蘇真娟,王夢(mèng)濤

(盤錦市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科微生物室,遼寧 盤錦124010)

沙眼衣原體是一種傳播廣泛的胞內(nèi)寄生病原體，最常見于有不潔性生活史的青年人[1]。由于感染者初期多無癥狀，使得沙眼衣原體感染的診斷較為困難[2]。為避免其引起的附睪炎和前列腺炎進(jìn)而影響男性生育功能，對(duì)沙眼衣原體感染的早期診斷變得十分重要[3]。目前診斷沙眼衣原體感染的金標(biāo)準(zhǔn)是基于PCR的核酸擴(kuò)增技術(shù)，盡管該技術(shù)具有高度的特異性和敏感性，但耗時(shí)長，需要復(fù)雜和昂貴的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備[4]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新型、高靈敏度和特異性的診斷工具，其易于操作且耗時(shí)短，不需要復(fù)雜和昂貴的PCR熱循環(huán)儀，已成為新一代具有潛力的診斷方法[5]。然而，尿液標(biāo)本的檢測(cè)需要事先裂解并從病原體中提取RNA，目前病原體細(xì)胞裂解液制備技術(shù)大多復(fù)雜而耗時(shí)，并且需要完全集成的自動(dòng)化平臺(tái)[6]。近年的研究表明抗菌肽作為一種非常有效的支原體裂解劑，可在等溫?cái)U(kuò)增前作為快速有效的樣品制備劑[7]。因此，本研究擬將LAMP技術(shù)與抗菌肽裂解法相結(jié)合，從而快速、靈敏地檢測(cè)人尿中的沙眼衣原體。

1 研究方法

1.1 臨床標(biāo)本采集選取盤錦市中心醫(yī)院2019年12月至2020年06月接受尿液衣原體檢測(cè)的患者100例，患者年齡18-33歲，女性44例，男性56例，排除抗生素使用史及細(xì)菌感染患者，由患者自行收集清晨第一次尿液樣本20-25 ml到清潔聚丙烯小皿中，并且在1天內(nèi)接受檢測(cè)。根據(jù)我院常規(guī)采用沙眼衣原體(CT)/淋球菌(NG)質(zhì)控試劑盒(羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司)以定量PCR法檢測(cè)沙眼衣原體感染。

1.2 引物設(shè)計(jì)和篩選選擇沙眼衣原體隱性質(zhì)粒作為目的基因，使用在線引物比對(duì)工具BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)及LAMP引物設(shè)計(jì)軟件LAMP Designer 1.10設(shè)計(jì)沙眼衣原體特異性LAMP引物及環(huán)狀引物以加快擴(kuò)增時(shí)間，提高靈敏度。并且使用Oligo Analyser tool對(duì)引物進(jìn)行復(fù)篩，引物設(shè)計(jì)原則：引物對(duì)DNA位點(diǎn)有較高的敏感性，環(huán)狀引物上沒有非特異性背景，盡量避免含有易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)、發(fā)夾或分子相互作用的序列并且綜合Tm 值、△G 值、GC 含量等參數(shù)。最終得到了LAMP引物6條，由上海生工生物工程有限公司合成，采用生物素標(biāo)記引物FIP和LF的5’末端，采用FAM標(biāo)記BIP和LB引物的5’末端，見表1。

1.3 抗菌肽樣本預(yù)處理每30 μl尿液樣本中加入4 μl 1×抗菌肽裂解液(德國SelfD生物技術(shù)有限公司)后在90℃下預(yù)熱5 min，然后置于冰上冷卻，取5 μl裂解物用后續(xù)實(shí)驗(yàn)，另取5 μl未作裂解處理的尿液作為對(duì)比。

1.4 實(shí)時(shí)熒光 LAMP反應(yīng)使用LAMP反應(yīng)試劑盒(海研拓生物科技有限公司)，反應(yīng)為40 μl體系，其中包括5 μl裂解后或未處理的尿液、2×LAMP反應(yīng)Mix10 μl、25 mM MgCl23 μl、8 U/μL Bst DNA聚合酶1.5 μl、0.5 μl SyberGreen熒光染料、0.3 μl ROX(美國賽默飛生物科技有限公司)和引物(見表1)；引物的終濃度分別為FIP/BIP 0.8 μM，F(xiàn)3/B3 0.2 μM，LF/LB 0.4 μM，然后補(bǔ)水至40 μl。使用Applied Biosystems 7900HT(美國賽默飛生物科技有限公司)實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為 64 ℃，每循環(huán)1 min，共40個(gè)循環(huán)，重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)均以雙蒸水為模板作為陰性對(duì)照。

表1 引物信息表

1.5 特異性實(shí)驗(yàn)以6種其他的常見菌株(大腸埃希菌、屎腸球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、副溶血鏈球菌)作為特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)有無非特異性擴(kuò)增曲線。使用 BHI 固體培養(yǎng)基(Oxoid 公司)培養(yǎng)上述菌株后挑取單菌落用核酸快速提取試劑盒(QIAGEN公司)提取DNA用于 LAMP 擴(kuò)增檢測(cè)，反應(yīng)條件中將5 μl尿液替換為1.2 μl DNA模板，其余條件同上，每一樣本重復(fù)3次。

1.6 靈敏性實(shí)驗(yàn)取步驟4中的PCR產(chǎn)物，采用UltraPureTMAgarose(美國賽默飛生物科技有限公司)進(jìn)行核酸電泳純化后檢測(cè)DNA濃度并且根據(jù)產(chǎn)物長度計(jì)算基因拷貝數(shù)，據(jù)此進(jìn)行濃度梯度稀釋再進(jìn)行 LAMP 反應(yīng)靈敏性實(shí)驗(yàn)。

1.7 臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以PCR熒光法檢測(cè)作為金標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估LAMP實(shí)驗(yàn)的臨床性能，以靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度及一致率作為真實(shí)性評(píng)價(jià)指標(biāo)，靈敏度為LAMP實(shí)驗(yàn)陽性人數(shù)在金標(biāo)準(zhǔn)(PCR熒光法)陽性人數(shù)中所占比例，特異度為LAMP實(shí)驗(yàn)陰性人數(shù)在金標(biāo)準(zhǔn)陰性人數(shù)中所占比例，準(zhǔn)確度為靈敏度+特異度-1，一致率為兩種方法結(jié)果一致(均為陽性或陰性)人數(shù)在總受試對(duì)象中所占比例。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)

與未接受抗菌肽裂解處理的尿液樣本相比，裂解后樣本反應(yīng)效率大幅提高，10循環(huán)左右即可達(dá)到平臺(tái)期，見圖1。

圖1 尿樣沙眼衣原體隱性質(zhì)粒LAMP擴(kuò)增曲線

A 未接受抗菌肽裂解處理的尿液樣本的LAMP擴(kuò)增曲線 B接受抗菌肽裂解處理的尿液樣本的LAMP擴(kuò)增曲線

2.2 特異性實(shí)驗(yàn)

測(cè)試所用6種常見病原菌在LAMP擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中均未出現(xiàn)特異性曲線，僅沙眼衣原體樣本出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增，可見沙眼衣原體與其他病原菌在LAMP實(shí)驗(yàn)中無交叉反應(yīng)，見圖2。

圖2 尿樣沙眼衣原體隱性質(zhì)粒LAMP擴(kuò)增特異性實(shí)驗(yàn)

2.3 靈敏性實(shí)驗(yàn)

將 LAMP實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)物純化后，測(cè)得DNA濃度為 45.66 ng/μL。將其稀釋至 10-5、10-6、10-7、10-8、10-95個(gè)濃度梯度進(jìn)行 LAMP 實(shí)驗(yàn)，按10循環(huán)計(jì)算對(duì)應(yīng)模板量為 4.46×10-7、4.46×10-8、4.46×10-9、4.46×10-10、4.46×10-11ng/μL。隨著模板濃度降低，到達(dá)平臺(tái)期的循環(huán)數(shù)增加，但在4.46×10-11ng/μL模板濃度下仍能在25循環(huán)左右到達(dá)平臺(tái)期完成LAMP擴(kuò)增，見圖3。

圖3 尿樣沙眼衣原體隱性質(zhì)粒LAMP擴(kuò)增靈敏性實(shí)驗(yàn)

2.4 臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

100例受試者中，經(jīng)醫(yī)院定量PCR法測(cè)定沙眼衣原體陽性42例，未經(jīng)裂解肽處理的尿樣LAMP實(shí)驗(yàn)敏感度、特異度、準(zhǔn)確度及一致率均低于抗菌肽裂解聯(lián)合LAMP實(shí)驗(yàn)法，見表2。

3 討論

人群中沙眼衣原體感染率高達(dá)12.3%-17.4%，而其可導(dǎo)致多種泌尿生殖道疾病發(fā)生，早期診斷對(duì)沙眼衣原體感染的有效干預(yù)十分重要[8]，而人尿成分復(fù)雜，其中多種成分會(huì)影響擴(kuò)增反應(yīng)的效率。例如，尿液中的尿素會(huì)導(dǎo)致聚合酶降解[9]。因此，PCR技術(shù)檢測(cè)尿液標(biāo)本時(shí)除昂貴費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)外還極易受到尿液中其他物質(zhì)的干擾以致結(jié)果失準(zhǔn)。LAMP技術(shù)通過設(shè)計(jì)一組靶基因特異性引物，其可以自身重復(fù)發(fā)生鏈置換合成反應(yīng)，從而在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸的快速擴(kuò)增，不需PCR技術(shù)所依賴的溫度循環(huán)設(shè)備[10]。而在LAMP實(shí)驗(yàn)中引入抗菌肽裂解步驟，可以提高直接從尿樣中檢測(cè)沙眼衣原體的能力，而無需事先提取、純化和濃縮病原體遺傳物質(zhì)[11]。

表2 尿樣沙眼衣原體隱性質(zhì)粒LAMP擴(kuò)增真實(shí)性實(shí)驗(yàn)(n,%)

在本研究中，我們選擇沙眼衣原體隱性質(zhì)粒作為擴(kuò)增目的基因，隱性質(zhì)粒是沙眼衣原體中一種相對(duì)穩(wěn)定的核酸靶點(diǎn)，相比基因組DNA更能抵抗核酸酶的損傷，且其在基因組中至多可有10個(gè)拷貝，相比單拷貝基因敏感度更高[12]。在LAMP反應(yīng)中至少應(yīng)有一對(duì)外游引物(F3/B3)及一對(duì)內(nèi)游引物(FIP/BIP)，我們的研究中增加了一對(duì)環(huán)引物(LF/LB)，相比之前的報(bào)道具有更高的特異性，而且可以加快擴(kuò)增時(shí)間[13-14]。更重要的是，先前王雪亮及李若琳等人的研究均需在體外實(shí)現(xiàn)提取樣本沙眼衣原體中的遺傳物質(zhì)并進(jìn)行濃縮純化，目前關(guān)于使用LAMP技術(shù)直接在臨床樣本中進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道十分有限?？咕囊驯蛔C明是一類高效的抗菌劑，其通過識(shí)別感染衣原體細(xì)胞表面的高負(fù)電荷密度并形成特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)插入到脂質(zhì)雙分子層中穿透細(xì)胞膜進(jìn)而裂解病原體[15]。我們的研究創(chuàng)新性地在LAMP擴(kuò)增前使用抗菌肽來釋放衣原體DNA從而快速有效制備待檢樣本。由于不需事先提取和純化DNA，使得整個(gè)檢測(cè)過程變得簡(jiǎn)單而省時(shí)。傳統(tǒng)PCR定量技術(shù)需要60 min左右的擴(kuò)增時(shí)間，而聯(lián)合抗菌肽裂解法的LAMP擴(kuò)增僅需十余分鐘即可達(dá)到平臺(tái)期，由于直接使用尿液樣本難以避免其他微生物的干擾，我們?cè)O(shè)計(jì)了特異性實(shí)驗(yàn)，使用了6種常見病原菌來測(cè)試使用該方法檢測(cè)沙眼衣原體與其他病原菌的交叉反應(yīng)，結(jié)果顯示其特異性良好，不會(huì)受到雜菌污染的影響。敏感性實(shí)驗(yàn)中即使模板DNA被稀釋10-9倍反應(yīng)仍能在25循環(huán)左右到達(dá)平臺(tái)期，可見本方法穩(wěn)定性良好，不容易受到樣本稀釋的影響。臨床樣本的真實(shí)性實(shí)驗(yàn)中未經(jīng)裂解肽處理的尿樣LAMP實(shí)驗(yàn)敏感度、特異度均在74%左右，可見未經(jīng)裂解及DNA富集的LAMP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)效能欠佳，而抗菌肽裂解聯(lián)合LAMP實(shí)驗(yàn)法的敏感度、特異度提高至83.3%及86.2%，一致率達(dá)85.0%，可以實(shí)現(xiàn)尿液衣原體快速且高效檢測(cè)，尤其是在大規(guī)模人群篩查中極具優(yōu)勢(shì)。后續(xù)有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本的檢測(cè)量以進(jìn)一步驗(yàn)證其檢測(cè)效能及穩(wěn)定性。

聯(lián)合抗菌肽裂解法的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)能實(shí)現(xiàn)尿液沙眼衣原體的快速檢測(cè)，且特異度、靈敏度及臨床性能較好，具有一定臨床應(yīng)用前景。