倪宇昕，王 勇，鄧艷芳

(1.華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院 口腔科,廣東 深圳518052；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

菌斑生物膜是細(xì)菌與細(xì)胞外基質(zhì)的共同聚合體，其對(duì)常規(guī)抗菌藥的抵抗力要高于浮游細(xì)菌[1-3]。多種疾病的發(fā)生都與難以根除的特定細(xì)菌生物膜的形成有關(guān)[2,4]?？莶菅挎邨U菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌形成的生物膜能導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率增加[5-9]。針對(duì)這一難題，學(xué)者已經(jīng)研發(fā)了多種破除細(xì)菌生物膜的新方法[10]。其中，D-氨基酸因?yàn)橐种粕锬ば纬啥徽J(rèn)為是對(duì)抗細(xì)菌生物膜的有效方法[1,5-8]。除了直接的抗菌作用外，D-氨基酸還會(huì)影響宿主免疫系統(tǒng)。D-苯丙氨酸通過(guò)G偶聯(lián)蛋白受體調(diào)節(jié)嗜中性粒細(xì)胞的趨化性，D-苯丙氨酸和D-亮氨酸通過(guò)甜味受體抑制先天免疫，D-色氨酸調(diào)節(jié)呼吸道的免疫耐受性[11]。巨噬細(xì)胞在防御病原體以及組織修復(fù)重塑中起著不可或缺的作用。根據(jù)微環(huán)境的差異，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出不同的功能表型，即促炎的M1極化或抗炎的M2極化[12]。IFN-γ能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M1表型，其特征是TNF-α，IL-6和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等炎性細(xì)胞因子升高[13]。而IL-4或IL-13會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化的發(fā)生，隨后于IL-10和TGF-β升高而IL-12降低?；诰奘杉?xì)胞的治療策略在慢性炎性疾病[14-15]、自身免疫性疾病[16-17]和腫瘤[18-19]的治療中已展示較好前景。然而D-氨基酸是否直接影響巨噬細(xì)胞極化還不明確。因此，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)明確了D-纈氨酸對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞M1極化的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和主要試劑D-纈氨酸購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(上海，中國(guó))。LPS、IFN-γ、Elisa試劑盒和iNOS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司(北京，中國(guó))。CCK-8試劑盒和引物購(gòu)自生工生物(上海，中國(guó))。熒光顯微鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯(日本)。RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心(北京，中國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組液氮中取出凍存細(xì)胞，迅速放入37℃水浴融化，吸至培養(yǎng)瓶中，加入DMEM培養(yǎng)液(含10% 胎牛血清)，置于培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、100%濕度)中培養(yǎng)。每2-3天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合到70%到80%時(shí)傳代。按著培養(yǎng)液中D-纈氨酸的濃度分組：不含D-纈氨酸的是對(duì)照組，含有D-纈氨酸的是實(shí)驗(yàn)組，每組均重復(fù)進(jìn)行3次。

1.3 細(xì)胞毒性測(cè)定將RAW264.7細(xì)胞與D-纈氨酸共同孵育24 h后，向各組細(xì)胞中加入CCK-8試劑，4 h后利用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度的測(cè)定，以對(duì)照組吸光度為1，對(duì)實(shí)驗(yàn)組的吸光度進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算。

1.4 誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞M1極化向細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入LPS (1 μg/ml)和IFN-γ(20 ng/ml)制成M1誘導(dǎo)培養(yǎng)液，用于后續(xù)M1誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。

1.5 實(shí)時(shí)定量 PCR法檢測(cè)利用M1誘導(dǎo)液培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組中D-纈氨酸濃度為80 mM。培養(yǎng)24 h后利用Trizol提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定濃度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，隨后使用進(jìn)行real time PCR實(shí)驗(yàn)。使用的引物正反序列如下：

IL-6:5′-CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG-3′，5′-CCACCTCAATGGACAGAATATCA-3′；

IL-1β：5′-AGTTGACGGACCCCAAAAG-3′，5′-TTTGAAGCTGGATGCTCTCAT-3′；

TNF-α：5′-GCTCTTCTGTCTACTGAACTTCGG-3′，5′-ATGATCTGAGTGTGAGGGTCTGG-3′；

iNOS：5′-CAGCTGGGCTGTACAAACCTT-3′，5′-CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG-3′；

β-肌動(dòng)蛋白：5′-CCACCATGTACCCAGGCATT-3′，5′-AGGGTGTAAAACGCAGCTCA-3′。

結(jié)果使用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因相對(duì)差異。

1.6 iNOS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將將檢測(cè)試劑加入M1誘導(dǎo)液中，4 h后更換培養(yǎng)液為普通培養(yǎng)液，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞并在同參數(shù)下拍照，對(duì)比不同組中細(xì)胞表達(dá)iNOS的差異。

1.7 Elisa檢測(cè)利用M1誘導(dǎo)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h，吸取培養(yǎng)液上清，離心后用于Elisa檢測(cè)IL-1β、IL-6和TNFα。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(M±SD)方式呈現(xiàn)。使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并定義P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度D-纈氨酸對(duì)Raw264.7細(xì)胞毒性本研究評(píng)估了濃度為0 mM至400 mM的D-纈氨酸對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性。如表1所示，結(jié)果顯示最佳生存力為50 mM，隨著濃度增加，呈現(xiàn)一定的細(xì)胞毒性。因此，將50 mM D-纈氨酸用于實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度D-纈氨酸對(duì)Raw264.7細(xì)胞24 h毒性分析

2.2 D-纈氨酸減少炎性因子的表達(dá)使用實(shí)時(shí)定量PCR方法分析D-纈氨酸是否影響炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，在LPS /IFN-γ刺激RAW264.7細(xì)胞后，IL-6，IL-1β，TNF-α和iNOS的mRNA水平高于未刺激的RAW264.7細(xì)胞。在LPS /IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞M1極化過(guò)程中添加50 mM D-纈氨酸則會(huì)嚴(yán)重抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄(表2)。使用ELISA來(lái)確定D-纈氨酸是否在蛋白質(zhì)水平上影響IL-6，IL-1β和TNF-α的表達(dá)，與未刺激的細(xì)胞相比，LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞呈現(xiàn)IL-6，IL-1β和TNF-α的水平升高。此外，在LPS /IFN-γ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1極化過(guò)程中添加50 mM D-纈氨酸可部分抑制這一作用(表3)。使用熒光顯微鏡檢測(cè)iNOS的表達(dá)量。如圖1所示，在LPS /IFN-γ的存在下，細(xì)胞中的熒光急劇增加，而D-纈氨酸的添加則抑制了這種增強(qiáng)，提示細(xì)胞中iNOS表達(dá)下降，這與PCR結(jié)果一致。

表2 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果

表3 Elisa結(jié)果 (pg/ml)

圖1 細(xì)胞iNOS熒光檢測(cè)(40×)

3 討論

D-氨基酸對(duì)于細(xì)菌生物膜的破除作用已在多個(gè)研究中被證實(shí)。D-酪氨酸聯(lián)合丁胺卡那霉素對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的影響，補(bǔ)充D-酪氨酸克服了銅綠假單胞菌生物膜對(duì)AMK的耐藥性[8]。Leiman等人的一項(xiàng)研究也報(bào)道了D型氨基酸對(duì)枯草芽孢桿菌生物膜形成的破除作用，該抑制作用是由于D型氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制而產(chǎn)生的[20]。此外，有學(xué)者研究了D型氨基酸對(duì)抗菌肽的作用，證實(shí)其能夠促進(jìn)抗菌肽的作用[21]。但是關(guān)于D型氨基酸對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的影響還不明確，因此本研究中針對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行了初步探索。

因?yàn)镈型氨基酸不存在于人體內(nèi)，所以首先需要明確D-纈氨酸的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明低濃度時(shí)沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性，而高濃度時(shí)呈現(xiàn)出一定毒性，據(jù)此選擇了50 mM作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度，也提示在具體應(yīng)用時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮潛在的毒性反應(yīng)。在應(yīng)用D型氨基酸進(jìn)行細(xì)菌破膜效應(yīng)時(shí)，需要面對(duì)相對(duì)復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境，特別是對(duì)細(xì)菌清除直接相關(guān)的巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞是參與先天性免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)劑，并且已經(jīng)被認(rèn)為是組織炎癥進(jìn)展中的關(guān)鍵因素。巨噬細(xì)胞的兩種不同表型，由經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(M1)和交替活化的巨噬細(xì)胞(M2)組成，在炎癥和組織修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮不同作用。M1巨噬細(xì)胞可以由單核細(xì)胞在LPS和IFN-γ刺激下，通過(guò)經(jīng)典的NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)，而M2巨噬細(xì)胞可由單核細(xì)胞通過(guò)M-CSF和IL-4刺激而來(lái)。

本研究采用LPS聯(lián)合IFN-γ的方法誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞。通過(guò)對(duì)標(biāo)志物的熒光定量PCR結(jié)果和Elisa結(jié)果分析，表明成功的實(shí)現(xiàn)了誘導(dǎo)。單純應(yīng)用D-纈氨酸不會(huì)引起顯著的炎性因子升高，但是在誘導(dǎo)液條件下，卻能夠抑制炎癥反應(yīng)，明顯降低IL1β、IL6和TNFα的表達(dá)。通過(guò)分析細(xì)胞中iNOS的表達(dá)也證實(shí)了D-纈氨酸的抗炎作用，綜合這些證據(jù)，可以明確適宜濃度的D-纈氨酸具有一定的抗炎效果，從而發(fā)揮抗菌和抗炎的協(xié)同效果，從而具有較好的應(yīng)用前景。但是受限于本研究中采用的體外研究方法，仍需要更多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這一作用，此外關(guān)于其可能的抗炎機(jī)制也需要在今后的研究中進(jìn)一步發(fā)掘。