姚秋菊 常曉軻 程志芳 韓婭楠 張玉樂 王彬 劉衛(wèi)

摘 要：單倍體育種是當前非常重要的育種技術之一。辣椒單倍體育種技術包括：花藥培養(yǎng)技術和小孢子培養(yǎng)技術。單倍體通過自然加倍和人工加倍，為新品種培育、DH群體構(gòu)建和遺傳分析、遺傳圖譜構(gòu)建提供了重要的材料。筆者論述了辣椒花藥培養(yǎng)和小孢子培養(yǎng)2種單倍體誘導技術的研究進展、存在的問題以及存在的潛在價值，旨在為辣椒育種提供參考，促進辣椒單倍體育種技術的進一步發(fā)展和完善。

關鍵詞：辣椒;單倍體;花藥培養(yǎng);小孢子培養(yǎng);育種

中圖分類號：S641.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）07-001-06

Advances of the haploid induction technology in pepper

YAO Qiuju1， CHANG Xiaoke1， CHENG Zhifang1， HAN Yanan1， ZHANG Yule2， WANG Bin1， LIU Wei1

（1. Horticultural Institute Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450000， Henan， China; 2. Zhengzhou Agricultural Technology Extension Center， Zhengzhou 450000， Henan， China）

Abstract： Haploid breeding is one of the most important techniques. Capsicum haploid breeding technology includes anther culture technology and microspore culture technology. By natural and artificial doubling， haploid is important for breeding， DH group building and genetic analysis， genetic map construction. The paper summarized the research progress， problems and the potential application of the induction technology of anther culture and microspore culture， aiming to provide reference for pepper breeders and promote the further development and improvement of haploid breeding technology in pepper.

Key words： Pepper; Haploid; Anther culture; Microspore culture; Breeding

單倍體育種技術已成為當前植物生物技術領域令人矚目的技術之一。單倍體植株在轉(zhuǎn)基因中有很重要的作用，轉(zhuǎn)化后的植株不存在顯性和隱性問題，能夠穩(wěn)定遺傳。單倍體培育成的雙單倍體不存在等位基因的顯隱性關系，隱性基因可以得到充分的利用。獲得單倍體有2種方式：一是自然突變，自然界自然形成的單倍體概率極低，僅有0.002%～0.02%[1];二是人工誘變，包括小孢子培養(yǎng)法和花藥離體培養(yǎng)法、未受精子房離體培養(yǎng)法、輻射花粉誘導法、著絲粒介導法等。近年來，小孢子培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)啟動胚胎發(fā)育的方法成為各國科學工作者的研究熱點。單倍體育種廣泛應用于十字花科、玉米、小麥、林木等作物上[2-5]。獲得辣椒單倍體的途徑主要有辣椒花藥培養(yǎng)、辣椒小孢子培養(yǎng)。其中，花藥培養(yǎng)技術研究比較深入系統(tǒng)，選育了?；ㄏ盗衃6-7]、海豐系列 [8-9]、塞花一號[10]、豫07-01[11]等一系列優(yōu)異的品種，并被廣泛推廣，備受市場歡迎，推動了辣椒市場的發(fā)展。筆者總結(jié)了辣椒單倍體育種技術在國內(nèi)外的最新研究進展，從單倍體技術中存在的問題、DH加倍和單倍體在辣椒中的應用方面做了初步歸納分析，以期為研究者們提供一些參考。

1 辣椒單倍體誘導技術

1.1 花藥培養(yǎng)技術

辣椒花藥培養(yǎng)單倍體育種技術是1973年開始發(fā)展起來的一種新型育種方法[12-13]，是指用花藥培養(yǎng)技術得到單倍體株系，隨后加倍獲得雙單倍體（Double Haploid，簡稱DH系），直接獲得純系。辣椒花藥培養(yǎng)技術具有縮短育種時間、快速獲得純系和創(chuàng)造變異等特點，成為研究的熱點，在理論研究方面獲得了很大的進展，同時逐步進入實際應用階段，配置獲得的雜交種很具優(yōu)勢，形成了一個相對完整的辣椒育種技術體系。仍有一些影響因素阻礙了辣椒花藥培養(yǎng)技術的發(fā)展，比如基因型、植株生長狀態(tài)、預處理、培養(yǎng)條件、污染率等等，其中，影響最大的是基因型依賴、污染率高等問題，使該技術的發(fā)展受到了阻礙，也限制了辣椒花藥培養(yǎng)技術的推廣應用。

影響辣椒花藥培養(yǎng)的第一個重要因素是基因型。Ali等[14-19]研究表明，同樣的培養(yǎng)條件，不同辣椒基因型的單倍體誘導率差異很大。外國學者[20]對500個不同基因型辣椒材料進行花藥培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其單倍體誘導率介于0～76%之間。李怡裴等[21]研究13個加工型辣椒的花藥誘導，其中能夠成功誘導出胚狀體的基因型占供試材料的92.31%，胚狀體的誘導率差異比較大，在0.17%～25.31%之間。王仲慧等[22]誘導13個不同基因型辣椒，8個基因型能夠獲得健康的再生植株，13個基因型的出胚率差異明顯。黃亞杰等[23]發(fā)現(xiàn)大果甜椒類型極易出胚。王立浩等[24]對不同基因型優(yōu)化培養(yǎng)基配方，能夠提高胚狀體的誘導率?；蛐筒粌H影響辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體的誘導率，而且基因型不同，誘導產(chǎn)生單倍體或二倍體的比例也可能會存在差異;若供體植株是經(jīng)加倍的單倍體系，則花藥培養(yǎng)時雄核誘導率高，但是原始育種材料為異源的情況則難以預測。

大量文獻表明，污染率是影響辣椒花藥培養(yǎng)成苗的另外一個重要因素。有關報道指出，辣椒花藥培養(yǎng)中污染率為50%～100%，是辣椒花藥培養(yǎng)能否成功的關鍵因素之一，因此，辣椒花藥培養(yǎng)首先需要解決組織培養(yǎng)中的污染問題。除了人為操作不當，培養(yǎng)材料的徹底滅菌是植物組培工作中的重要環(huán)節(jié)，它既要求將外植體表面的微生物徹底被殺死，又要求盡可能減少外植體組織和表面細胞受到傷害[25]。梁寶萍等[26]用0.1% HgCl2的消毒效果比5% NaCl的好，0.1% HgCl2滅菌10 min效果最好，花藥的存活率最高。張?zhí)煜璧萚27]先用75%酒精消毒1 min，然后用0.1% HgCl2消毒10? min，可以有效降低污染率，提高花藥存活率。張曉芬等[28]在甜椒抑菌試驗中，用山農(nóng)一號Ⅲ的效果最好。在許多作物上的研究表明，抗生素可以有效控制作物組織培養(yǎng)過程中發(fā)生的細菌性或者真菌性污染。但是很少在辣椒花藥培養(yǎng)中應用，抗生素的類別、使用濃度等對外植體的生長發(fā)育都會產(chǎn)生不同的影響，使用濃度不合適會顯著抑制植物體的正常生長發(fā)育，因此需要科技工作者深入研究抗生素在辣椒花藥培養(yǎng)中的抑菌作用。楊博智等[29]通過添加抑菌劑進行辣椒開放式花藥培養(yǎng)，可以簡化培養(yǎng)程序、減少污染源。另一種方法是用鑷子輕輕剝?nèi)セɡ夙敳?/4的花萼，露出青綠色的花瓣時再滅菌，結(jié)果表明這樣更易殺死花蕾表面細菌和內(nèi)生菌，花藥污染率能降低至5%以下[30]。

1.2 小孢子培養(yǎng)技術

小孢子培養(yǎng)技術是一種在花藥培養(yǎng)的基礎上發(fā)展起來的高效再生技術體系，與屬于器官培養(yǎng)的花藥培養(yǎng)不同，屬于單細胞培養(yǎng)，小孢子的單倍性和單細胞特性為遺傳轉(zhuǎn)化提供了便利條件。小孢子培養(yǎng)主要是通過胚胎發(fā)生途徑發(fā)育成植株，沒有經(jīng)過愈傷組織階段，減少了因孢子體變異而引起的農(nóng)藝性狀退化，與花藥培養(yǎng)相比，顯著提高單倍體產(chǎn)生頻率。因此，國內(nèi)外都開展了此項研究，并且在甘藍型油菜、馬鈴薯、大麥、水稻、玉米、小麥、亞麻等糧食和經(jīng)濟作物以及眾多蕓薹屬蔬菜上獲得成功[2-5]。但是辣椒小孢子培養(yǎng)起步較晚，目前技術體系還不健全，培養(yǎng)方法不完善，誘導率不高，小孢子游離后會快速地大量死亡[31-32]，需要解決的問題有很多。亟需解決的問題一個是優(yōu)化小孢子培養(yǎng)方法，另外一個是提高小孢子誘導率。

韓國研究者Kim等[33]2007年第一次成功地應用了辣椒游離小孢子培養(yǎng)技術，獲得了較高的胚狀體發(fā)生率，最終獲得健康的再生株系。李春玲等[34]2008年采用固液結(jié)合的方法，先花藥預培養(yǎng)，再用液體培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)游離小孢子的方法，成功獲得胚狀體，并成功移栽再生株系。國內(nèi)外學者[35-43]成功誘導辣椒小孢子胚狀體。Supena等[37]用印度尼西亞辣椒，用看護培養(yǎng)的方法，成功誘導出辣椒再生株系，這是第一次報道成功的案例。成妍等[44]對比了小孢子看護培養(yǎng)、機械游離培養(yǎng)、兩者相結(jié)合培養(yǎng)3種方法的效果，結(jié)果表明看護培養(yǎng)和機械游離相結(jié)合的胚胎誘導最好，說明辣椒小孢子最初的脫分化對花藥壁有依賴作用，花藥壁組織在小孢子培養(yǎng)前期的作用十分重要，不僅能保持適當?shù)臐B透壓，還能從培養(yǎng)基中獲取營養(yǎng)，供小孢子生長發(fā)育。劉凡等[45]通過培養(yǎng)辣椒游離小孢子細胞團獲得了單倍體及雙單倍體植株。目前，主要有3種辣椒小孢子培養(yǎng)方法：第一種是自然游離法?；ㄋ幵谝后w培養(yǎng)基中經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，藥室自然開裂，小孢子從花藥里散落出來，把花藥取出，制成小孢子懸浮液進行培養(yǎng)。第二種是機械游離法。采用擠壓法使小孢子游離出來，經(jīng)過過濾，用液體培養(yǎng)基制成小孢子懸浮液。第三種是先花藥培養(yǎng)再機械游離法。將花藥接種于固體培養(yǎng)基，在33 ℃下暗培養(yǎng)7 d后，選取無污染無褐化且膨大的花藥進行機械游離。目前，研究者使用最多的是自然游離方法，固液雙層分離，既減少了機械對小孢子的損傷，也避免了花藥培養(yǎng)過程中愈傷組織易褐化的問題。

近幾年來，研究者[46-47]嘗試不同的方法來提高辣椒胚誘導率，不同預處理、不同生長環(huán)境、不同培養(yǎng)溫度等都會對誘導率產(chǎn)生影響。王燁等[31]研究了5種預處理（低溫、高溫、無碳源、秋水仙素和甘露醇）對辣椒小孢子誘導率的影響，結(jié)果呈現(xiàn)出不規(guī)律態(tài)勢。小孢子培養(yǎng)中，激素是必不可少的重要成分。且經(jīng)常使用的有生長素（如2，4-D、IAA、NAA等），以及細胞分裂素（如ZT、6-BA、KT等）。生長素主要用來誘導根分化以及細胞分裂，而細胞分裂素在促使細胞分裂、胚狀體形成和愈傷組織生根生芽方面應用較廣。Cheng Yan等[48]在研究辣椒小孢子培養(yǎng)時，添加不同量的活性炭和激素來提高小孢子胚的誘導率。添加適量的活性炭能夠提高小孢子胚的誘導率，李怡斐等[21]研究發(fā)現(xiàn)加入活性炭的加工型辣椒胚狀體誘導率最高可達22.92%。因為活性炭能夠吸附培養(yǎng)基中、空氣中和試驗材料中的抑制物質(zhì)，而且活性碳能吸附和清除小孢子脫分化時產(chǎn)生的有毒物質(zhì)。越來越多的研究者通過嘗試添加不同的誘導劑來提高胚狀體的誘導率，如Heidari-Zefreh等[49]用適量的腐胺和抗壞血酸來提高甜椒小孢子培養(yǎng)胚狀體的誘導率。因此，隨著國內(nèi)外研究的不斷深入、辣椒材料的不斷積累和更新，以及培養(yǎng)條件的不斷完善，辣椒小孢子培養(yǎng)技術正向著克服技術難關、克服不同限制因素的方向發(fā)展。

2 辣椒單倍體加倍技術

花藥培養(yǎng)和小孢子培養(yǎng)選育出來的單倍體育種材料，因含有一套染色體，因此單倍體的植株生長一般比較弱小，葉片短而窄小，并且高度不育，不能直接應用于辣椒遺傳育種，只有經(jīng)過加倍，形成正常的雙單倍體才能應用在育種和生產(chǎn)中。目前，單倍體加倍的主要方法是自然加倍法和人工加倍法。

2.1 辣椒自然加倍法

花藥、小孢子培養(yǎng)得到的單倍體植株都具有自然加倍的現(xiàn)象，作物不同自然加倍率不盡相同，同一作物不同基因型的自然加倍率也不完全相同。辣椒自然加倍率為30%～70%[50];可以看到自然加倍不成功的單倍體株系還有相當大一部分，為了充分利用這部分材料，找到優(yōu)良的純系，研究者采用單倍體植株葉片等外植體進行離體培養(yǎng)，使其再次自然加倍，在小麥上已經(jīng)取得了成功[4]。

2.2 辣椒人工加倍法

自然加倍現(xiàn)象主要發(fā)生在花藥、小孢子培養(yǎng)過程中，在再生植株生長階段的自然加倍概率很小，因此，運用人工加倍方法對單倍體進行規(guī)模加倍顯得尤為重要。人工加倍中主要應用化學試劑誘導方法，目前，加倍試劑應用最多的是秋水仙素，它會阻礙紡錘絲的形成，使減數(shù)分裂不能正常發(fā)生，使染色體停滯在分裂中期，促使染色體加倍?；谥参锛毎哂腥苄缘脑?，利用植物器官或組織作為外植體進行離體培養(yǎng)，采用秋水仙素誘導染色體加倍具有加倍效果好、嵌合率低等優(yōu)越性。在離體加倍培養(yǎng)中，外植體的類型是影響加倍效果的主要因素之一，在小苗期用秋水仙素處理根尖或者莖尖，可使單倍體基因組二倍化。用秋水仙素加倍率在50%～75%，用0.04%秋水仙素處理1個月苗齡的再生植株6 d，加倍率可高達95%[51]。賴黎麗等[52]用0.25%的秋水仙素處理成株，處理12 h加倍效果最佳。秋水仙素對外植體的作用時間直接影響著再生植株的加倍效果，處理的時間越長，加倍的效果就越顯著，同時秋水仙素對外植體的毒害作用也會越嚴重，比如引起外植體褐化等[53]。

因為秋水仙素毒性大，基因之間重組率比較低，人工誘變畸形率高，研究者嘗試了用不同的方法進行辣椒單倍體加倍。已有報道指出甲基胺草磷、氟樂靈和炔苯酰草胺等除草劑對單倍體植株具有良好的加倍作用，同時毒性較低，長時間的磺胺樂靈處理，可能會誘導大量的二倍體化細胞，減少嵌合體植株的出現(xiàn)[54]。

3 單倍體技術的應用

3.1 新品種培育

采用常規(guī)育種方法獲得純合品系需要連續(xù)4～5年的自交選擇，并且不能實現(xiàn)所有性狀的絕對的純合，而雙單倍體技術只需1～2代即可獲得遺傳上100%的純合品系，而且加倍單倍體的隱性基因不會受顯性基因遮蓋而能夠正常表達，可以顯著提高基因型選擇效率和選擇的準確性，有利于多基因重組和隱性基因的選擇。辣椒單倍體技術能夠分離獲得一些具有特殊性狀的育種材料，并通過加倍處理快速獲取純合的育種材料，是一種快速、經(jīng)濟、有效的育種手段。自1973年王玉英等[12]和George等[13]報道獲得辣椒單倍體植株開始，隨著單倍體技術和染色體加倍方法的不斷完善，國內(nèi)外研究者陸續(xù)培育成功一批辣椒品種。北京市海淀區(qū)組培技術實驗室1979年獲得辣椒單倍體幼苗，自此開始了單倍體在辣椒育種中的研究應用，相繼培育出了?；ㄏ盗?、海豐系列[6]品種。匈牙利對辣椒單倍體的研究比較深入，相繼獲得了Sláger、Délibáb、Bolero等品種[55-57]。用花藥或者小孢子培養(yǎng)出的雙單倍體作為雙親或者是親本之一的雜交種，更加穩(wěn)定和純合[58]。

3.2 DH群體構(gòu)建和遺傳分析

DH群體與分子標記輔助選擇（molecular assisted selection， MAS）相結(jié)合定向選擇目標植株，減少了田間工作和世代年數(shù)。李怡斐等[21]通過花藥培養(yǎng)與MAS相結(jié)合，培育了抗疫病加工型辣椒品種，快速創(chuàng)制特異育種新種質(zhì)，加速了育種進程。張樹根等[59]研究103個雙單倍體（DH）系的DH群體的果實性狀的遺傳規(guī)律，其群體由花藥培養(yǎng)技術得來。因為此群體的每一個品系都是完全同質(zhì)純合的，所含信息量小，無遺傳變異，遺傳信息可以繼代保留，是數(shù)量性狀位點分析的良好群體。于進步[60]利用8個辣椒DH系分析主要性狀的配合力和遺傳力，顯示了更強的說服力。

3.3 遺傳圖譜構(gòu)建

辣椒雙單倍體群體是完全純合的，遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，遺傳背景一致，是遺傳作圖的理想材料。利用遺傳圖譜對控制目標性狀的基因進行定位、連鎖分析以及克隆是開展分子標記輔助選擇育種、驗證基因功能及其作用機制的基礎。Lefebvre等[61]用來自于種內(nèi)雜種F1代的3個DH群體，用RAPD和RFLP標記技術，構(gòu)建了一張14個連鎖群的遺傳圖譜。從1995年法國研究者Lefebvre等[62]構(gòu)建并使用DH的第一張遺傳圖譜開始，至2016年已有12張使用DH群體構(gòu)建的圖譜，占辣椒遺傳圖譜總數(shù)的22%。DH群體遺傳作圖已成功應用于多種重要作物，例如小麥、油菜、大麥和水稻等[63]。DH群體已被廣泛用于QTL作圖，例如大麥抗赤霉病，水稻砷富集、產(chǎn)量相關性狀、株高和蒸煮品質(zhì)，以及小麥株高、抽穗期、面粉顏色、磷利用效率、缺鋅和抗黑穗病等QTL的研究[64]。尤其在水稻育種中，DH系群體已用于產(chǎn)量、品質(zhì)等農(nóng)藝性狀的QTL定位。

4 展 望

近年來，辣椒單倍體育種技術研究有了一定的進展，但仍然不能完全滿足辣椒育種工作者的需求。辣椒單倍體培養(yǎng)技術中存在的基因型依賴性強、污染嚴重、培養(yǎng)方法不夠優(yōu)化、胚狀體誘導率低等問題，導致該技術應用不是十分廣泛和深入。

目前，辣椒單倍體育種技術還不夠完善，科學工作者應當深入研究胚狀體的調(diào)控機制，以最終達到人為調(diào)控單倍體培養(yǎng)的目的，可以與遺傳學方法、分子生物學方法等有機結(jié)合。小孢子胚胎發(fā)生是由多種信號通路所介導的，并且這些信號通路之間存在著交叉互作，或者是不同的脅迫信號導致了相同的下游反應。因此，相關研究應整合基因組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學，從系統(tǒng)生物學角度揭示不同信號級聯(lián)的相互關系，才能最終弄清小孢子胚胎發(fā)生的機制。目前掌握了一些有關小孢子胚胎誘導和胚胎形成的細胞學及分子學信息[65-66]，但從配子體到胚胎形成途徑的機制仍不明確，仍需深入研究花粉發(fā)育過程，研究小孢子發(fā)育機制，以實現(xiàn)對小孢子發(fā)育的主動調(diào)控。

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