楊 旭，崔璨璨，楊照微，徐 飛*

(1.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連116044；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

腎細胞癌又名腎癌，約占腎臟惡性疾病的80%-90%，是泌尿系統(tǒng)中發(fā)病率僅次于前列腺癌、膀胱癌的惡性腫瘤[1]。腎癌的早期臨床癥狀較為隱匿，發(fā)病原因尚未明確[2]。因此尋找到新的生物學(xué)標(biāo)志物對腎癌的診斷、治療及預(yù)后都尤為重要[3]。本文探討了蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3(PDIA3)在腎癌組織中的表達量，以驗證其是否可以成為診斷腎癌的新候選標(biāo)志物。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本實驗納入的18例研究對象，均為2018年2月-2018年11月期間在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院就診，并由病理學(xué)檢測診斷為TNM III期的腎透明細胞癌患者。納入的研究對象均已簽署相關(guān)知情同意書、診斷前均未采用任何臨床干預(yù)治療方案，且腫瘤并未發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移。標(biāo)本包括腎癌組織和癌旁組織，采集所有樣本后將其全部置于液氮中速凍，并保存在-80℃的冰箱中。

1.2 方法

1.2.1試劑和儀器 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、考馬斯亮藍G250、二硫代蘇糖醇(DTT)、RIPA裂解緩沖液、RNA酶、DNA酶、NH4HCO3溶液、碘代乙酰胺(IAM)、測序級胰蛋白酶、甲醛(FA)、硝酸鈰銨(CAN)、PDIA3單克隆抗體、蛋白質(zhì)定量試劑盒、水浴箱、離心機、毛細管液相色譜柱、Easy-nlc1000超高效液相色譜儀、Orbitrap Fusion Lumos-tribrid質(zhì)譜儀。

1.2.2提取及測定樣本總蛋白 使用PBS清洗保存于-80℃冰箱的樣本，液氮研磨后加入適量的RIPA裂解緩沖液、RNA酶和DNA酶，在4℃下，以12 000 rpm離心15 min，提取上清液為樣品的總蛋白。應(yīng)用考馬斯亮藍染液色法(Bradford法)對18份樣本的總蛋白進行測定，并繪制蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3蛋白質(zhì)多肽混合物的制備 室溫下融化妥善保存的總蛋白樣本，首先將50 mmol/L的NH4HCO3添加到每個樣本中，起到溶解稀釋的作用。其次使用濃度為1 mol/L的二硫代蘇糖醇(DTT)將樣本溶液調(diào)定為20 mmol/L，并在56℃下，避光靜置1 h。再次將濃度為1 mol/L的碘代乙酰胺(IAM)加入已冷卻至室溫的樣本中，使樣本溶液濃度調(diào)定至50 mmol/L,避光靜置30 min，以確保充分反應(yīng)。最后，根據(jù)樣本的總蛋白量，以50∶1的比例加入胰蛋白酶，37℃水浴箱中培養(yǎng)12 h后，凍存于-8℃的冰箱中以備進行高效液相色譜法分離。

1.2.4二維高pH反相高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) 應(yīng)用反相C18高效色譜柱(75 mm×100 mm，3 mm)對樣本蛋白質(zhì)多肽混合物進行1 h洗脫分離，洗脫梯度為5%-30%的緩沖液(0.1%FA，90.0%CAN；流速0.3 mL/min)。通過TripleTOF5600質(zhì)譜儀(全掃描分辨率40000，二級掃描分辨率20000)進行分析，鑒定多肽混合物，每個樣本均掃描三次。分析結(jié)果文件保存至iProx數(shù)據(jù)庫中。

1.2.5免疫印跡試驗 應(yīng)用免疫印跡試驗分析目的蛋白(PDIA3)在腎癌和癌旁組織中的表達量，并對PDIA3液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜的結(jié)果加以驗證。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PDIA3液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)分析結(jié)果

本試驗根據(jù)液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)對樣本差異蛋白進行了分析，結(jié)合豐度和蛋白譜圖數(shù)比值、差值發(fā)現(xiàn)了23個腎癌組織差異表達的蛋白，其中顯著高表達的蛋白共有15個，顯著低表達的蛋白共有8個，見表1。目標(biāo)蛋白PDIA3為顯著高表達蛋白，PDIA3質(zhì)譜圖結(jié)果如圖1所示。

表1 腎癌及癌旁組織差異表達蛋白

圖1 PDIA3質(zhì)譜圖結(jié)果

2.2 PDIA3免疫印跡試驗分析結(jié)果

應(yīng)用免疫印跡試驗驗證PDIA3液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜的分析結(jié)果，結(jié)果顯示PDIA3的表達量顯著升高，明顯高于配對的癌旁組織，如圖2所示。

圖2 PDIA3免疫印跡試驗分析結(jié)果(A腎癌組織；B癌旁組織)

3 討論

PDIA3是一種廣泛存在于真核生物中，分子量為58.5kD的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白，具有1，25D3-MARRS、ERp57等別名[4]。PDIA3是一種伴侶蛋白，不僅能夠進行蛋白質(zhì)的修飾、折疊還能同時發(fā)揮疏基、氧化還原的作用[5]。PDIA3可高表達于免疫細胞中，涉及多種的細胞學(xué)功能并參與多途徑的生物學(xué)過程，包括組裝MCH-I、調(diào)控STAT3通路[6]及介導(dǎo)細胞凋亡機制等。PDIA3影響著多種癌組織的發(fā)生和發(fā)展，調(diào)節(jié)癌細胞的增殖，對惡性腫瘤的預(yù)后及治療起到了至關(guān)重要的作用[7]。已有研究表明，PDIA3可影響宮頸癌細胞的侵襲力，當(dāng)PDIA3呈現(xiàn)顯著的低表達時，則說明宮頸癌預(yù)后不良[8]。PDIA3還可作為結(jié)腸癌的預(yù)后指標(biāo)，血清中PDIA3表達量越高則提示結(jié)腸癌患者的預(yù)后越好[9]、死亡率越低。更有報道指出PDIA3可通過參與T細胞免疫應(yīng)答通路，進而對肝細胞性肝癌產(chǎn)生影響[10]。PDIA3獨特的生物學(xué)特性，是探尋其是否可以作為更多癌癥候選標(biāo)志物的前提。

我國腎癌的發(fā)病率逐年遞增，死亡率也高居不下[11]，這與腎癌的臨床表現(xiàn)和疾病的發(fā)展規(guī)律密不可分。遺傳因素、家族腎癌病史、高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙及肥胖等都是導(dǎo)致腎癌發(fā)生的危險因素。早期腎癌非常隱匿，臨床癥狀不典型，部分患者在確診時已為腎癌IV期并伴遠端轉(zhuǎn)移，故而預(yù)后較差。腎癌可分為16個組織學(xué)亞型，其中腎透明細胞癌型占比最大，可約達75%[12]，而余下15個組織學(xué)亞型中部分亞型較為罕見，如集合管癌(CDC)、梭形細胞癌(MTSCC)等，充分說明了腎癌具有高度的形態(tài)學(xué)異質(zhì)性[13]，這使腎癌的早期診斷和篩查難以開展[14]。腎切除術(shù)是目前對腎癌患者的主要治療手段，但即便移除腎癌組織，部分患者仍面臨著復(fù)發(fā)的風(fēng)險和預(yù)后不良的結(jié)局。故提供新的腫瘤標(biāo)志物和新的靶點是目前臨床上診斷和治療腎癌的關(guān)鍵[15]。

本研究共收集了18例患者的腎癌及癌旁組織作為試驗樣本，應(yīng)用二維高pH反相高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對樣本中的蛋白進行了詳細分析，結(jié)合豐度和蛋白譜圖數(shù)比值，共發(fā)現(xiàn)了23個差異表達的蛋白，其中目標(biāo)蛋白PDIA3為顯著高表達，免疫印跡試驗的結(jié)果也同步證實了PDIA3在腎癌組織中的表達量明顯高于與之配對的腎癌癌旁組織，故PDIA3可能成為診斷腎癌的新候選標(biāo)志物，為臨床早期診斷腎癌提供了重要意義。目前關(guān)于PDIA3與腎癌的相關(guān)研究較少，PDIA3在腎癌的發(fā)生和發(fā)展中起到的作用和具體機制仍未明確，因此，在今后的科研工作中，我們將對其進行更為深入的探討和研究，以期能夠為腎癌的診斷、治療和預(yù)后提供方向。