李毅 宋曉飛 李曉麗 孫成振 張美迪 閆立英

摘? ? 要：對(duì)黃瓜果頂形狀進(jìn)行QTL分析和候選基因預(yù)測(cè)，可為黃瓜新品種選育提供理論基礎(chǔ)。以果頂平頭形自交系玉女和果頂瘦尖形自交系R7構(gòu)建的F2代分離群體為材料，對(duì)黃瓜果頂形狀遺傳及其QTL進(jìn)行分析。結(jié)果表明，黃瓜果頂瘦尖形為不完全顯性遺傳的數(shù)量性狀。基于QTL-Seq發(fā)現(xiàn)6個(gè)與黃瓜果頂形狀有關(guān)的QTL，分別位于1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)和6號(hào)染色體上，共包含108個(gè)SNP和InDel位點(diǎn)，含有12個(gè)變異基因。其中只有6號(hào)染色體上的CsaV3_6G005930.1基因在外顯子上發(fā)生SNP替換（C-A）形成終止密碼子，導(dǎo)致翻譯提前終止，預(yù)測(cè) CsaV3_6G005930.1是與果頂形狀相關(guān)的候選基因，該基因編碼一個(gè)未知蛋白。

關(guān)鍵詞：黃瓜;果頂形狀;QTL定位

中圖分類號(hào)：S642.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2021）07-007-07

Inheritance and QTL mapping of fruit apex shape in cucumber

LI Yi， SONG Xiaofei， LI Xiaoli， SUN Chengzhen， ZHANG Meidi， YAN Liying

（College of Horticulture Science and Technology， Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066600， Hebei， China）

Abstract： QTL analysis and candidate genes prediction of the fruit apex shape can provide a theoretical foundation for the breeding of new cucumber varieties.In this study， the genetic and QTL of fruit apex shape were analyzed by using F2 population which was constructed with an inbred line of flat fruit apex Yunü （P1） and an inbred line of sharp fruit apex R7 （P2） as parents.Genetic analysis showed that the fruit sharp apex of cucumber was a quantitative character with incomplete dominant inheritance. Six QTLs related to fruitapex shape of cucumber were located on chromosome 1， chromosome 2， chromosome 3， chromosome 4， chromosome 5 and chromosome 6 by QTL-Seq， respectively. A total of 108 SNP and InDel locus which related to the fruit apex shape were located，contained 12 mutation genes.Only the CsaV3_6G005930.1 gene on chromosome 6 happened a SNP replacement （C-A） to form the termination codon， and resulted in premature termination of translation. Therefore， CsaV3_6G005930.1 is a strong candidate gene for fruit apex shape， which encodes an unknown protein.

Key words： Cucumber; Fruit apex shape; QTL mapping

黃瓜是全球重要的經(jīng)濟(jì)作物，其果實(shí)大小和形狀具有豐富的多樣性[1]。不同黃瓜品種之間果實(shí)形狀差異很大，如長(zhǎng)棒形、短棒形、卵圓形、球形和指形黃瓜等。果實(shí)形狀直接影響黃瓜的外觀品質(zhì)和商品價(jià)值，因此，培育符合消費(fèi)者需求的果形品種已成為黃瓜新品種選育的重要方向之一[2]。果頂是黃瓜果實(shí)的重要組成部分，果頂形狀的改變直接影響果實(shí)的形狀。因此，定位果頂形狀相關(guān)QTL可為黃瓜果形遺傳改良提供理論依據(jù)。

辣椒、茄子和番茄作物的果頂形狀均為數(shù)量性狀且由多個(gè)QTL調(diào)控。Chaim等[3]通過(guò)QTL分析鑒定到55個(gè)與辣椒形狀相關(guān)的QTL，其中有3個(gè)QTL與辣椒果頂形狀有關(guān)。張佳琦[4]利用小椒和大椒雜交構(gòu)建F2分離群體，利用SPAR和SSR分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行QTL分析，定位到6個(gè)與辣椒果頂形狀相關(guān)的QTL。耿樹文[5]以圓頂茄子自交系283為母本、尖頂茄子自交系284為父本進(jìn)行雜交，構(gòu)建6世代遺傳群體，通過(guò)QTL定位鑒定到3個(gè)與茄子果頂形狀相關(guān)的QTL（fe5.1、fe10.1、fe10.2），fe5.1位于茄子5 號(hào)連鎖群Marker1322249 和 Marker2732214之間、fe10.1位于10號(hào)連鎖群Marker897334 和 Marker894480之間、fe10.2位于10號(hào)連鎖群Marker4365090 和 Marker2070220 之間。Brewer等[6]對(duì)番茄進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定時(shí)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)與番茄果頂形狀相關(guān)的QTL （dan7.1，dan7.2，dan8.1，dan12.1）。前人在對(duì)黃瓜果實(shí)性狀研究時(shí)主要集中于果實(shí)形狀，對(duì)果頂形狀研究相對(duì)較少。高智慧[7]以長(zhǎng)棒形黃瓜自交系CNS21和近圓形黃瓜自交系RNS7為親本，對(duì)調(diào)控果形相關(guān)的QTL進(jìn)行定位，共定位到58個(gè)與果實(shí)大小和形狀相關(guān)的QTL;同時(shí)，結(jié)合QTL定位和基因組重測(cè)序，預(yù)測(cè)了5個(gè)可能與黃瓜果形相關(guān)的候選基因。簡(jiǎn)興等[8]以長(zhǎng)棒形黃瓜二早子和短棒形黃瓜NC-76為親本，應(yīng)用主基因+多基因混合遺傳模型分析了黃瓜果形的遺傳特性，結(jié)果表明果形是多基因控制的數(shù)量性狀，果形指數(shù)的遺傳符合加性-顯性-上位性多基因（C-0）模型，并且果形遺傳受環(huán)境影響較大。潘玉朋[9]以特異性地方自交系WI7239和半野生的版納黃瓜自交系WI7167為材料，通過(guò)QTL定位等方法揭示了黃瓜圓形果形態(tài)建成的遺傳調(diào)控機(jī)制，結(jié)果表明，果實(shí)大小/形狀的遺傳變異由2個(gè)互作QTL位點(diǎn)FS1.2和FS2.1調(diào)控。苗晗等[10]以華北保護(hù)地黃瓜9930和歐洲溫室黃瓜9110Gt為親本構(gòu)建遺傳圖譜，結(jié)合不同年份、不同季節(jié)表型鑒定數(shù)據(jù)，對(duì)12個(gè)黃瓜果實(shí)相關(guān)性狀進(jìn)行QTL模型（MQM）分析，共檢測(cè)到32個(gè)與黃瓜果實(shí)性狀相關(guān)的QTL。朱拼玉等[11]將黃瓜果頂形狀分為鈍圓形、卵圓形和瘦尖形，鈍圓形果形指數(shù)為1.4～2.2，卵圓形果形指數(shù)為1.8～2.5，瘦尖形果形指數(shù)為2.4～3.4，對(duì)不同黃瓜果頂形狀進(jìn)行遺傳規(guī)律分析和QTL定位，結(jié)果表明鈍圓形和卵圓形果頂遺傳均為不完全隱形遺傳，符合A-0模型，受一對(duì)主基因控制，bft6.1是控制鈍圓形果頂?shù)闹餍TL位點(diǎn)，oft4.1是控制卵圓形果頂?shù)闹餍TL位點(diǎn)。目前對(duì)黃瓜果頂形狀的遺傳基礎(chǔ)研究較少，調(diào)控果頂形狀的基因尚不明確。

筆者在本研究中以果頂平頭形黃瓜自交系玉女為母本（P1），以果頂瘦尖形黃瓜自交系R7為父本（P2），構(gòu)建F1代和F2代分離群體，采用QTL-Seq方法定位與果頂形狀相關(guān)的基因，為克隆黃瓜果頂形狀相關(guān)基因和優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

以來(lái)自山東壽光蔬菜種業(yè)集團(tuán)有限公司自主研發(fā)的歐洲溫室型品種玉女和河北科技師范學(xué)院引進(jìn)并純化的日本類型優(yōu)良自交系R7為試驗(yàn)材料。其中玉女果頂為平頭形，R7果頂為瘦尖形，雜交獲得F1和F1反，F(xiàn)1自交獲得F2代分離群體種子。2018年8月播種各世代種子，采用穴盤育苗，2葉1心時(shí)定植，雙高壟地膜覆蓋栽培，大行距80 cm，小行距50 cm，株距25 cm，P1、P2分別定植25株，F(xiàn)1定植12株，F(xiàn)1反定植17株，F(xiàn)2定植125株，所有材料均定植于河北科技師范學(xué)院施各莊基地塑料大棚，田間常規(guī)管理。

1.2 黃瓜果頂形狀調(diào)查與統(tǒng)計(jì)

2018年9月，在結(jié)果盛期對(duì)各世代的正常商品瓜進(jìn)行表型鑒定，每株選取10個(gè)正常商品瓜，根據(jù)《黃瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[12]對(duì)選取的黃瓜商品瓜的果頂形狀進(jìn)行觀察、定性及劃分鑒定，用Excel 2016對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3 方法

采用QTL-Seq技術(shù)[13]對(duì)黃瓜果頂形狀進(jìn)行QTL定位。在F2代分離群體中選擇果頂平頭形和瘦尖形性狀的植株各20株，采用CTAB[14]法提取健康幼嫩生長(zhǎng)點(diǎn)處葉片的DNA，瓊脂糖凝膠電泳分析DNA的純度和完整性，Nanodrop檢測(cè)DNA的純度（OD260/OD 280比值），Qubit對(duì)DNA濃度進(jìn)行精確定量。相同表型植株的DNA質(zhì)量檢測(cè)合格后進(jìn)行等濃度混合，構(gòu)建果頂平頭形混池（gdp）和果頂瘦尖形混池（gdj）。將父、母本分別構(gòu)建父本池（P2）和母本池（P1）。由天津諾禾致源有限公司采用QTL-Seq方法進(jìn)行QTL定位。通過(guò)illuminaHiSeqTMPE150測(cè)序平臺(tái)對(duì)F2代2個(gè)極端表型混池和2個(gè)親本池進(jìn)行測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾獲得高質(zhì)量的clean reads。通過(guò)BWA[15]軟件中mem算法將clean reads與黃瓜參考基因組（Cucumber （Chinese Long） v3）比對(duì)，比對(duì)結(jié)果經(jīng)SAMTOOLS去除重復(fù)。通過(guò)ANNOVER[16]軟件對(duì)候選區(qū)間SNP和InDel進(jìn)行功能注釋。參考黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//cucurbitgenomics.org/）和擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.arabidopsis.org/）對(duì)候選區(qū)間內(nèi)的基因進(jìn)行功能分析，預(yù)測(cè)候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜果頂形狀的遺傳分析

對(duì)2018年秋季的親本、F1、F1反和F2代分離群體的果頂形狀進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，以果頂平頭形黃瓜自交系玉女（P1）與果頂瘦尖形黃瓜自交系R7（P2）雜交所得的F1，無(wú)論正交還是反交，后代均表現(xiàn)為中間性狀鈍圓形，F(xiàn)2代分離群體則表現(xiàn)為平頭、鈍圓與瘦尖3種表型，比例為25.6%∶43.2%∶31.2%，接近1∶2∶1，且表型易受到環(huán)境影響。遺傳分析結(jié)果表明，黃瓜果頂瘦尖形為不完全顯性遺傳的數(shù)量性狀（表1）。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

對(duì)親本及2個(gè)果頂極端表型混池進(jìn)行高通量測(cè)序并獲得29.949 G原始數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)中含有接頭或低質(zhì)量的reads。為了保證后續(xù)信息分析的準(zhǔn)確性，需要對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)如下：1）過(guò)濾點(diǎn)帶接頭的reads;2）過(guò)濾掉單端測(cè)序reads中N的含量超過(guò)reads長(zhǎng)度10%的reads;3）過(guò)濾掉單端測(cè)序reads中低質(zhì)量堿基超過(guò)reads長(zhǎng)度比例50%的reads。最終得到29.633 G clean reads。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量分布檢查，測(cè)序錯(cuò)誤率用e表示，Illumina HiSeqTM/MiseqTM的堿基質(zhì)量值用Qphred表示，Qphred=-10log10（e）。利用測(cè)序結(jié)果的Qphred數(shù)值，進(jìn)行堿基錯(cuò)誤率計(jì)算，結(jié)果為Q20≥94.74%、Q30≥88.21%，測(cè)序質(zhì)量高，GC含量38.46%～39.28%（表2）。

所有樣本的reads與黃瓜參考基因組的比對(duì)數(shù)在94.33%～96.25%之間，平均測(cè)序深度在20.47X～26.22X，1X的覆蓋比率在98.31%以上，4X的覆蓋比率在95.93%以上（表3）。比對(duì)結(jié)果良好，可以用于后續(xù)的變異分析。

2.3 黃瓜果頂形狀QTL定位

基于基因分型的結(jié)果，篩選兩個(gè)親本間純合差異的標(biāo)記，共篩選出286 947個(gè)多態(tài)性標(biāo)記。以親本P1作為參考親本，分析計(jì)算2個(gè)子代的SNP-index與InDel-index（即SNP與InDel-index的頻率），以1 Mb為窗口，1 kb為步長(zhǎng)，對(duì)gdj和gdp中SNP（圖1-A、B）和InDel（圖2-A、B）在染色體上的分布作圖。

統(tǒng)計(jì)2個(gè)極端性狀混池的SNP-index和InDel-index，并計(jì)算子代池ΔSNP-index，在95%置信水平下，以ΔSNP-index值大于閾值的窗口作為候選區(qū)域，共檢測(cè)到30個(gè)與果頂形狀有關(guān)的SNP位點(diǎn)，分別位于1號(hào)染色體（8.225～31.309 Mb）、3號(hào)染色體（21 668 266 bp）、4號(hào)染色體（15.700～18.230 Mb）和6號(hào)染色體（5 047 789 bp）上（圖1-C）。

同樣在95%置信水平下，以ΔInDel-index值大于閾值的窗口作為候選區(qū)域，共檢測(cè)到78個(gè)與果頂形狀有關(guān)的InDel位點(diǎn)，分別位于1號(hào)染色體（7.755 ～32.155 Mb）、2號(hào)染色體（6.113～9.008 Mb）、4號(hào)染色體（14.703～23.033 Mb）、5號(hào)染色體（25.035Mb）和6號(hào)染色體（17.881～24.954 Mb）上（圖2-C）。

將SNP-index和InDel-index合并后得到直觀的Allindex在染色體上的分布情況，以95%為閾值計(jì)算ΔAll-index，最終定位到6個(gè)與黃瓜果頂形狀相關(guān)的QTL，含有108個(gè)SNP和InDel位點(diǎn)，分別位于1號(hào)染色體（7.755～32.155 Mb）、2號(hào)染色體（6.113～9.008 Mb）、3號(hào)染色體（21 668 266 bp）、4號(hào)染色體（14.703～23.033 Mb）、5號(hào)染色體（25 035 518 bp）和6號(hào)染色體（5.047～24.954 Mb）上（圖3）。

在全基因組范圍內(nèi)篩選2個(gè)子代SNP-index和InDel-index差異顯著的位點(diǎn)，即在果頂平頭形混池中SNP-index和InDel-index接近0.9，且在果頂瘦尖形混池中SNP-index和InDel-index接近0.15的位點(diǎn)。變異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表4。

2.4 候選基因分析與預(yù)測(cè)

基于QTL-Seq結(jié)果，在候選區(qū)域內(nèi)獲得候選變異位點(diǎn)108個(gè)。挑選其中All-index接近0或者1的位點(diǎn)作為SNP或InDel的候選位點(diǎn)，候選區(qū)間內(nèi)一共含有12個(gè)變異基因。優(yōu)先挑選引起stoploss、stopgain、非同義突變或可變剪接的位點(diǎn)所在的基因作為候選基因。變異類型篩選結(jié)果表明，只有6號(hào)染色體上CsaV3_6G005930.1在外顯子上發(fā)生SNP替換（C-A）形成終止密碼子，導(dǎo)致翻譯提前終止（表5）。因此，預(yù)測(cè)CsaV3_6G005930.1為黃瓜果頂形狀的候選基因，該基因編碼一個(gè)未知蛋白。

3 討論和結(jié)論

果實(shí)形狀是影響黃瓜外觀品質(zhì)和商品價(jià)值的重要指標(biāo)[17-18]。果頂是黃瓜果實(shí)外形的重要組成部分，具有豐富的多樣性。朱拼玉等[11]對(duì)黃瓜重組自交系中145株鈍圓形-瘦尖形分離群體和155株卵圓形-瘦尖形分離群體中果頂形狀進(jìn)行遺傳規(guī)律分析和植株數(shù)量性狀主基因+多基因混合模型分析，結(jié)果表明果頂鈍圓形和果頂卵圓形黃瓜遺傳均表現(xiàn)為不完全隱性遺傳，符合A-0模型，主要受1對(duì)主基因控制。筆者通過(guò)果頂平頭形自交系玉女和果頂瘦尖形自交系R7雜交構(gòu)建F1、F1反和F2代群體并進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)F1和F1反的果頂均為鈍圓形，F(xiàn)2果頂表現(xiàn)為平頭、鈍圓與瘦尖3種表型，且后代分離比接近1∶2∶1，由此認(rèn)為黃瓜果頂瘦尖形為不完全顯性遺傳的數(shù)量性狀，與前人研究結(jié)果一致。

朱拼玉等[11]對(duì)黃瓜果頂形狀相關(guān)基因進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)鈍圓形果頂受到bft4.1和bft6.1控制，其中bft6.1（87.99 ～113.09 cM）是控制果頂形狀的主效位點(diǎn)。卵圓形果頂受oft3.1、oft3.2、oft3.3、oft4.1、oft4.2、oft5.1控制，且oft4.1（50.62 ～62.40 cM）是控制卵圓形果頂?shù)闹餍稽c(diǎn)。在本研究中利用F2代分離群體，通過(guò)QTL-Seq對(duì)樣本池和雙親池進(jìn)行高通量測(cè)序，尋找差異的SNP和InDel，進(jìn)而預(yù)測(cè)黃瓜果頂形狀相關(guān)的候選基因?；赒TL-Seq結(jié)果定位到108個(gè)與果頂形狀相關(guān)的SNP和InDel位點(diǎn)，分別位于1號(hào)染色體、2號(hào)染色體、3號(hào)染色體、4號(hào)染色體、5號(hào)染色體和6號(hào)染色體上，共包含12個(gè)發(fā)生變異的基因。其中，只有6號(hào)染色體上CsaV3_6G005930.1（5 047 789 bp）在外顯子上發(fā)生SNP替換（G-A）形成終止密碼子，導(dǎo)致翻譯提前終止。因此，預(yù)測(cè)CsaV3_6G005930.1為黃瓜果頂形狀相關(guān)的候選基因。與前人研究結(jié)果相比較，本研究結(jié)果預(yù)測(cè)的候選基因CsaV3_6G005930.1位于6號(hào)染色體5 047 789 bp處，與前人預(yù)測(cè)的6號(hào)染色體的候選區(qū)間不重合。因此，筆者預(yù)測(cè)到一個(gè)新的與黃瓜果頂形狀相關(guān)的候選基因，且該基因功能未知（unknown protein）。筆者將進(jìn)一步對(duì)候選基因進(jìn)行序列變異分析和生物信息學(xué)分析，驗(yàn)證候選基因的準(zhǔn)確性，為后續(xù)克隆該基因奠定理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] PAN Y P，WANG Y H，MCGREGOR C，et al.Genetic architecture of fruit size and shape variation in cucurbits：a comparative perspective[J].Theoretical and Applied Genetics，2020，133（1）：1-21.

[2] 柴丹丹.黃瓜果實(shí)圓形性狀的SRAP分子標(biāo)記[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

[3] CHAIM B A， PARAN I， GRUBE R C，et al.QTL mapping of fruit-related traits in pepper （Capsicum annuum）[J].Theoretical & Applied Genetics，2001，102（6/7）：1016-1028.

[4] 張佳琦.辣椒果實(shí)性狀相關(guān)性分析及QTL定位[D].廣東湛江：廣東海洋大學(xué)，2014.

[5] 耿樹文.長(zhǎng)茄果頂形狀遺傳研究及QTL定位[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2018.

[6] BREWER M T，MOYSEENKO J B，MONFORTE A J，et al.Morphological variation in tomato：a comprehensive study of quantitative trait loci controlling fruit shape and development[J].Journal of Experimental Botany，2007，58（6）：1339-1349.

[7] 高智慧.黃瓜兩個(gè)不同果形自交系全基因組多態(tài)性檢測(cè)及果形相關(guān)QTLs定位[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[8] 簡(jiǎn)興，苗永美，高青海，等.黃瓜果形性狀主基因+多基因混合遺傳分析[J].分子植物育種，2015，13（10）：2262-2267.

[9] 潘玉朋.黃瓜圓形果的QTL定位及無(wú)表皮毛（果刺）基因csgl3的圖位克隆[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2016.

[10] 苗晗，顧興芳，張圣平，等.黃瓜果實(shí)相關(guān)性狀QTL定位分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（24）：5031-5040.

[11] 朱拼玉，張開京，鐘廷龍，等.不同類型黃瓜果頂形狀QTL定位[C]//中國(guó)園藝學(xué)會(huì)第八屆黃瓜學(xué)術(shù)研討會(huì)暨新品種展示觀摩活動(dòng)會(huì)議手冊(cè).南京，2018：79.

[12] 李錫香，朱德蔚，杜永臣，等.黃瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[13] HIROKI T，AKIRA A，KENTARO Y，et al.QTL-seq：rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations[J].Plant Journal，2013，74（1）：174-183.

[14] MURRAY M G，THOMPSON W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic Acids Research，1980，8（19）：4321-4325.

[15] LI H，DURBIN R.Fast and accurate long-read alignment with Burrows–Wheeler transform[J].Bioinformatics，2010，26（5）：589-595.

[16] WANG K，LI M，HAKONARSON H.ANNOVAR：functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data[J].Nucleic Acids Research，2010，38（16）：e164.

[17] 喬軍，劉富中，陳鈺輝，等.園藝作物果形遺傳研究進(jìn)展[J].園藝學(xué)報(bào)，2011，38（7）：1385-1396.

[18] 廖芳蕾，陳澤宇，徐啟越，等.果形建成基因研究進(jìn)展及其對(duì)佛手果形發(fā)育研究的啟示[J].園藝學(xué)報(bào)，2018，45（9）：1701-1714.