分別是3.88～6.55和370.13～521.10。方差分析顯示：蕨麻開(kāi)花期根際土壤中的真菌多樣性顯著低于其他生長(zhǎng)階段(Shannon，P<0.05)；連作4年的土壤真菌豐富度顯著高于其他連作年限(Chao1，P<0.05)，而測(cè)序覆蓋度顯著低于其他連作土壤(Good’s coverage，P<0.01)，表明土壤樣品中真菌的均勻度和豐富度均發(fā)生了變化。

2.4 蕨麻根際土壤中真菌的β-多樣性

主坐標(biāo)分析圖顯示了蕨麻4個(gè)生長(zhǎng)階段根際真菌OTU組成的差異(圖4)。PC1和PC2解釋貢獻(xiàn)率分別為16.72%和13.87%，不同生長(zhǎng)階段的真菌OTU組成沒(méi)有顯著差異。然而，對(duì)真菌群落進(jìn)行LEfSe分析觀察發(fā)現(xiàn)，在蕨麻不同生長(zhǎng)階段根際土壤中存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)識(shí)物，即組間差異顯著的物種(圖5)。由以上結(jié)果可以看出，蕨麻根際真菌群落隨著不同生長(zhǎng)階段發(fā)生了改變。

圖4 基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析圖顯示了蕨麻4個(gè)生長(zhǎng)階段根際真菌的β-多樣性Figure 4 Principal coordinate analysisplot based on Bray-Curtis distance showing the β-diversity of rhizosphere fungal communities among the four growth stages of Potentilla anserina L.

圖5 利用線性判別分析分值對(duì)蕨麻4個(gè)生長(zhǎng)階段真菌不同分類水平的菌群進(jìn)行富集(截?cái)嘀怠?)Figure 5 Enriched taxa of different fungal level from the four growth stages of Potentilla anserina L. with a linear discriminant analysis score (cut off value ≥2)

2.5 土壤環(huán)境對(duì)蕨麻根際土壤真菌群落組成的影響

利用冗余分析了解土壤養(yǎng)分對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果(圖6)顯示RDA1和RDA2累計(jì)解釋真菌群落結(jié)構(gòu)變異的變量達(dá)到29.89%，速效鉀的影響顯著(P< 0.05)，且接合菌門和土壤全鉀呈正相關(guān)，子囊菌門與土壤養(yǎng)分關(guān)系較小。

圖6 蕨麻根際土壤真菌門與土壤養(yǎng)分的冗余分析Figure 6 Redundancyan alysis of soil fungus phylum and soil nutrient in rhizosphere of Potentilla anserina L.

對(duì)蕨麻根際真菌群落多樣性與土壤營(yíng)養(yǎng)元素進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果(表1)顯示：土壤全磷、速效氮與Chao 1指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，土壤速效氮、速效磷與Shannon指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，表明較高含量的土壤全磷、速效氮、速效磷會(huì)抑制根際土壤真菌豐富度和多樣性，土壤中養(yǎng)分含量是影響根際土壤真菌多樣性的驅(qū)動(dòng)因子之一。

表1 真菌多樣性和環(huán)境因子相關(guān)性統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistical analysis of correlations between environmental factors and fungal diversity

蕨麻根際土壤中平均相對(duì)豐度大于0.1%的真菌屬與土壤養(yǎng)分含量進(jìn)行相關(guān)性分析(表2)表明，鏈格孢屬、鐮孢菌屬和微座孢屬與全氮含量正相關(guān)；毛殼菌屬、微座孢屬與全磷含量正相關(guān)；毛殼菌屬、錐蓋傘屬與速效氮含量正相關(guān)；Cadophora與速效鉀含量正相關(guān)；小不整球殼屬與全鉀、速效氮、速效磷含量負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果表明，真菌屬的變化與土壤中養(yǎng)分含量相關(guān)。

表2 環(huán)境因子與真菌屬相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statistical analysis of correlations between environmental factors and fungal genera

3 討論與結(jié)論

蕨麻根際土中的真菌群落結(jié)構(gòu)在不同連作年限和不同生長(zhǎng)階段均存在變化，子囊菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[圖2 (a)]，這與番茄[11-12]和馬鈴薯[13]根際真菌的研究結(jié)果一致。有研究認(rèn)為，子囊菌門真菌是一些傳染性疾病的病原體和重要參與者，在本研究中占優(yōu)勢(shì)的真菌屬[圖3(a)]對(duì)植物的影響已有多項(xiàng)研究，例如，莖點(diǎn)霉屬能夠引起紫花苜蓿的褐色根腐病[14]，鐮孢菌屬能夠造成馬鈴薯[13]和番茄[11]的病害，光黑殼屬能夠產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)[15]，Cadophora對(duì)植物生長(zhǎng)有益[16]。

研究中α-多樣性分析結(jié)果顯示蕨麻開(kāi)花期根際真菌多樣性顯著降低(P< 0.05)，并且蕨麻每個(gè)生長(zhǎng)階段生物標(biāo)志物都不同(圖5)。這些變化可能與特殊生長(zhǎng)階段根系分泌物有關(guān)[17]，有研究對(duì)比了馬鈴薯在連作、輪作種植時(shí)不同生長(zhǎng)階段根系的分泌物，發(fā)現(xiàn)其種類和數(shù)量均存在很大差異[18]，而且在構(gòu)建土壤真菌群落中發(fā)揮重要作用[19]。與本研究結(jié)果類似，烤煙生育中后期土壤真菌群落最為豐富[20]，土壤AM真菌的群落結(jié)構(gòu)變化隨著棉花生育期的不同會(huì)有短暫的變化[21]，哈密瓜根際真菌群落結(jié)構(gòu)同樣隨生育期發(fā)生改變[22]。

在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，微生物多樣性受到栽培技術(shù)、作物連作或輪作、植物物種和氣候變化等因素影響，其中連作對(duì)微生物有顯著影響。許自成[20]、陳一峰[23]等利用PCR-DGGE技術(shù)研究了不同作物根際土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果均顯示連作對(duì)根際土壤真菌群落有較大影響。劉偉等[24]利用高通量測(cè)序技術(shù)研究了丹參連作年限對(duì)根際土壤真菌的影響，結(jié)果顯示連作對(duì)真菌群落在界、綱及屬不同分類水平上均有較大影響。以上研究均認(rèn)為真菌群落結(jié)構(gòu)的變化是導(dǎo)致作物連作障礙的重要原因。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到的真菌種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于上述研究，并且不同連作年限蕨麻根際真菌群落中5個(gè)真菌門[圖2(a)]和5個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬[圖2(b)]的豐度明顯不同，表明連作能夠?qū)φ婢郝浣Y(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，然而真菌群落的改變是否直接導(dǎo)致蕨麻連作障礙仍需進(jìn)一步研究。

環(huán)境因子的PCA結(jié)果表明，連作1年、4年和8年的土壤樣品分別形成了自己的集群，顯示了土壤養(yǎng)分的獨(dú)特差異。蕨麻根際土壤真菌門與土壤養(yǎng)分的冗余分析以及真菌多樣性和真菌屬與環(huán)境因子相關(guān)性統(tǒng)計(jì)均表明土壤養(yǎng)分含量與真菌群落結(jié)構(gòu)存在相關(guān)性。結(jié)果表明，無(wú)論是生長(zhǎng)周期還是連作年限，都明顯改變了蕨麻根際土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)。蕨麻根際土壤中有大量致病菌，且鏈格孢屬、莖點(diǎn)霉屬、光黑殼屬、Cadophora、鐮孢菌屬和被孢霉屬等均與土壤營(yíng)養(yǎng)代謝密切相關(guān)。因此，不同連作年限對(duì)蕨麻根際土壤真菌群落有較大影響，蕨麻連作后真菌種群結(jié)構(gòu)的變化可能是引發(fā)連作障礙的主要原因之一。