崔鳳姬，張志強，張明杰，焦?jié)扇A，蒙景艷

(1.內蒙古計劃生育科學技術研究所，內蒙古 赤峰 024000；2.赤峰市中心血站，內蒙古 赤峰 024000)

0 引言

自然流產發(fā)病率為15%～40%，其中80%為早期自然流產[1]。文獻報道，胚胎染色體數(shù)目異常是早期自然流產最常見的原因，占40%～60%。隨著分子遺傳學技術的不斷發(fā)展，對染色體異常檢出率逐步提高，我們發(fā)現(xiàn)染色體結構異常也是自然流產的重要原因。

目前臨床上常用的絨毛組織細胞培養(yǎng)法染色體核型分析是一種傳統(tǒng)的方法，存在很多缺點，如組織污染會造成培養(yǎng)失敗，染色體微缺失微重復癥不能檢測等[2]。近年來，隨著低深度全基因組測序的不斷發(fā)展，因其具有高通量、高準確率、高分辨率、高效等特點而廣泛應用于臨床疾病的診斷。我們通過使用低深度全基因組測序技術檢測染色體數(shù)目和結構異常，了解胚胎停育285例患者絨毛染色體異常情況及其與患者年齡的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集我院2018年11月至2020年11月婦產科門診經超聲提示“胚胎停育”并自愿人工流產患者285例的臨床資料。年齡22～47歲，平均（32.78±5.24）歲，胚胎停育的孕周為6～12周，平均（8.71±2.04）周，排除孕期感染以及不良接觸史，均獲得受檢者知情同意。本研究征得赤峰市婦產醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 低深度全基因組測序技術

取約30mg絨毛，用生理鹽水清洗干凈，消化裂解絨毛組織，純化并洗脫后得到DNA,用Qubit來測DNA濃度，提取出的基因組DNA酶切斷，文庫構建，PCR擴增，得到DNA小片段文庫。乳液PCR和模板富集后使用DA8600平臺進行測序，檢測染色體非整倍體和全基因組范圍的拷貝數(shù)變異，判斷絨毛流產組織的染色體情況。將高通量測序所得數(shù)據(jù)通過公共數(shù)據(jù)庫進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

Sigma Plot 2000軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)值均用均數(shù)±標準差（）表示，采用t檢驗進行顯著性分析。

2 結果

2.1 胚胎停育絨毛染色體數(shù)目異常情況

285例胚胎停育絨毛中，染色體正常135例（47.4%），染色體異常150例（52.6%），其中染色體數(shù)目異常132例（46.3%）。132例染色體數(shù)目異常的患者中常染色體三體102例（73.5%），包括16號染色體25例、22號染色體14例、15號染色體12例、2號染色體6例、21號染色體6例、8號染色體6例、18號染色體5例、10號染色體5例、9號染色體4例、14號染色體4例、6號染色體3例、4號染色體2例、3號染色體1例、5號染色體1例、17號染色體1例、20號染色體1例、13號染色體1例、7+21號染色體1例、2+13號染色體1例、16+21號染色體1例、8+14號染色體1例、9+8號染色體1例；單體9例（6.8%），包括X-單體8例、21-單體1例；嵌合體21例（15.9%），包括4-三體（74%）、2-三體（72%）、16/22-三體（67%）、22-三體（67%）、16-三體（66%）、-X/+22（59%）、4-三體（52%）、15-單體（47%）、4/6-三體（47%）、22-三體（42%）、15-三體（33%）、-X/+Y,XYY（31%）、-X/+21（30%）、+7/-7（30%）、13/18-三體（30%）、7-三體（28%）、10/18三體（21%）、6-三體（21%）、6-三體（21%）、+15/-X（10%）、-X（9%）各1例。

2.2 胚胎停育絨毛染色體結構異常情況

在染色體結構異常的18例中，有7例（38.9%）染色體缺失，10例（55.6%）染色體重復，染色體缺失重復同時存在的1例（5.6%）。染色體結構異常18例中檢出拷貝數(shù)變異23種，查詢公共數(shù)據(jù)庫11例被判定為致病性CNVs,2例可能致病性CNVs，5例致病性未知，見表1。

表1 胚胎停育絨毛染色體結構異常CNVs統(tǒng)計結果

2.3 年齡與染色體異常的關系

低齡孕婦196例患者中染色體異常96例，異常率為49%；高齡孕婦89例患者中染色體異常59例，異常率為60.7%。兩組患者染色體異常率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

高齡孕婦染色體數(shù)目異常50例（56.2%）高于低齡孕婦染色體數(shù)目異常82例（41.8%）。低齡孕婦染色體結構異常14例(7.1%)高于高齡孕婦染色體結構異常4例(4.9%），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 低齡孕婦與高齡孕婦染色體分布情況

3 討論

妊娠早期的自然流產現(xiàn)已上升為臨床婦產科工作中遇到的最常見的疾病之一，患病率呈逐年上升趨勢且病因復雜。胚胎染色體異常是導致自然流產的一個主要因素[3]，并且也是出生缺陷的主要危險因素。早期流產絨毛染色體檢測，為患者提供有效的生育相關的遺傳咨詢，也激勵人們去尋找染色體正常胎兒流產的病理學原因[4]。

低深度全基因組測序檢測在本285例絨毛檢測中成功率為100%，染色體異常占52.6%（150/285），研究提示染色體異常是早期胚胎停育的主要原因，文獻報道的50%～60%相符合[5]。低深度全基因組測序應用檢測范圍廣，已知的100kb以上的微缺失微重復和＞10%嵌合能檢測，所以比絨毛培養(yǎng)和FISH法的染色體異常率高。以往的核型分析只能檢查出10M以上的染色體結構異常，這就導致許多存在微小結構異常的常常被漏診。本研究150例胚胎停育絨毛染色體異常中，染色體數(shù)目異常132例（46.3%）其中，常染色體三體102例，占比73.5%（102/132）；單體9例，占比6.8%（9/132）；異常染色體除了1號、11號、12號以及19號染色體以外均有檢出，其中16號染色體25例、22號染色體14例、15號染色體12例，以上三種最多見，和以往文獻報道數(shù)據(jù)[6]相符合，本研究還檢測到染色體嵌合體21例，占比15.9%（21/132），嵌合體是染色體異常類型之一，指不同遺傳性狀嵌合或混雜表現(xiàn)的個體，是由于細胞有絲分裂不分離或染色體丟失所導致的。近些年，陸續(xù)出現(xiàn)的基于測序技術的基因拷貝數(shù)變異分析平臺開始在染色體異常檢測方面應用，在某些方面，如嵌合體檢測，甚至比芯片平臺更具優(yōu)勢[7-8]。

本研究還檢出染色體結構異常有18例，占比6.3%，Zhu等在SNP-Array平臺研究證明絨毛異常染色體中，微缺失和微重復占7.14%[9]，與文獻報道一致，18例染色體結構異常中檢出拷貝數(shù)變異CNVs23種，其中11例為致病性CNVs包含了4p缺失綜合征2例，臨床表現(xiàn)為生長發(fā)育遲緩，智力障礙，癲癇，發(fā)病率1/50000。2q33微缺失綜合征（Glass綜合征）1例，臨床表現(xiàn)為中度至重度發(fā)育遲緩，言語遲緩，骨骼異常。2p部分三體綜合征1例，臨床表現(xiàn)為嚴重智力障礙等。文獻報道，采用低深度全基因組測序對智力低下的患者進行遺傳學分析，結果顯示這些患者染色體結構上存在微缺失微重復[10]。本研究2例疑似病例，需對其父母進行檢測，看是否遺傳自雙親，包含5例致病性未知的CNVs，還有待于進一步研究。核型分析檢測10M大小的結構異常，用FISH準確檢測3Mb大小的結構異常，用低深度全基因組測序準確檢測已知的100kb以上的結構異常，因此該技術檢出率高于別的方法，避免因微小片段引起的微缺失微重復異常漏診，為臨床查明流產原因提供依據(jù)，為患者下次妊娠提供幫助。

染色體數(shù)目異常與女性年齡的增長呈正相關，隨著女性年齡的增長，染色體三體比率增加，流產率增加[11-12]，因此，我們對胚胎停育的患者年齡進一步做了分析。本研究發(fā)現(xiàn)，高齡孕婦（≥35歲）絨毛組織染色體異常率占60.7%（59/89），高于低齡孕婦（＜35歲）染色體異常率占49%（96/196），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這個結論跟文獻報道一致。本研究低齡孕婦結構異常率占7.1%（14/196）高于高齡孕婦結構異常率4.9%（4/89），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。染色體結構異常不分年齡，本研究反而低齡孕婦高于高齡孕婦,主要癥狀為發(fā)育遲緩和智力低下等，染色體異常孕婦再次妊娠需進行產前診斷阻斷出生缺陷兒的發(fā)生。

綜上所述，染色體異常是早期胚胎停育的主要病因。低深度全基因組測序作為全新的技術，能快速、準確的檢測出染色體數(shù)目異常及核型技術無法檢測的拷貝數(shù)變異，極大的提高了診斷水平。同時，低深度全基因組測序可以檢測出胚胎停育的絨毛組織染色體微缺失和微重復，使檢測染色體結構異常方面有了新的途徑，并且檢測率和分辨率高，明確早期流產遺傳學病因，值得臨床廣泛應用，為患者后續(xù)的再生育和優(yōu)生提供診斷指導。