張自強(qiáng),王佳佳,任玉瑩,朱慧杰,張倩文,劉玉梅

(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，洛陽 471000)

支氣管敗血波氏桿菌病和肺炎克雷伯菌病是兔的常發(fā)病。支氣管敗血波氏桿菌病是支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica)引起的一種多發(fā)性呼吸道傳染病，哺乳仔兔和斷乳仔兔主要表現(xiàn)急性死亡，成年兔主要表現(xiàn)鼻炎、支氣管炎和膿皰性肺炎等呼吸道疾病[1-3]。該病在季節(jié)交替且溫差大時多發(fā)，各品種、各年齡段的兔均可發(fā)病。兔肺炎克雷伯菌病是由肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)引起的一種是以肺炎和其他器官化膿性炎癥為主要表現(xiàn)的呼吸道傳染性疾病，具備發(fā)病率高和死亡率高的特點。

近年來，隨著我國養(yǎng)兔業(yè)的快速發(fā)展，規(guī)?；脠鲅杆僭龆?，我國養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展盛況空前。河南省是養(yǎng)兔大省，家兔養(yǎng)殖規(guī)模龐大。目前，影響河南養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展的首要因素是疾病問題，諸如流行性腹脹腹瀉、傳染性鼻炎及球蟲病等的發(fā)病率和死亡率較高，給養(yǎng)殖場(戶)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。細(xì)菌性疾病中，支氣管敗血波氏桿菌病和肺炎克雷伯菌病近年來在兔群里經(jīng)常發(fā)生。當(dāng)兔的生活環(huán)境發(fā)生變化(如天氣、溫度變化，食物突然更換，飼養(yǎng)場所變化以長時間處于應(yīng)激狀態(tài)等)時，B.bronchiseptica易引起以鼻炎為主要表現(xiàn)的呼吸道疾病，若與K.pneumoniae混合感染，危害更為嚴(yán)重。由于二者的臨床表現(xiàn)與病理變化較為相似，僅通過癥狀、病理剖檢、鏡檢等手段很難區(qū)分，常被誤診為單一細(xì)菌感染。本研究擬從病兔組織分離病原，通過PCR鑒定、基因測序及藥敏試驗，確定常用抗菌藥物的耐藥譜，為科學(xué)用藥，預(yù)防控制該2種病菌感染提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2019年8—9月，河南省某兔場50～60日齡兔，連續(xù)出現(xiàn)打噴嚏，鼻腔有白色或黃色黏液，并伴有明顯腹瀉癥狀為主要特征的疾病，且病兔大量死亡。臨床觀察發(fā)病兔，剖檢并無菌采集病死兔肝、肺、氣管、腎、盲腸等組織，待進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)及檢測。

1.2 主要試劑與儀器

培養(yǎng)基(普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基)、藥敏紙片購自北京索萊寶科技有限公司。PremixTaqTM(ExTaqTMVersion 2.0 plus dye)購自大連TaKaRa公司。細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒、Proteinase K、DL2000 DNA Marker購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。溴化乙錠溶液購自蘇州天可貿(mào)易有限公司。

主要儀器：臺式冷凍高速離心機(jī)(Beckman Coulter)、普通PCR儀(Applied Biosystems 2720)、凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD)、電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3 病原菌的分離純化

取“1.1”采集的肝、肺、氣管、腎、盲腸等組織樣品，分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落的生長情況。隨后挑取疑似單個菌落于麥康凱瓊脂平板上純化，并對純培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)革蘭染色，鏡檢。

1.4 生化試驗

將分離菌純培養(yǎng)物分別接種到微量生化管，37 ℃ 培養(yǎng)24～48 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.5 引物設(shè)計與合成

選擇GenBank中收錄的B.bronchiseptica16S rRNA基因序列和K.pneumoniae的16S rRNA基因序列，經(jīng)DNAStar軟件對比分析，利用Primier 5.0軟件設(shè)計相應(yīng)引物。引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成，具體序列及目的片段的信息見表1。

表1 引物信息

1.6 分子生物學(xué)鑒定

取分離純化后的菌液，按照細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒說明書的操作步驟的提取細(xì)菌DNA，以菌液的核酸為模板，分別進(jìn)行波氏桿菌的16S rRNA和肺炎克雷伯菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。25 μL反應(yīng)體系：DNA模板 1 μL，PremixTaqTM12.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃變性 4 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與GenBank中已登錄的菌株進(jìn)行同源性比對分析，并利用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 動物回歸試驗

將2株分離菌分別接種于普通營養(yǎng)培養(yǎng)基，37 ℃ 培養(yǎng)24 h后用平板法進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)，稀釋菌液濃度至109CFU·mL-1。將12只體重20 g左右SPF級KM小鼠隨機(jī)分為3組，每組4只，第1、2組每只小鼠分別腹腔注射稀釋好的2株菌液，每只小鼠腹腔注射0.2 mL，對照組小鼠注射相同劑量的PBS。相同環(huán)境下飼養(yǎng)，接種后觀察，對病死鼠進(jìn)行剖檢。

1.8 藥敏試驗

根據(jù)美國臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)推薦的K-B紙片法進(jìn)行試驗操作和結(jié)果判斷[7]?？股丶埰ǎ杭t霉素、慶大霉素、新霉素、麥迪霉素、四環(huán)素、卡那霉素、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、多黏菌素B、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、哌拉西林、氨芐西林、羧芐西林、丁胺卡那霉素、頭孢拉定、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢唑啉。

2 結(jié) 果

2.1 臨床剖檢

臨床剖檢發(fā)現(xiàn)病死兔氣管充血、出血，管腔內(nèi)有黏性或膿性分泌物(圖1 A)。肺稍腫大，有出血點，有大小不等的膿腫，膿包內(nèi)積滿黏稠乳白色膿汁(圖1 B)。胸腔內(nèi)充滿大小不等的膿腫(圖1 B)。肝內(nèi)以及心表面附著大量膿腫(圖1 C)。腎表面也可見積膿(圖1 D)。腸黏膜充血、出血，盲腸黏膜充血、出血最嚴(yán)重，腸腔有黏稠物和大量氣體(圖1 E)。病兔劇烈腹瀉，排褐色糊狀稀糞，肛門以及后肢周圍被毛被污染(圖1 F)。

2.2 形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察

經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)，從8只病死兔肝、肺、氣管、腎、盲腸等組織中分離到10株細(xì)菌，其中5株菌體形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性和藥物敏感性一致，另外5株菌體形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性和藥物敏感性一致，因此判定此次分離得到兩種不同的細(xì)菌且都為混合感染。細(xì)菌1在普通瓊脂上生長后，形成光滑、濕潤、煙灰色、半透明、隆起的中等大小菌落(圖2A)，在麥康凱瓊脂平板上生長良好，能形成圓形、光滑、突起、不透明的乳白色大菌落(圖2B)。革蘭染色鏡檢可見革蘭陰性，兩端鈍圓、兩極著色，大部分分散，少數(shù)成對存在的小桿菌(圖2C)。細(xì)菌1在普通瓊脂上長出乳白色、濕潤、閃光、凸起、豐厚、黏稠的大菌落(圖2D)，在麥康凱瓊脂平板上生長出粉紅色菌落(圖2E)。革蘭染色鏡檢可見短粗、呈卵圓形的革蘭陰性桿菌(圖2F)。

2.3 生化試驗

細(xì)菌1和細(xì)菌2理化性質(zhì)見表2。細(xì)菌1和細(xì)菌2理化性質(zhì)符合B.bronchiseptica和K.pneumoniae的生化特性。因此，據(jù)分離菌形態(tài)、培養(yǎng)特性及表2生化特性分析結(jié)果，初步判定此次分離培養(yǎng)菌為B.bronchiseptica和K.pneumoniae。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，自肝、肺、氣管、腎、盲腸等樣品分離到的兩種細(xì)菌分別約在1 492(圖3A)和1 494 bp(圖3B)處出現(xiàn)特異性條帶。分別將兩種擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果經(jīng)NCBI(blast)分析，采用DNAStar軟件中MegAlign進(jìn)行多序列比對，采用Mega 7.0軟件分別構(gòu)建其遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果顯示細(xì)菌1與B.bronchiseptica菌株AU 12671等相似性為99.85%(圖4A)，細(xì)菌2與K.pneumoniae菌株F5feb.57等相似性為100%(圖4B)。

A．氣管；B.肺；C.心、肝；D.腎；E.腸；F.肛門A. Trachea; B. Lung; C. Heart and liver; D. Kidney; E. Intestine; F. Anus圖1 病死兔剖檢Fig.1 Dissection of sick and dead rabbits

A.細(xì)菌1在普通瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；B.細(xì)菌1在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；C.細(xì)菌1革蘭染色(1 000×)；D.細(xì)菌2在普通瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；E.細(xì)菌2在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上在的菌落形態(tài)；F. 細(xì)菌2革蘭染色(1 000×)A. Colony morphology of bacterium 1 on ordinary agar medium; B. Colony morphology of bacterium 1 on McKangkai agar culture medium; C. Bacterium 1 Gram stain(1 000×); D. Colony morphology of bacterium 2 on ordinary agar medium; E. Colony morphology of Bacterium 2 on McKangkai Agar culture medium; F. Bacterium 2 Gram stain(1 000×)圖2 2株分離菌的形態(tài)和培養(yǎng)特性觀察Fig.2 Observation on the morphology and culture characteristics of the two isolated bacteria

表2 生化試驗結(jié)果

A. 細(xì)菌1；B. 細(xì)菌2; M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.肝；2.肺；3.氣管；4.腎；5.盲腸A. Bacterium 1; B.Bacterium 2; M.DL2000 DNA marker; 1.Liver; 2. Lung; 3.Trachea; 4.Kidney; 5.Cecum圖3 分離菌16S rRNA PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.3 16S rRNA PCR amplification electrophoresis of the isolated bacteria

2.5 動物回歸試驗

用2株分離菌攻毒后，第1、2組試驗小鼠均表現(xiàn)為精神沉郁，厭食昏睡，48 h內(nèi)全部死亡，而對照組小鼠表現(xiàn)正常。剖檢病死小鼠發(fā)現(xiàn)注射支氣管敗血波氏桿菌組小鼠肝淤血、腫大；脾淤血、腫大；腸道、腸系膜等出血。注射肺炎克雷伯菌組小鼠肝淤血、腫大；脾充血、淤血；腸道內(nèi)充滿黃綠色內(nèi)容物。取死亡小鼠肝接種普通營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)，分離的菌落特征和染色鏡檢結(jié)果均與原分離菌株一致，16S rRNA的PCR鑒定證實序列與原分離株相同。

2.6 藥敏試驗

將該B.bronchiseptica和K.pneumoniae分別接種到含抗生素的培養(yǎng)基上，測量抑制圈的直徑。B.bronchiseptica對不同藥物的敏感性見表3。由表3可知，B.bronchiseptica對慶大霉素、頭孢曲松、頭孢唑啉三種藥物敏感，對多黏菌素B、頭孢哌酮不敏感，對紅霉素、新霉素、麥迪霉素、四環(huán)素、卡那霉素、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、哌拉西林、羧芐西林、丁胺卡那霉素、頭孢拉定、頭孢他啶、頭孢氨芐17種藥物有較強(qiáng)抗性；K.pneumoniae對不同藥物的敏感性見表4。由表4可知K.pneumoniae對慶大霉素、頭孢曲松、頭孢氨芐、頭孢唑啉四種藥物敏感，對頭孢他啶不敏感，對紅霉素、新霉素、麥迪霉素、四環(huán)素、卡那霉素、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、多黏菌素B、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、哌拉西林、氨芐西林、羧芐西林、丁胺卡那霉素、頭孢拉定、頭孢哌酮17種藥物有較強(qiáng)抗性。

A.細(xì)菌1；B. 細(xì)菌2A.Bacterium 1; B. Bacterium 2圖4 分離菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic trees of the isolated bacteria based on 16S rRNA gene

3 討 論

B.bronchiseptica是一種革蘭陰性小桿菌，寄生在動物呼吸道黏膜上皮細(xì)胞，能引起多種動物發(fā)生呼吸道的急性或慢性炎癥[8-9]。根據(jù)已有報道發(fā)現(xiàn)，該菌能感染豬、犬、牛、兔、鼠、猴以及刺猬、狐、粟鼠等多種野生動物[10-11]。研究表明，當(dāng)支氣管敗血波氏桿菌感染兔后，常常導(dǎo)致兔發(fā)生呼吸道疾病，臨床上表現(xiàn)出鼻炎、支氣管炎和膿皰性肺炎等癥狀。兔多在春秋季節(jié)氣候易變時發(fā)病，主要通過呼吸道感染。研究表明，感染初期，病兔出現(xiàn)打噴嚏的現(xiàn)象，隨后鼻腔流出漿液性或黏液性分泌物，隨著病程的延長，病兔呼吸道出現(xiàn)化膿或出血癥狀[12]。病兔剖檢時部分病例可見肺部有大小不等的膿皰，有時與胸膜粘連，并伴有胸水。而另一些病例的肝上也出現(xiàn)黃豆大的膿皰[13]。王欣等[14]研究發(fā)現(xiàn)，兔群發(fā)生的以鼻腔分泌物增多、打噴嚏、食欲不振和發(fā)育不良為特征的卡他性炎癥中，大部分是由B.bronchiseptica引起的。Spanoghe[15]通過對32個兔場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，B.bronchiseptica的感染率為高達(dá)20%～47%。有研究報道，鼻炎和胸膜肺炎患兔中B.bronchiseptica的檢出率分別高達(dá)35.8%[16]和46.0%[17]。由此可見，B.bronchiseptica仍然是兔呼吸道病的重要病原。B.bronchiseptica可單獨感染家兔，也可與其他病原菌混合感染致病，而在臨床上，混合感染所占的比例更大。張尤嘉和劉光遠(yuǎn)[18]以鼻孔、口角流大量黏液，呼吸急促，打噴嚏的病兔為研究對象，發(fā)現(xiàn)B.bronchiseptica與巴氏桿菌混合感染是造青年兔和仔兔死亡的主要原因；魏義清和李振[19]通過對患病獺兔的研究發(fā)現(xiàn)B.bronchiseptica與球蟲是造成病免精神不振，食欲減退、鼻腔流黏性分泌物，打噴嚏的主要原因。

表3 不同藥物對Brodetella bronchiseptica分離株的抑菌效果

K.pneumoniae是一種廣泛分布于自然界中的人畜共患條件性致病菌，該菌主要寄生在多種動物及人的呼吸道、消化道、泌尿生殖道以及皮膚等部位。據(jù)報道，K.pneumoniae可以感染人及鼠、雞、鴨、狐貍、熊貓、牛、羊、豬、兔等多種動物[20-25]。家兔感染K.pneumoniae，主要分為腹瀉型和肺炎型兩類[26]。成年兔感染K.pneumoniae后主要表現(xiàn)出肺炎和呼吸道及其他器官的化膿性炎癥等肺炎型特征，而幼兔則主要表現(xiàn)出腹瀉和迅速死亡等腹瀉型特征[27-28]。家兔感染肺炎型較為常見，通常在氣溫突變時多發(fā)，且傳染能力強(qiáng)。病兔感染K.pneumoniae后，表現(xiàn)出呼吸困難、打噴嚏等臨床癥狀，剖解可見氣管出血、肺部的充血和出血，化膿等病理變化[29-30]。另外，李明勇等[31]通過對規(guī)?；B(yǎng)兔場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，仔兔感染K.pneumoniae后死亡率達(dá)15%～20%。我們課題組以往的研究顯示，幼兔感染后會出現(xiàn)劇烈腹瀉，快速死亡等特點[32]。這些報道與本研究家兔感染后發(fā)生呼吸困難、腹瀉死亡的結(jié)果一致。

目前，在家兔呼吸道傳染病中，兔支氣管敗血波氏桿菌和兔肺炎克雷伯菌病流行廣泛且嚴(yán)重。以往的報道顯示，B.bronchiseptica和K.pneumoniae都可感染各種家禽、家畜、野生動物以及水生動物，使機(jī)體受到嚴(yán)重?fù)p傷，但少見B.bronchiseptica與K.pneumoniae混合感染兔的報道。本研究對河南省某兔場發(fā)病兔的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，病兔打噴嚏、呼吸困難并且伴隨腹瀉。病死兔剖檢后的病理變化與B.bronchiseptica、K.pneumoniae感染后極其相似，難以通過臨床觀察和病理剖檢鑒別診斷。本研究成功從疑似病兔組織中分離得到兩種不同的革蘭陰性菌，通過病原菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定、序列分析及動物回歸試驗等研究發(fā)現(xiàn)本次分離菌株為B.bronchiseptica和K.pneumoniae。

表4 不同藥物對Klebsiella pneumoniae分離株的抑菌效果

發(fā)病兔感染兩種病菌后可通過呼吸道傳播病菌，當(dāng)帶菌兔和病兔咳嗽、打噴嚏時，病菌會隨咳嗽、噴嚏飛沫污染飼料、飲水、籠舍和空氣，從而傳染給健康兔，傳染性很強(qiáng)。兩種菌都可寄生在兔呼吸道黏膜上，當(dāng)家兔受到不良因素刺激、抵抗力下降、病菌侵入機(jī)體等影響，都可能引起家兔發(fā)病。發(fā)病兔病程長，病情反復(fù)，難以徹底治愈，造成患兔生長障礙，飼料利用率低，給養(yǎng)兔業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[33]。家兔發(fā)病時，及時用敏感藥物控制感染十分必要，但由于生產(chǎn)中抗生素的不當(dāng)使用導(dǎo)致很多病原菌對藥物產(chǎn)生耐藥性，往往導(dǎo)致治療效果不好。本次藥敏試驗顯示，B.bronchiseptica和K.pneumoniae同時對慶大霉素、頭孢曲松、頭孢唑啉等三種藥物敏感，對其他藥物有不同程度的耐藥性。臨床上選用慶大霉素給感染病兔飲水?dāng)z入，病情很快得到控制，3 d后98%的病兔病情得到有效控制。因此當(dāng)兔場發(fā)生該病時，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果指導(dǎo)科學(xué)用藥，方能獲得良好的療效。

4 結(jié) 論

從病兔組織中分離出兩種革蘭陰性菌，通過分離培養(yǎng)、生化鑒定、序列分析及動物回歸試驗等確定分離菌株為支氣管敗血波氏桿菌和肺炎克雷伯菌。經(jīng)藥敏試驗測定發(fā)現(xiàn)分離得到的支氣管敗血波氏桿菌和肺炎克雷伯菌都對慶大霉素、頭孢曲松、頭孢唑啉3種藥物敏感，對所檢測的其他藥物有不同程度的耐藥性。