鄭鳳玲，劉莉，黃雙，白俊杰，李春美，陳娜，譚超

（宜賓學院，過程分析與控制四川省高校重點實驗室，四川宜賓 644000）

隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率在不斷上升。我國藥品市場口服降糖藥是以西藥為主，中成藥為輔［1］。有些不法商家在降糖類中成藥中非法添加處方以外的西藥，從而牟取暴利［2］。降糖類中藥的非法添加物通常為降糖西藥［3］，其中具有價格低廉、見效快特點的鹽酸二甲雙胍和格列齊特是降糖類中成藥中最為常見的兩種非法添加物，這兩種藥物容易使患者在不知情的狀態(tài)下過量服用，造成不可預知的后果，同時也不利于正品藥物的宣傳及推廣。

目前中藥摻雜的常用檢測方法有薄層色譜法［4］、高效液相色譜法［5–6］、液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法［7–8］、毛細管電泳法［9］、近紅外光譜法［10–11］、離子遷移譜法［12–13］等。以上分析方法中，薄層色譜法專屬性較差，存在假“陽性”干擾，通常只能用于快速初步鑒定分析；高效液相色譜法具有檢測準確性高、耗時短的優(yōu)點，但其操作復雜，檢測成本高，不適用于批量樣品分析，故難以推廣應用；液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法成本高昂，較少應用；毛細管電泳法對樣品處理要求較高，且每次分析進樣量偏少，制備能力差，可能發(fā)生電滲，影響分析結(jié)果的重現(xiàn)性。

近紅外光譜技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)藥領(lǐng)域取得了較大發(fā)展，但多用于中藥原材料領(lǐng)域，較少應用于中成藥摻假研究。傳統(tǒng)近紅外光譜技術(shù)較多基于純凈物建模，具有快速、無損、高效、綠色［14］等特點。筆者選擇中成藥中常規(guī)摻假方法建立了降糖中成藥單組分摻雜模型，并利用近紅外光譜結(jié)合偏最小二乘法對降糖寧膠囊摻雜樣品進行分析，實驗結(jié)果表明該鑒定分析模型準確。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

傅里葉近紅外光譜儀：AntarisⅡ型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

電子分析天平：FA2004 型，感量為0.1 mg，上海良平儀器儀表有限公司。

手動壓片機：FW–5A型，天津博天勝達科技發(fā)展有限公司。

降糖寧膠囊樣品：0.4 g／粒，吉林省正和藥業(yè)集團股份有限公司。

鹽酸二甲雙胍片樣品：0.25 g／片，北京中惠藥業(yè)有限公司。

格列齊特緩釋片樣品：0.03 g／片，成都恒瑞制藥有限公司。

1.2 實驗步驟

1.2.1 樣品制備

根據(jù)降糖寧膠囊使用說明書中載明的每日最大服用量，計算得鹽酸二甲雙胍、格列齊特兩種摻雜物的最大質(zhì)量分數(shù)分別為29.0%、3.5%，再利用電子分析天平稱取不同質(zhì)量的摻雜物和降糖寧膠囊，使用瑪瑙研缽研磨混合，制成樣品粉末。按照摻雜質(zhì)量分數(shù)0.0%～29.0%制得42份摻鹽酸二甲雙胍的樣品粉末，每組摻鹽酸二甲雙胍的樣品粉末利用手動壓片機壓片制得兩粒藥片，編號為A組和B組；按照摻雜質(zhì)量分數(shù)為0.0%～3.5%制得43份摻格列齊特的樣品粉末，每組摻格列齊特樣品粉末采用相同方法壓片制得兩粒藥片，編號為C組和D組。

1.2.2 光譜采集

對1.2.1制備的樣品進行測試并采集近紅外光譜。將藥片蓋住漫反射窗口，避免空氣背景光譜干擾，每隔1 h掃描一次背景光譜。實驗采用積分球漫反射方式，波數(shù)范圍為4 000～10 000 cm–1，分辨率為8 cm–1，采集32次，將所得光譜數(shù)據(jù)導入TQ Analyst 9.0軟件中，分別建立摻鹽酸二甲雙胍樣品、摻格列齊特樣品近紅外光譜圖。

1.2.3 模型的建立

選取部分已知配制濃度數(shù)據(jù)的摻鹽酸二甲雙胍、摻格列齊特的降糖寧膠囊樣品近紅外光譜圖，利用TQ Analyst 9.0軟件進行不同數(shù)據(jù)形式、不同光譜平滑處理方式的預處理來確定最優(yōu)預處理方式。經(jīng)過上述預處理后，選取部分數(shù)據(jù)建立模型，未被選取的摻雜樣品作為未知樣品待分析，分析單個樣品預測值與實測值之間的差值來驗證模型的準確性。

1.2.4 定量分析

實驗采用PLS法對模型進行定量分析［15］。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的選擇

參照褚小立［16］、卞中悅［17］等的相關(guān)實驗研究結(jié)果，確定實驗條件為采集光譜前將儀器開機預熱1 h，摻偽樣品在實驗室預先放置1～2 h。在室溫20～25 ℃、室內(nèi)濕度為50%～60%條件下進行積分球漫反射方式下的近紅外光譜采集。

2.2 光譜圖

近紅外區(qū)域的主要光譜信息來源于分析對象分子中含氫基團的倍頻與合頻吸收［18］，因此通過掃描樣品的近紅外光譜，可以得到樣品分子中含氫基團的特征信息。在漫反射方式下，摻鹽酸二甲雙胍和摻格列齊特降糖寧膠囊樣品的光譜圖分別如圖1、圖2所示。

圖1 摻鹽酸二甲雙胍降糖寧膠囊樣品近紅外光譜圖

圖2 摻格列齊特降糖寧膠囊樣品近紅外光譜圖

由圖1、圖2可以看出：摻鹽酸二甲雙胍降糖寧膠囊樣品的近紅外光譜特征吸收數(shù)據(jù)集中在4 000～5 500 cm–1范圍內(nèi)，在約4 400 cm–1和4 900 cm–1兩處有明顯的吸收峰，且不同濃度的鹽酸二甲雙胍摻雜樣品具有相同范圍的近紅外光譜特征吸收數(shù)據(jù)和吸收峰；摻格列齊特胍降糖寧膠囊樣品的近紅外光譜特征吸收數(shù)據(jù)集中在4 000～7 000 cm–1范圍內(nèi)，在約5 100 cm–1和6 800 cm–1兩處有明顯的吸收峰，且不同濃度的格列齊特摻雜樣品具有相同范圍的近紅外光譜特征數(shù)據(jù)和吸收峰。因此在實驗建模時，基于系統(tǒng)優(yōu)化區(qū)間再手動調(diào)節(jié)光譜范圍，摻鹽酸二甲雙胍胍降糖寧膠囊樣品光譜波段范圍為4 000～6 900 cm–1，摻格列齊特胍降糖寧膠囊樣品光譜波段范圍為4 000～10 000 cm–1。

2.3 數(shù)據(jù)預處理方法

檢測所得光譜信息除了來自待測樣品外，還有部分來自于其它干擾因素，對所建模型會造成不利影響，因此要針對光譜特性進行恰當?shù)奶幚?，降低干擾因素的影響［19］。降糖寧膠囊摻雜樣品檢測所得光譜數(shù)據(jù)的不同預處理方法對建模的影響結(jié)果見表1。預處理結(jié)果以外部驗證相關(guān)系數(shù)、校正均方差、驗證均方差為評判標準，在滿足驗證均方差與校正均方差比值在［1,1.20］區(qū)間條件下，相關(guān)系數(shù)越接近于1，驗證均方差越小越好，其預處理效果越好。

表1 不同預處理方法對建模的影響

由表1數(shù)據(jù)可知，摻鹽酸二甲雙胍降糖寧膠囊樣品采用原始數(shù)據(jù)及S–G平滑方式處理得到的模型最理想，該模型對應的相關(guān)系數(shù)為0.998 5，驗證均方差與校正均方差的比值為1.093 06；摻格列齊特降糖寧膠囊樣品采用原始數(shù)據(jù)及無平滑方式得到的模型最理想，該模型對應的相關(guān)系數(shù)為0.997 7，驗證均方差與校正均方差的比值為1.262 30（所有模型該值均大于1.2，此處選最接近者）。

2.4 線性關(guān)系及精密度

按照上述所得最優(yōu)光譜波段和預處理方法建立摻偽樣品定量分析模型。摻鹽酸二甲雙胍降糖寧膠囊樣品模型預測值與實測值的線性關(guān)系見圖3，偏差關(guān)系見圖4；摻格列齊特降糖寧膠囊樣品模型預測值與實測值的線性關(guān)系見圖5，偏差關(guān)系見圖6。

圖3 摻鹽酸二甲雙胍樣品實測值與預測值的線性關(guān)系圖

圖4 摻鹽酸二甲雙胍樣品實測值與預測值的偏差關(guān)系圖

圖5 摻格列齊特實測值與預測值的線性關(guān)系圖

圖6 摻格列齊特樣品實測值與預測值的偏差關(guān)系圖

根據(jù)圖3分析得到其模型的相關(guān)系數(shù)為0.996 2，校正均方差為0.008 50，外部驗證后模型的相關(guān)系數(shù)為0.999 6，驗證均方差為0.008 51，且驗證均方差與校正均方差比值為1.001，滿足相關(guān)約束條件，表明該模型的預測值與實測值接近，且具有較好的線性關(guān)系；由圖4可知該模型的預測值與實測值偏差在–0.03～0.01范圍以內(nèi)，表明該模型較為準確，該方法可用于摻鹽酸二甲雙胍降糖寧膠囊樣品的快速鑒定分析。

根據(jù)圖5分析得到其模型的相關(guān)系數(shù)為0.996 0，校正均方差為0.000 745，外部驗證后模型相關(guān)系數(shù)為0.997 6，驗證均方差為0.000 795，且驗證均方差與校正均方差比值為1.067，滿足相關(guān)約束條件，表明模型的預測值與實測值接近，且具有較好的線性關(guān)系；由圖6可知該模型的預測值與實測值偏差在–0.001 1～0.001 5范圍以內(nèi)，表明該模型誤差較小，準確度較高，該方法可用于摻格列齊特降糖寧膠囊樣品的快速鑒定分析。

2.5 模型校驗

基于PLS 法所建立的降糖寧膠囊的摻雜相關(guān)分析模型，隨機選取建模時未使用的樣品作為未知樣，對其進行量化分析。未知量量化分析結(jié)果見表2、表3。根據(jù)表2、表3對未知量化分析表中多個未知樣檢測、驗證、分析可知，模型的設(shè)定濃度與檢測濃度差值較小，結(jié)果區(qū)域擬合值較高，表明該模型準確度高、可靠性強。

表2 摻鹽酸二甲雙胍降糖寧膠囊樣品摻雜質(zhì)量分數(shù)量化分析結(jié)果 %

表3 摻格列齊特降糖寧膠囊樣品摻雜質(zhì)量分數(shù)量化分析結(jié)果 %

3 結(jié)語

基于近紅外光譜技術(shù)，采用PLS法，建立了降糖寧膠囊摻雜鑒定模型。通過確定主成分數(shù)、基于系統(tǒng)優(yōu)化區(qū)間，再手動調(diào)節(jié)光譜范圍對模型進行優(yōu)化后，利用TQ Analyst 9.0軟件通過不同的數(shù)據(jù)形式、不同的光譜平滑預處理方式來確定最優(yōu)預處理方法。采用PLS法對其進行定量分析，結(jié)果表明模型線性相關(guān)性良好，準確度高，可類比用于降糖類中成藥中非法添加物的快速鑒定分析。該技術(shù)對于監(jiān)督和規(guī)范中醫(yī)藥生產(chǎn)、保證糖尿病患者用藥安全、打擊藥物非法添加犯罪具有重要作用，為中藥的快速、無損檢測提供了新的思路。