門君，鄭凌凌，王敏，賈書召，周芳，肖媛，左艷霞

（中國科學(xué)院水生生物研究所，武漢 430072）

近年來，由于水體的富營養(yǎng)化，藍藻時常爆發(fā)，產(chǎn)生的藍藻毒素和異味等代謝產(chǎn)物嚴重影響了飲用水、景觀等生態(tài)環(huán)境的安全，成為全球關(guān)注和研究的焦點［1］。研究結(jié)果表明，水體中氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)的濃度過高是藍藻水華的成因之一［2］，鈣等陽離子在群體微囊藻和藍藻浮渣形成過程中起重要作用［3–4］。藍藻水華沉降期間會引起沉積物和上覆水中陰、陽離子的變化［5］，因此研究藍藻水華不同生長階段水體中陰、陽離子的濃度對藍藻水華的成因分析和生長控制至關(guān)重要。

有報道使用配置光散射檢測器的超臨界流體色譜法同時檢測幾種陰、陽離子［11］，但該法無法分離硝酸鹽和亞硝酸鹽。離子色譜法使用離子交換柱和電導(dǎo)檢測器，具有分離度好、選擇性強、靈敏度高及抗干擾能力強等優(yōu)點，能夠快速、高效、準(zhǔn)確定量分析多種陰、陽離子［12–13］，近年來廣泛用于飲用水、污水、自然水體、酸雨、啤酒中多種陰、陽離子的同時檢測［14–17］。

筆者基于雙系統(tǒng)離子色譜儀，采用等度淋洗的方式，建立了藍藻培養(yǎng)液中7種陰離子和6種陽離子同時定量檢測的分析方法，方法簡便、快速，降低了實驗成本。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

多功能離子色譜系統(tǒng)：ICS–5000+型，配置雙泵DP模塊、雙電導(dǎo)檢測器模塊、KOH EGC 500淋洗液罐、自動進樣器AS模塊和Chromeleon 6.8色譜軟件，美國賽默飛世爾科技公司。

超純水制備儀：Milli-Q型，電導(dǎo)率為18.2 MΩ·cm，美國密理博公司。

甲基磺酸：純度不小于99.0%，美國Sigma公司。

甲醇：色譜純，美國賽默飛世爾科技公司。

陽離子混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：Ca2+質(zhì)量濃度為500 mg／L，NH4+質(zhì)量濃度為250 mg／L，Mg2+、K+、Na+質(zhì)量濃度均為200 mg／L，Li+質(zhì)量濃度為50 mg／L，美國賽默飛世爾科技公司。

藍藻藻種樣品：銅綠微囊藻（Microcystis Aeruginosa）905和 魚 害 微 囊 藻（M.ichthyoblabe）1410，中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫（FACHB）。

BG11培養(yǎng)基：具體配方見參考文獻［18］。

藍藻培養(yǎng)液：中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫（FACHB）。

水相濾膜：SCAA–02型，13 mm×0.22 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司。

IC–RP小柱：Dionex OnGuard ⅡRP型柱，容量為1 mL，美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 色譜條件

藍藻培養(yǎng)液中陰、陽離子的離子色譜分析條件見表1。

表1 藍藻培養(yǎng)液中13種離子色譜分析條件

1.3 樣品處理

取藍藻藻種樣品，加入適量的BG11培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為pH 7.1～7.2，溫度25 ℃，光照強度25μmol／(m2·s)，光暗周期比12 h∶12 h，所有藍藻培養(yǎng)至對數(shù)生長期［18］后用于實驗。

取藍藻培養(yǎng)液10 mL于離心管中，以15 000 r／min轉(zhuǎn)速離心5 min。取上清液過0.22 μm水相濾膜，初步除去懸浮顆粒物。采用IC–RP小柱進行進一步凈化，除去藍藻培養(yǎng)液中的有機物等雜質(zhì)，凈化后的樣品溶液稀釋到合適濃度后取樣5 mL，上機檢測。

IC–RP小柱凈化方法：依次加入10 mL甲醇、20 mL水對小柱進行充分活化，再加過濾后的藍藻培養(yǎng)液到活化后的小柱內(nèi)，棄去前3 mL初濾液，收集續(xù)濾液備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 陰離子分離條件的優(yōu)化

常用的陰離子淋洗液體系主要有碳酸鹽和氫氧化物兩種。與碳酸鹽體系相比，氫氧化物體系對強保留的陰離子具有更強的洗脫能力，氫氧化物體系中以KOH 溶液作為淋洗液，具有背景電導(dǎo)率低、噪聲小、靈敏度高和無水負峰等特點，因此選擇使用KOH溶液作為7種陰離子分離的淋洗液。分別選擇淋洗液流量為0.8、1.0、1.2、1.4 mL／min進行試驗，結(jié)果表明，淋洗液流量過大會使系統(tǒng)壓力顯著增大，各離子的保留時間明顯提前，也會降低色譜柱的使用壽命；若淋洗液流量過小，如當(dāng)流量為0.8 mL／min 時，多個陰離子峰出現(xiàn)嚴重的展寬現(xiàn)象，導(dǎo)致靈敏度下降。綜合考慮各離子的分離度和響應(yīng)靈敏度，最終選擇陰離子淋洗液流量為1.2 mL／min。在進行色譜柱型號選擇時，試驗比較了美國賽默飛世爾科技公司的Dionex IonPac AS11–HC型和Dionex IonPac AS15型兩種色譜柱的分離效果（兩種色譜柱規(guī)格均為250 mm×4 mm）。這兩種色譜柱均可以實現(xiàn)7種陰離子的完全分離，但使用AS15型色譜柱時，各離子的保留時間較長，分析時間過長；且檢測同等濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用AS15型色譜柱的響應(yīng)值明顯低于AS11–HC型色譜柱；另外，AS15型色譜柱的柱容量（225 μmol）明顯低于AS11–HC型色譜柱的柱容量（290 μmol）。AS11–HC型色譜柱用于分離7種陰離子有明顯優(yōu)勢，故本實驗選擇使用AS11–HC型色譜柱。

通過對陰離子分離的淋洗液、流量及色譜柱型號的優(yōu)化，最終選擇的分離條件：以23 mmol／L KOH溶液為淋洗液，淋洗液流量為1.2 mL／min，色譜柱為Dionex IonPac AS11–HC型柱（250 mm×4 mm，美國賽默飛世爾科技公司）。在優(yōu)化的色譜條 件 下，7種 陰 離 子（0.2 mg／L F–，1.0 mg／L Cl–，1.0 mg／L NO2–，1.0 mg／L SO42–，1.0 mg／L Br–，1.0 mg／L NO3–，2.0 mg／L PO43–）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖1所示。由圖1可知，各陰離子分離良好。

圖1 陰離子混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 陽離子分離條件的優(yōu)化

常用的陽離子淋洗液主要有硫酸溶液和甲基磺酸溶液。由于硫酸具有較強的腐蝕毒性，故選擇較為安全的甲基磺酸溶液作為陽離子分離的淋洗液。分別選擇淋洗液流量為0.6、0.8、1.0、1.2 mL／min進行試驗，結(jié)果表明，若淋洗液流量過大則分析時間會縮短，但Na+與NH4+的分離度大幅降低；若淋洗液流量過小，如當(dāng)流量為0.6 mL／min 時，Mg2+、Ca2+峰出現(xiàn)展寬現(xiàn)象，導(dǎo)致分析靈敏度下降。最終選擇陽離子淋洗液流量為0.8 mL／min。試驗比較了美國賽默飛世爾科技公司的Dionex IonPac CS12A型和CS15型（規(guī)格均為250 mm×4 mm）兩種色譜柱，結(jié)果表明前者比后者分離度好，響應(yīng)值高。因此選擇CS12A型色譜柱作為陽離子分離柱。

通過對陽離子分離的淋洗液、流量及色譜柱型號的優(yōu)化，最終選擇的分離條件：以20 mmol／L甲基磺酸溶液為淋洗液，淋洗液流量為0.8 mL／min，色譜柱為DionexIonPac CS12A型柱。在優(yōu)化后的色譜條件下，6種陽離子（0.5 mg／L Li+、2.0 mg／L Na+、2.5 mg／L NH4+、5.0 mg／L K+、2.5 mg／L Mg2+、5.0 mg／L Ca2+）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖2所示。由圖2可知，各陽離子分離良好。

圖2 陽離子混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.3 線性關(guān)系及檢出限

按照樣品中各離子的濃度范圍，將陰、陽離子混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液用超純水逐級稀釋，分別配制5種不同濃度的陽離子和陰離子系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在1.2色譜條件下，對系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液逐一進樣分析，以各離子質(zhì)量濃度（X，mg／L）為橫坐標(biāo)、對應(yīng)的色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。以3倍信噪比計算方法的檢出限。各離子的保留時間、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限列于表2。

表2 13種離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)

2.4 精密度試驗

取適量的銅綠微囊藻（M.aeruginosa）905培養(yǎng)液6份，分別按照1.3步驟處理，在培養(yǎng)液中加入一定濃度的陰離子和陽離子標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，進行精密度試驗。根據(jù)各離子的測定值計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，表示該方法的精密度，測定結(jié)果列于表3。

表3 精密度試驗結(jié)果

由表3可知，在本方法檢測條件下，各離子測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1.5%（n=6），表明本方法重復(fù)性好，精密度高。特別是本法測定Na+、K+、Mg2+和Ca2+的精密度均優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)HJ 700—2014中電感耦合等離子體質(zhì)譜法的測量精密度。

2.5 樣品加標(biāo)回收試驗

利用本法同時測定魚害微囊藻1410培養(yǎng)液中13種離子，色譜圖如圖3所示。由圖3可知，該方法可以有效分離藍藻培養(yǎng)液中的陰、陽離子。

圖3 魚害微囊藻（M .ichthyoblabe）1410培養(yǎng)液中陰、陽離子色譜圖

取適量的銅綠微囊藻（M. aeruginosa）905培養(yǎng)液，按照1.3步驟進行處理后進樣分析，然后對不同的離子進行3個不同濃度水平的加標(biāo)回收試驗，檢測結(jié)果和加標(biāo)回收率列于表4。由表4可知，13種離子的平均加標(biāo)回收率為80.70%～113.62%，滿足分析要求（國家環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)HJ 812—2016，HJ 84—2016規(guī)定加標(biāo)回收率應(yīng)為80%～120%），表明本方法可用于藍藻培養(yǎng)液中陰、陽離子的同時測定。

表4 13種離子加標(biāo)回收試驗結(jié)果

3 結(jié)語

建立了一種雙系統(tǒng)離子色譜法同時測定藍藻培養(yǎng)液中7種陰離子和6種陽離子的分析方法，該方法操作簡單，分析速度快，檢出限低，具有較高的精密度和準(zhǔn)確度，適用于藍藻培養(yǎng)液中陰、陽離子的同時分析，可以節(jié)省檢測時間和降低檢測成本，在藍藻生長和抑制研究中具有潛在的應(yīng)用價值。