張超，李永帥，章曉聯(lián)，劉光輝

哮喘是一種多種炎癥細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥性疾病，過敏原導(dǎo)致的氣道炎癥是形成哮喘最核心的病理生理過程之一。氣道上皮細(xì)胞被認(rèn)為是參與對(duì)過敏原、病毒等異物入侵的一線免疫防御天然免疫細(xì)胞。屋塵螨(house dust mite,HDM)是一類存在于灰塵和填充物中可導(dǎo)致變應(yīng)性疾病的最常見氣傳過敏原[1]。既往研究表明，HDM接觸氣道上皮后，可以通過樹突狀細(xì)胞募集Th2細(xì)胞等誘導(dǎo)2型炎癥的形成，刺激產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-13等炎癥因子參與過敏反應(yīng)。近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氣道上皮細(xì)胞也直接介導(dǎo)過敏原的免疫效應(yīng)，是重要的固有免疫細(xì)胞，其通過產(chǎn)生IL-25、IL-33和胸腺基質(zhì)淋巴生成素構(gòu)成過敏性哮喘的發(fā)生機(jī)制之一；同時(shí)HDM也可通過激活TLR2通路，增強(qiáng)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)IL-6等細(xì)胞因子的釋放[2-3]。

細(xì)胞因子IL-32在1992年首次發(fā)現(xiàn)，由多種細(xì)胞(如NK細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞)產(chǎn)生，可在細(xì)胞內(nèi)通過I-κB通路和p38-MAPK通路激活NF-κB信號(hào)，調(diào)節(jié)信號(hào)下游的免疫效應(yīng)[4-5]。高劑量的IL-2、IFN-γ、TNF-α、Th1細(xì)胞因子可誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞IL-32 mRNA的表達(dá)[6-8]。大量研究表明IL-32的免疫調(diào)節(jié)功能具有多樣性，其生物學(xué)效應(yīng)兼具促炎和抗炎作用[9]。到目前為止，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)IL-32的表達(dá)異常與炎癥性疾病和過敏性疾病相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，鼻病毒感染可誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞哮喘炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，并促進(jìn)IL-32的表達(dá)[10]。哮喘患者誘導(dǎo)痰中IL-32水平的增加與哮喘急性發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[11]，提示在缺少抗炎治療的情況下，抑制IL-32的表達(dá)可能具有抑制哮喘氣道炎癥的作用。然而，IL-32在屋塵螨所致過敏性哮喘的固有免疫效應(yīng)中的作用鮮有報(bào)道。本研究觀察HDM對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞IL-32及相關(guān)炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響，探究IL-32表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年男性人支氣管上皮細(xì)胞(16HBECs)，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)公司。HDM提取物購自北京博蕾德科技發(fā)展有限公司。GAPDH、IL-32、IL-8、IL-1β、TNF-α及NF-κB等相關(guān)PCR引物于武漢擎科生物技術(shù)公司合成。Western blotting檢測(cè)法所需兔抗p-p38抗體、兔抗p-p65抗體、兔抗TLR-4抗體購自美國CST公司，鼠抗GAPDH抗體購自Abcam公司；HRP-羊抗鼠IgG購自美國Proteintech公司以及HRP-羊抗兔IgG購自Abcam公司。IL-32、IL-6、IL-8以及IL-1β等細(xì)胞因子ELISA試劑盒(96T)購自北京四正柏生物科技有限公司。

1.2 人支氣管上皮細(xì)胞致敏模型構(gòu)建

將16HBE細(xì)胞用KM培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加必需血清。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，定時(shí)更換培養(yǎng)基。接種16HBE細(xì)胞到12孔板上，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)到大約80%融合時(shí)，隨機(jī)分成4組：A為對(duì)照組；B、C、D為不同濃度HDM稀釋液刺激組，B、C、D組HDM稀釋液的濃度分別為2、10、20 μg/mL，刺激時(shí)長(zhǎng)均分別為6、12和24 h。

1.3 RT-PCR檢測(cè)16HBE細(xì)胞IL-32、IL-8、IL-1β、TNF-α及NF-κB mRNA表達(dá)

用RNA Trizol試劑盒提取各組16HBE細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。配制20 μL RT-PCR反應(yīng)體系，設(shè)置反應(yīng)條件，進(jìn)行RT-PCR上機(jī)檢測(cè)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用ΔΔCt法對(duì)目的基因結(jié)果進(jìn)行定量分析。GAPDH和IL-32、IL-8、IL-1β、TNF-α及NF-κB等引物序列見表1。

表1 GAPDH、IL-32、IL-8、IL-1β、TNF-α及NF-κB等引物序列Table 1 Primer sequences of GAPDH, IL-32,IL-8,IL-1β,TNF-α, and NF-κB

1.4 細(xì)胞上清液中IL-32和相關(guān)炎癥因子水平測(cè)定

無菌EP管收集各組16HBE細(xì)胞上清液，室溫低速離心2次。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行人IL-32和IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥因子表達(dá)水平檢測(cè)，每個(gè)樣品均設(shè)兩個(gè)復(fù)孔，取其平均值。

1.5 細(xì)胞內(nèi)p-p38、p-p65、TLR-4蛋白水平免疫印跡分析

將對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組16HBE細(xì)胞用2×SDS-loading buffer裂解，煮沸后用BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)檢測(cè)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大小配制對(duì)應(yīng)的分離膠和濃縮膠，進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，最后用濕法轉(zhuǎn)膜和發(fā)光顯影，通過對(duì)比條帶色深度確定蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

本研究使用軟件SPSS 25.0和GraphPad Prism V.7.00軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有呈正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)資料以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，并采用Levene檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。兩樣本間均數(shù)差異比較采用Student’st-檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析處理。P<0.05，認(rèn)為結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HDM刺激16HBE細(xì)胞后炎癥因子mRNA表達(dá)譜變化

16HBE細(xì)胞經(jīng)不同濃度HDM刺激24 h后，各刺激組IL-32 mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著上調(diào)，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性(圖1A)。HDM各不同刺激濃度下， IL-32 mRNA表達(dá)水平均可見時(shí)間依賴效應(yīng)(圖1B～D)。在高濃度(20 μg/mL)HDM刺激條件下，IL-32 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比，在各刺激時(shí)長(zhǎng)均大量升高，且在刺激24 h達(dá)到高峰(P<0.001，圖1D)。

不同濃度HDM刺激16HBE細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)IL-8、IL-1β、TNF-α和NF-κB mRNA表達(dá)水平均顯著增高，且刺激濃度越高，IL-1β、TNF-α和NF-κB的表達(dá)水平越高(P<0.01，圖2A、C)。高濃度(20 μg/mL)HDM刺激下，刺激時(shí)間越長(zhǎng)，NF-κB及與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)的IL-8，IL-1β、TNF-α炎癥因子mRNA的表達(dá)上調(diào)更為顯著，尤其在刺激24 h時(shí)，炎癥因子表達(dá)水平達(dá)到高峰(P<0.01，圖2B、D)，16HBE細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路處于激活狀態(tài)。

2.2 HDM刺激16HBE細(xì)胞后炎癥因子分泌的變化

不同濃度HDM刺激24 h后(圖3A)，16HBE細(xì)胞IL-32分泌水平較對(duì)照組顯著上調(diào)，呈一定劑量依賴效應(yīng)。高濃度(20 μg/mL)刺激下，IL-32分泌水平呈明顯的時(shí)間依賴性(圖3B)，且在刺激24 h后表達(dá)差異更顯著(P<0.01)。

HDM刺激16HBE細(xì)胞6 h，僅在高濃度HDM(20 μg/mL)作用下，IL-1β分泌顯著增高(P<0.01。圖4A)。HDM刺激24 h，各濃度刺激條件下， IL-1β、IL-6、IL-8分泌水平均顯著上調(diào)圖(P<0.05，圖4B～D)，且IL-6和IL-8的分泌與HDM呈一定濃度依賴效應(yīng)。

2.3 HDM刺激16HBE細(xì)胞后p-p38、p-p65、TLR-4蛋白表達(dá)

不同濃度、不同時(shí)長(zhǎng)HDM刺激16HBE細(xì)胞后， p-p38表達(dá)水平與HDM濃度和刺激時(shí)長(zhǎng)呈現(xiàn)良好的依賴效應(yīng)(圖5A)。核因子κB相關(guān)磷酸化蛋白p-p65和p-p38蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)相同(圖5B)。HDM刺激6 h后TLR-4表達(dá)有所增加(圖5C)。

3 討論

支氣管哮喘具有典型的異質(zhì)性，以可逆性的阻塞性氣流受限，氣道高反應(yīng)性和復(fù)雜的免疫相關(guān)慢性氣道炎癥為主要特征[12-13]。廣泛存在于灰塵與織物中的塵螨，其分布范圍與人類活動(dòng)密切相關(guān)[14]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在哮喘患者中，環(huán)境中塵螨含量的高低與患者發(fā)病存在關(guān)聯(lián)性，環(huán)境中塵螨濃度越高，越容易引發(fā)哮喘的發(fā)作[15]。哮喘作為一種與氣道上皮細(xì)胞相關(guān)的炎癥性疾病，在塵螨過敏原刺激下，氣道上皮細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞因子與炎癥介質(zhì)激活，形成錯(cuò)綜復(fù)雜的免疫失衡網(wǎng)絡(luò)。IL-32表達(dá)異常與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸道疾病、慢性阻塞性肺疾病[8, 16-17]等多種慢性炎癥性疾病相關(guān)；而在哮喘動(dòng)物研究和臨床研究中，IL-32參與促炎效應(yīng)還是抗炎作用尚存在爭(zhēng)議[18-19]。為了探究IL-32是否是塵螨過敏原誘導(dǎo)氣道炎癥的重要介質(zhì)及其是否具備作為過敏性哮喘氣道標(biāo)志物的優(yōu)勢(shì)，本研究使用不同濃度、不同時(shí)長(zhǎng)HDM刺激16HBE細(xì)胞，測(cè)定胞內(nèi)p-p38、p-p65、TLR-4蛋白、檢測(cè)IL-32 mRNA表達(dá)及其上清中釋放水平以及下游IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥因子的表達(dá)水平。

圖 1 HDM過敏原刺激前后16HBE細(xì)胞IL-32 mRNA表達(dá)

圖 2 HDM過敏原刺激前后16HBE細(xì)胞IL-8、IL-1β、TNF-α、NF-κB mRNA表達(dá)

圖 3 HDM過敏原刺激前后16HBE細(xì)胞IL-32分泌

圖 4 HDM過敏原刺激前后16HBE細(xì)胞IL-1β、IL-6、IL-8分泌

各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)IL-32mRNA表達(dá)水平顯著增加，呈良好的濃度依賴效應(yīng)和刺激時(shí)間依賴效應(yīng)，說明高濃度過敏原與其刺激時(shí)長(zhǎng)在過敏性氣道炎癥的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮作用，提示IL-32可能具備成為反映氣道炎癥新型標(biāo)志物的潛能。IL-6、IL-8、IL-1β均屬于NF-κB信號(hào)通路下游的細(xì)胞因子，在NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活后，IL-8、IL-1β的水平通常上調(diào)。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到NF-κB以及信號(hào)通路下游的IL-8、IL-1β等炎癥因子mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)與IL-32一致的平行變化，說明過敏性氣道炎癥中，IL-32可能參與NF-κB通路的活化，IL-32可能是過敏原暴露氣道炎癥中的一種促炎因子。不僅如此，經(jīng)不同濃度HDM刺激16HBE細(xì)胞后，分泌性IL-32、IL-6、IL-8、IL-1β也同樣明顯升高，與其mRNA轉(zhuǎn)錄水平保持一致性，進(jìn)一步表明HDM可能通過激活NF-κB信號(hào)通路，以時(shí)間依賴性和(或)濃度依賴性促進(jìn)下游過敏性炎癥因子的分泌量增加；同時(shí)說明IL-32是連接這一促炎過程放大的紐帶，為該通路的激活提供了中間誘導(dǎo)介質(zhì)。

圖 5 HDM過敏原刺激前后16HBE細(xì)胞內(nèi)p-p38、p-p65、TLR-4表達(dá)

研究表明，IL-32可通過激活NF-κB途徑在自身免疫性疾病中發(fā)揮作用。因此，在過敏性氣道炎癥中，本研究進(jìn)一步探究IL-32與NF-κB途徑的關(guān)聯(lián)性。免疫印跡分析表明在不同濃度HDM刺激下，16HBE細(xì)胞內(nèi)NF-κB相關(guān)蛋白p-65磷酸化水平存在差異表達(dá)，且p-p65蛋白表達(dá)和NF-κB mRNA表達(dá)呈重疊效應(yīng)，均表現(xiàn)為HDM刺激濃度和時(shí)長(zhǎng)依賴效應(yīng)，HDM刺激濃度越高，刺激時(shí)間越長(zhǎng)，p-p65蛋白的表達(dá)更為活躍。同時(shí)，HDM接觸16HBE細(xì)胞后，p-p38蛋白和TLR-4蛋白被激活，TLR-4激活可能引起細(xì)胞內(nèi)下游相關(guān)細(xì)胞因子活化，促進(jìn)p38-MAPK通路和NF-κB信號(hào)途徑的激活。有研究表明，HDM可激活TLR-4，通過TLR4/MD-2信號(hào)路徑激活NF-κB信號(hào)通路[20]，介導(dǎo)IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子的釋放，而IL-1β、TNF-α等炎癥因子可以刺激IL-32的上調(diào)[21]。本研究顯示不同濃度HDM刺激，可能激活依賴TLR-4信號(hào)介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，IL-32可能成為TLR4/MD-2信號(hào)路徑和NF-κB信號(hào)通路緊密聯(lián)系的紐帶，并且和NF-κB、p38MAPK信號(hào)通路相互交聯(lián)，共同發(fā)揮促炎效應(yīng)，構(gòu)成該復(fù)雜過敏性氣道炎癥網(wǎng)絡(luò)中的重要一環(huán)，但可能的具體機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明不同濃度HDM刺激人支氣管上皮細(xì)胞后，能引發(fā)氣道上皮細(xì)胞變性或者損傷，從而可建立過敏性氣道上皮細(xì)胞模型。IL-32可能在過敏性氣道炎癥性疾病起到促炎作用，因其具備HDM刺激濃度、刺激時(shí)長(zhǎng)依賴性，且與IL-1β、IL-6、IL-8等下游炎癥因子表達(dá)呈相同趨勢(shì)，IL-32可能成為診斷過敏性哮喘和評(píng)估疾病嚴(yán)重程度的新型標(biāo)志物，為哮喘的靶向治療提供潛在新方向。