鄭雅婷，李 翔，王鵬程，楊艷坤，白仲虎

(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122)

畢赤酵母(Pichiapastoris)是一種廣泛應(yīng)用于異源蛋白質(zhì)生產(chǎn)的宿主[1]，具有高密度生長(zhǎng)和高蛋白質(zhì)分泌能力等優(yōu)點(diǎn)[2]。畢赤酵母高效表達(dá)外源蛋白的關(guān)鍵是甲醇代謝通路(methanol utilization pathway，MUT)，該通路中醇氧化酶對(duì)其底物的親和力很低，所以需要大量酶以維持細(xì)胞在甲醇上的生長(zhǎng)，特別是第一種限速酶Aox1(Alcohol oxidase 1, 醇氧化酶1)[3-4]。Aox1約占總mRNA的5%，占可溶性蛋白的30%[2]。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞生長(zhǎng)在抑制碳源上(甘油等)時(shí)缺乏Aox1活性[5]，且細(xì)胞中無(wú)法檢測(cè)到Aox1的mRNA，所以這種嚴(yán)格的調(diào)控主要作用于轉(zhuǎn)錄水平[6-8]。

通過(guò)前期研究，發(fā)現(xiàn)PAS_chr1-4_0516(與釀酒酵母中的sterol uptake 2, 即Sut2基因同源)等基因的表達(dá)可積極響應(yīng)碳源變化，并在甲醇中有更高的表達(dá)量[9]。據(jù)報(bào)道，Sut2是Zn2Cys6家族的潛在轉(zhuǎn)錄因子[10-11]，推測(cè)在畢赤酵母中，該基因可能對(duì)甲醇代謝具有調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母中Sut2在厭氧條件下與Sut1一起調(diào)節(jié)麥角固醇的攝取，并參與麥角固醇的生物合成[12]，而畢赤酵母中不具有同源基因Sut1。據(jù)報(bào)道，麥角固醇是酵母細(xì)胞膜及過(guò)氧化物酶體膜的主要成分[13]，畢赤酵母中麥角固醇的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制尚不清楚。

為表征Sut2在畢赤酵母中的功能，在畢赤酵母中分別過(guò)表達(dá)和敲除Sut2，研究Sut2與MUT之間的相關(guān)性，通過(guò)添加甲醇及其代謝物來(lái)探究Sut2的誘導(dǎo)劑，并研究Sut2功能與麥角固醇的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和試劑

畢赤酵母GS115和載體pUC19、pMD19-T、pPICZ B均為本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶和T4 DNA ligase均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；2×PfuMasterMix、2×TaqMasterMix購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；質(zhì)粒小量試劑盒、PCR純化試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN;DNA分子量Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和熒光定量試劑盒SYBR?PremixExTaqTMII購(gòu)自TaKaRa;Ampicillin購(gòu)自上海生工；Zeocin購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；酵母浸出物、蛋白胨購(gòu)自英國(guó)OXOID公司。文中所涉及的引物列于表1。

表1 本研究所用的引物序列

1.2 方法

1.2.1Sut2敲除菌株構(gòu)建

用基因組DNA作模板，PCR擴(kuò)增Sut2上游Sut2-up(0.6 kb)。并以質(zhì)粒pMD19-T-GT1-del(實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建)作模板，PCR擴(kuò)增Kan基因及其啟動(dòng)子和終止子(1 556 bp)。用相應(yīng)的內(nèi)切酶切Sut2-up和Kan，然后將產(chǎn)物與用Hind III/SmaI雙酶切的pUC19載體連接，獲得重組質(zhì)粒pUC19-Sut2up-Kan。PCR擴(kuò)增Sut2下游Sut2-down(0.6 kb)，將SmaI/SacⅠ酶切的基因片段和pUC19-Sut2up-kan載體連接，得到質(zhì)粒pUC19-Sut2-del。以pUC19-Sut2-del為模板，PCR擴(kuò)增得到Sut2敲除片段，將其電轉(zhuǎn)化GS115，以0.3 mg/mL G418篩選抗性轉(zhuǎn)化子，流程如圖1。

圖1 Sut2敲除片段構(gòu)建Figure 1 The construction of Sut2-knockout sequence

1.2.2Sut2過(guò)表達(dá)菌株構(gòu)建

以GS115基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到Sut2片段(1 kb)。再經(jīng)EcoR I/XhoI雙酶切，連接至載體pGAPZ B中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，得到重組質(zhì)粒pGAPZB-Sut2。AvrII單酶切線性化pGAPZB-Sut2，電轉(zhuǎn)化GS115，獲得Sut2過(guò)表達(dá)菌株GS115-Sut2，流程如圖2。

圖2 Sut2過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建Figure 2 The construction of Sut2 overexpression plasmid

1.2.3 麥角固醇水平檢測(cè)

YPD活化后的菌株以初始OD600為0.5轉(zhuǎn)接基本培養(yǎng)基MM(1.34% YNB，0.004% histidine, 4×10-5% biotin，1% methanol)。對(duì)數(shù)末期取樣，4 ℃、3 000 r/min離心5 min，上清液和菌體分開(kāi)處理。上清液用甲醇稀釋10倍，震蕩10 min，翻轉(zhuǎn)混勻5 min，離心后取200 μL以檢測(cè)上清液中麥角固醇含量。菌體用雙蒸水洗滌2次，然后使用凍干機(jī)將酵母細(xì)胞在-80 ℃下冷凍干燥，取10 mg懸浮于甲醇∶1-丙醇(體積比1∶1)溶液中，用Ultra Turrax勻漿儀(IKA, Staufen, Germany)勻漿5 min，離心后將上清液轉(zhuǎn)移至樣品瓶中以檢測(cè)胞內(nèi)麥角固醇含量。通過(guò)HPLC分析樣品，使用SYMMETRY C18，4.6×250 mm柱(Waters，MA，USA)，用流速為0.8 mL/min的甲醇作流動(dòng)相，在30 ℃下進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4Aox1SDS-PAGE和酶活檢測(cè)

將菌株接種于5 mL YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose)培養(yǎng)基中，30 ℃，230 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜活化。離心收集菌體，以BMGY(10 g/L yeast extract, 20 g/L peptone, 3 g/L K2HPO4, 11.8 g/L KH2PO4, 13.4 g/L YNB, 4×10-4g/L biotin,2.5 mL/L glycerol)培養(yǎng)基重懸至OD600為0.2進(jìn)行培養(yǎng)，22 h補(bǔ)加甲醇至終濃度為10 mL/L，培養(yǎng)45 h，檢測(cè)10、22、35和45 h時(shí)菌株Aox1表達(dá)量。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取1 mL菌液，稀釋至OD600為3.0，取1 mL菌液離心5 min后棄上清液；加入 0.5 mL細(xì)胞裂解液懸浮細(xì)胞，再加入0.3 g 425～600 μm玻璃珠振蕩30 s，于冰上放置 1 min，重復(fù)10次；4 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，具體參見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。另取部分上清液，在酶標(biāo)板中加入100 μL醇氧化酶檢測(cè)溶液，加入上清液5 μL；再加3 μL甲醇，室溫反應(yīng)15～30 min，最后加20 μL 2 mol/L硫酸(含0.1 mol/L亞硫酸鈉)終止反應(yīng)，并于492 nm測(cè)量吸光度。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)

用GeneJet RNA純化試劑盒(Thermo Fisher Scientific)的標(biāo)準(zhǔn)方法提取總RNA，按照HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR(諾唯贊，中國(guó)南京)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將得到的cDNA按照ChanQ Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊，中國(guó)南京)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行熒光定量PCR。

2 結(jié)果與分析

2.1 GS115-ΔSut2、GS115-Sut2和GS115菌株中Aox1的轉(zhuǎn)錄與翻譯水平檢測(cè)

通過(guò)PCR分析Sut2敲除質(zhì)粒，電泳結(jié)果見(jiàn)圖3(a)，與預(yù)期大小2.7 kb相符。用于Sut2過(guò)表達(dá)菌株構(gòu)建的pGAPZ B和Sut2片段的雙酶切結(jié)果見(jiàn)圖3(b)，與預(yù)期大小2.8 kb和1 kb相符。重組菌株的PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3(c)，與預(yù)期大小1.2 kb相符，且測(cè)序驗(yàn)證正確。

(a)M：DL10k Marker；1～12：Sut2敲除質(zhì)粒PCR產(chǎn)物(2.7 kb)。(b)M: DL10k Marker；1：pGAPZ B雙酶切(2.8 kb)；2：Sut2雙酶切(1 kb)。(c)M: DL5k Marker；1～6：Sut2過(guò)表達(dá)菌株基因組PCR產(chǎn)物(1.2 kb)。圖3 Sut2敲除與過(guò)表達(dá)的PCR鑒定Figure 3 PCR results for knock-out and overexpression of Sut2

將GS115-ΔSut2、GS115-Sut2和GS115菌株活化后，用BMMY(10 g/L yeast extract, 20 g/L peptone, 3 g/L K2HPO4, 11.8 g/L KH2PO4, 13.4 g/L YNB, 4×10-4g/L biotin, 10 mL/L methanol)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在對(duì)數(shù)末期取樣，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)Sut2和Aox1的轉(zhuǎn)錄水平。通過(guò)驗(yàn)證GS115-ΔSut2和GS115-Sut2，分別實(shí)現(xiàn)Sut2的敲除和過(guò)表達(dá)，見(jiàn)圖4(a)。GS115-ΔSut2菌株中Aox1的轉(zhuǎn)錄水平比野生型低約22%，GS115-Sut2菌株的Aox1轉(zhuǎn)錄水平比野生型高約13%，見(jiàn)圖4(b)。

(a) Aox1的轉(zhuǎn)錄水平； (b) Sut2的轉(zhuǎn)錄水平(對(duì)照為甲醇中的GS115菌株，*為P<0.05)。圖6 RT-qPCR 檢測(cè)Aox1和Sut2在不同誘導(dǎo)劑條件下的表達(dá)Figure 6 Detection of Aox1 and Sut2 expression with different inducers by RT-qPCR

(a) Sut2的轉(zhuǎn)錄水平;(b) Aox1的轉(zhuǎn)錄水平。圖4 RT-qPCR 檢測(cè)Sut2和Aox1在不同菌株中的表達(dá)Figure 4 Detection of Sut2 and Aox1expression in different strains by RT-qPCR

檢測(cè)GS115-ΔSut2、GS115-Sut2和GS115菌株中Aox1蛋白的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，過(guò)表達(dá)Sut2菌株的Aox1酶活最高，缺陷型與野生型的Aox1酶活相近(圖5)。以各菌株最高表達(dá)量為例(45 h)，GS115-Sut2酶活較野生型高約17%，GS115-ΔSut2較野生型高約6%；而以甘油為唯一碳源時(shí)，各菌株的Aox1酶活相對(duì)較低，且無(wú)明顯差異。

結(jié)合圖4和圖5可知：過(guò)表達(dá)Sut2可提高Aox1的轉(zhuǎn)錄與翻譯水平；Sut2的敲除會(huì)導(dǎo)致Aox1轉(zhuǎn)錄水平的降低，而Aox1翻譯水平無(wú)明顯下降，這可能是翻譯過(guò)程中存在的其他因素綜合調(diào)控的結(jié)果。由此表明，Sut2可能對(duì)Aox1的轉(zhuǎn)錄水平存在一定程度的正調(diào)控。

圖5 不同菌株搖瓶培養(yǎng)不同時(shí)間取樣檢測(cè)Aox1酶活Figure 5 Enzyme activities of Aox1 fermentation in different strains at different time

2.2 不同碳源對(duì)Sut2表達(dá)的影響

P.pastorisAox1是MUT途徑的首步酶和限速酶，主要作用是將甲醇氧化為甲醛以及過(guò)氧化氫，從而啟動(dòng)甲醇代謝過(guò)程[15]。為探究MUT途徑中誘導(dǎo)Sut2表達(dá)的具體物質(zhì)，將GS115和GS115-ΔAox1菌株(實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，方法類似于GS115-ΔSut2的構(gòu)建)活化后，以BMY(配方為上文所述的BMMY培養(yǎng)基不加甲醇)培養(yǎng)基加6 mmol/L甲醇或甲醛為碳源對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。檢測(cè)Sut2和Aox1基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而進(jìn)一步確定Sut2表達(dá)的誘導(dǎo)劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在GS115和GS115-ΔAox1菌株中，碳源為甲醇時(shí)Sut2的轉(zhuǎn)錄水平比甲醛中分別高約5.7和4.2倍(圖6)。

2.3 GS115-ΔSut2、GS115-Sut2和GS115菌株中麥角固醇含量檢測(cè)

將GS115-ΔSut2、GS115-Sut2和GS115菌株活化后，用基本培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，利用HPLC檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外麥角固醇的含量。如圖7所示，隨著Sut2表達(dá)量的提高，胞內(nèi)麥角固醇含量具有5%～10%的提高，而胞外麥角固醇含量具有30%～40%的提高。

(a)胞內(nèi)麥角固醇含量;(b)胞外麥角固醇含量(以GS115菌株為對(duì)照，*為P<0.05)。圖7 HPLC檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外麥角固醇含量Figure 7 Detection of intracellular and extracellular ergosterol by HPLC

3 討論與結(jié)論

基于畢赤酵母轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[9]可推斷，潛在轉(zhuǎn)錄因子Sut2可能參與了甲醇代謝通路，然而具體機(jī)制尚不清楚。據(jù)報(bào)道，ScSut1是Zn2Cys6鋅指蛋白家族之一，其上調(diào)能促進(jìn)有氧條件下外源甾醇的攝取和胞內(nèi)甾醇的生物合成。研究表明，結(jié)構(gòu)相關(guān)基因YPR009(Sut2)是Sut1的功能同系物[12]。

為研究Sut2是否對(duì)Aox1有調(diào)節(jié)作用，通過(guò)敲除和過(guò)表達(dá)Sut2，檢測(cè)不同菌株中Aox1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。結(jié)果表明:Sut2對(duì)Aox1有一定程度的正調(diào)控作用，且這一調(diào)控很可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。在甲醇及其代謝物對(duì)Sut2的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，甲醇對(duì)GS115和GS115-ΔAox1菌株的誘導(dǎo)作用均顯著高于甲醛，這可能是培養(yǎng)環(huán)境中甲醛的存在，使細(xì)胞不需要大量的醇氧化酶，從而導(dǎo)致Aox1和Sut2在甲醛中低表達(dá)。野生型菌株中Sut2與Aox1的轉(zhuǎn)錄水平變化非常相似，結(jié)合Aox1的表達(dá)受甲醇誘導(dǎo)可知，甲醇是Sut2表達(dá)的主要誘導(dǎo)劑。另一方面，通過(guò)麥角固醇檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)外麥角固醇含量與Sut2呈正相關(guān)。由于基本培養(yǎng)基中不含有麥角固醇，因此細(xì)胞內(nèi)外的麥角固醇均來(lái)自菌體自身合成。由此可推測(cè)，畢赤酵母中Sut2可能參與調(diào)控麥角固醇的合成。據(jù)報(bào)道，麥角固醇是畢赤酵母過(guò)氧化物酶體膜上的重要組成成分，是過(guò)氧化物酶體增生所必需的結(jié)構(gòu)原材料[16];而過(guò)氧化物酶體是甲醇代謝的主要場(chǎng)所，在甲醇為唯一碳源的時(shí)候，畢赤酵母中的過(guò)氧化物酶體會(huì)急劇增生，這是甲醇代謝的重要特征之一[2]。因此推測(cè)Sut2可能通過(guò)調(diào)控麥角固醇的合成來(lái)參與甲醇代謝，這一假設(shè)有待進(jìn)一步在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

研究發(fā)現(xiàn)并初步鑒定畢赤酵母甲醇利用途徑有關(guān)的新基因Sut2，它是一個(gè)潛在轉(zhuǎn)錄因子。Sut2的表達(dá)可以被甲醇(及其氧化過(guò)程)誘導(dǎo)，且在一定程度上正向調(diào)控Aox1的表達(dá)，其中的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。另外，發(fā)現(xiàn)Sut2基因的功能與麥角固醇合成的聯(lián)系，這為解析甲醇代謝通路奠定了基礎(chǔ)。