鄭紅青，吳旭錦*，朱小甫，尹寶英，高軍花，李艷芝，植嬋萍

(1.咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，咸陽(yáng)市動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，咸陽(yáng) 712000；2.邢臺(tái)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，邢臺(tái) 054001； 3.衡水職業(yè)技術(shù)學(xué)院，衡水 053000； 4.廣東茂名農(nóng)林科技職業(yè)學(xué)院，茂名 525000)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)最早于1971年發(fā)現(xiàn)于英國(guó)[1]，2010年之前的毒株由于有疫苗毒株的保護(hù)，以零星發(fā)病為主要特征。習(xí)慣上把2010年之前的PEDV毒株分到G1a組[2]。在2010年10月，我國(guó)南方幾個(gè)省發(fā)現(xiàn)了新的變異毒株，這些毒株主要危害7日齡以內(nèi)的仔豬，仔豬發(fā)病率和死亡率可高達(dá)90%[3]。PEDV屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬，是有膜的單股正義RNA病毒，核酸長(zhǎng)約28 kb，包括5′端帽子結(jié)構(gòu)和3′的poly A尾。基因組有6個(gè)開放閱讀框，分別為ORF1a/1b，分別編碼S、M、E、N和ORF3，其中ORF1a/1b又被切割成16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[4]。這些非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)于病毒基因的復(fù)制至關(guān)重要。S基因可被切割成S1和S2亞單位，與病毒的進(jìn)入和膜融合有關(guān)。由于RNA病毒的易突變決定了PED疫苗研發(fā)的難度[5]，目前PEDV突變毒株已經(jīng)在世界范圍內(nèi)進(jìn)化了4個(gè)主要的組群，給我國(guó)和世界養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[3]。

微小RNA(microRNA，miRNAs)是非編碼RNA，長(zhǎng)18～25 bp，不編碼蛋白質(zhì)。成熟的microRNAs是單鏈的，通過與靶蛋白mRNA 3′UTR區(qū)域的結(jié)合，導(dǎo)致靶蛋白mRNA被切割，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平，甚至影響蛋白翻譯的水平，調(diào)控蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)過程[6]。近年來的研究表明，miRNAs也可以通過直接與病毒基因組RNA結(jié)合或者通過改變細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜來影響RNA病毒的復(fù)制和致病性[7]。在關(guān)于miR-133c-3p的研究中發(fā)現(xiàn)，它在多種細(xì)胞中發(fā)揮著調(diào)控細(xì)胞凋亡和增殖的作用。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-133c-3p可抑制心肌細(xì)胞的纖維化和心肌肥大[8]。另外，在癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-133c-3p可抑制細(xì)胞的增殖和遷移[9-11]。

BCL2蛋白家族整合了觸發(fā)細(xì)胞存活或凋亡的信號(hào)，BCL-w蛋白(又稱為BCL2樣蛋白2)，屬于BCL2家族的成員，由BCL2L2基因編碼[12]。研究表明，BCL-w的BH1結(jié)構(gòu)域的Gly94殘基可以抑制BAK的活性，BCL-w的抗凋亡作用主要通過與BAK、BAX相互作用發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用[13]。非刺激情況下，BCL-w蛋白通常通過其疏水結(jié)構(gòu)域與線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜的脂質(zhì)雙分子層結(jié)合，在靜息細(xì)胞中，BCL-w的c端結(jié)構(gòu)域在疏水囊內(nèi)折疊，僅松散地附著在線粒體膜上，當(dāng)接收到凋亡信號(hào)時(shí)，BCL-w的c端臂通過促凋亡BH3-only蛋白的連接釋放，從而促進(jìn)BCL-w與線粒體之間的緊密相互作用發(fā)揮抗凋亡的作用[14-15]。

關(guān)于PEDV感染引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制，有研究對(duì)PEDV感染細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，感染前后與凋亡相關(guān)信號(hào)通路分子表達(dá)水平差異顯著[16]，并且PEDV也可以通過p53和線粒體凋亡通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17-18]。PEDV感染誘導(dǎo)Vero細(xì)胞凋亡[19]，那么PEDV是否也誘導(dǎo)MARC-145細(xì)胞的凋亡，這種凋亡是否由于microRNAs的表達(dá)豐度改變影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，而凋亡蛋白表達(dá)量的改變抑制或促進(jìn)了細(xì)胞凋亡呢？對(duì)這個(gè)問題的研究將對(duì)闡明PEDV致病機(jī)制具有重要意義。

本研究首先以PEDV感染MARC-145細(xì)胞為模型，分析了在PEDV感染過程中與細(xì)胞凋亡相關(guān)的microRNAs表達(dá)豐度的變化，選取差異表達(dá)最明顯的miR-133c-3p進(jìn)一步探究PEDV感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，以期為明確PEDV的胞內(nèi)復(fù)制機(jī)制及抵抗PEDV感染提供新的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

MARC-145細(xì)胞(非洲綠猴腎上皮細(xì)胞)(咸陽(yáng)市動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)實(shí)驗(yàn)室保存，Vero細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室保存，高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；減血清培養(yǎng)基OPTI-MEM、胰蛋白酶、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、microRNA模擬物(miR-133-3p mimics)、模擬物對(duì)照(mimics control)、抑制劑(inhibitor)和抑制劑對(duì)照(inhibitor control)、SC、siBCL-w-1、siBCL-w-2、siBCL-w-3、CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；胎牛血清購(gòu)自德國(guó)PAN-Biotech公司；熒光定量試劑盒、microRNA第一股RNA合成試劑盒、總RNA提取試劑RNAiso均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(貨號(hào)：bs-0295G-HRP)和HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG(貨號(hào)：bs-40296G-HRP)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；引物由北京擎科生物公司合成，引物序列見表1；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司； PEDV N蛋白單克隆抗體由上海獸醫(yī)研究所童光志研究員饋贈(zèng)；細(xì)胞內(nèi)參β-actin和BCL-w蛋白的抗體購(gòu)于細(xì)胞信號(hào)通路技術(shù)公司；pmirGLO質(zhì)粒購(gòu)自普洛麥格公司。anti-BCL-w (2724)購(gòu)自Cell Signaling Technology (CST)。

1.2 病毒和細(xì)胞培養(yǎng)

本研究使用的PEDV毒株為CH/HBTS/2017(GenBank收錄號(hào)：MH581489.1)，作者于2018年分離自河北唐山某暴發(fā)豬流行性腹瀉豬場(chǎng)的病料中。MARC-145細(xì)胞用含有10% 胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.3 豬流行性腹瀉病毒感染MARC-145細(xì)胞

用Vero細(xì)胞擴(kuò)增病毒，待細(xì)胞病變80%時(shí)收毒，TCID50測(cè)病毒滴度，細(xì)胞長(zhǎng)到80%融合度，用PBS緩沖液清洗3遍，配制含5 μg·mL-1胰酶的DMEM感染液，將病毒加到MARC-145細(xì)胞上，輕輕搖勻，孵育1.5 h后棄掉毒液，換液在CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 免疫熒光試驗(yàn)

MARC-145長(zhǎng)成單層細(xì)胞后，用含2 μg·mL-1胰酶的DMEM培養(yǎng)液感染CH/HBTS/2017毒株，感染復(fù)數(shù)為0.1 MOI。12 h后留樣用4%多聚甲醛4 ℃ 固定30 min，再用1% Triton 100室溫通透10 min， PBS洗3次，每次5 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗PEDV N蛋白抗體過夜孵育，PBS洗3次， 每次5 min。FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(貨號(hào)：bs-0296G-FITC)室溫孵育1 h，Hochest 33258染核5 min， 封片觀察。

1.5 TCID50的測(cè)定

經(jīng)過24 h培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MARC-145細(xì)胞，消化后將濃度稀釋到2×105個(gè)·mL-1左右，鋪到96孔板，每孔加100 μL細(xì)胞混懸液，將培養(yǎng)板放到細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h長(zhǎng)成單層細(xì)胞。用10支1.5 mL離心管，每管900 μL 含10 μg·mL-1胰酶的DMEM培養(yǎng)基依次將病毒倍比稀釋(從10-1稀釋到10-10)，將96孔板培養(yǎng)的單層細(xì)胞用PBS洗3遍后， 按照96孔板上的列數(shù)從第1～10列將病毒稀釋液依次加入，剩余只加培養(yǎng)基作對(duì)照。第3天用Reed-Muench方法計(jì)算TCID50。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將MARC-145細(xì)胞以2×105個(gè)·孔-1的密度接種至12 孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑使用說明書，將mimics control(MC)、miR-133c-3p、inhibitor、inhibitor control(IC)和LipofectamineTM2000分別跟OPTI-MEM混合，室溫靜置5 min后，將合成的模擬物和抑制劑的混合液及其對(duì)照分別跟Lipofectamine混合液混合，輕輕混勻，靜置15 min后，輕輕滴到細(xì)胞培養(yǎng)液上。

1.7 熒光定量PCR(RT-qPCR)

培養(yǎng)細(xì)胞處理后用PBS沖洗3遍，加RNAiso到細(xì)胞表面，靜置5 min，按照廠家說明書提取細(xì)胞的總RNA。用500 ng的細(xì)胞總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，按照microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書所示，合成microRNA的cDNA，使用定量PCR試劑盒和特異性引物(表1)進(jìn)行熒光定量PCR的反應(yīng)體系配制，使用熒光定量PCR儀在反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min， 95 ℃ 20 s、62 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 3 min條件下進(jìn)行反應(yīng)。

其中microRNA內(nèi)參使用試劑盒中的U6 small RNA引物，BCL2L2內(nèi)參為GAPDH，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA和BCL2L2 mRNA表達(dá)。

1.8 MTT試驗(yàn)

每孔約5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，到80%融合度時(shí)將模擬物對(duì)照按照0、20、50 nmol·L-1轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，24 h后移除培養(yǎng)基，每孔加20 μL 5 mg·mL-1無菌的MTT染料，37 ℃培養(yǎng)4 h，每孔加150 μL的DMSO，讀取490 nm的吸光值。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)

經(jīng)過不同處理的細(xì)胞用胰酶消化下來，用PBS洗1遍，用FACS buffer重懸，單細(xì)胞懸液在Annexin V中室溫孵育30 min上機(jī)檢測(cè)。

1.10 熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)

將含有miR-133c-3p結(jié)合位點(diǎn)的BCL2L2 3′UTR區(qū)域的野生型(WT)和突變型(MuT)連接到pmirGLO熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，分別命名為pmir-BCL2L2-WT和pmir-BCL2L2-MuT，將miR-133c-3p模擬物和模擬物對(duì)照(MC)跟上述2個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)MARC-145細(xì)胞，48 h后，按照熒光素酶報(bào)告基因試劑盒使用說明使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性。

表1 引物序列

1.11 Western blot

將含蛋白酶抑制劑的RIPA加到處理細(xì)胞表面，冰上孵育30 min，12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清提取細(xì)胞的總蛋白。提取的總蛋白用蛋白定量試劑盒定量，SDS-PAGE電泳時(shí)每孔加相同的蛋白量，電泳完畢轉(zhuǎn)到PVDF膜，轉(zhuǎn)膜完成后用5%的脫脂奶粉液封閉，然后用一抗[PEDV N蛋白抗體或anti-BCL-w (2724)]4 ℃孵育過夜，再用HRP標(biāo)記二抗(羊抗小鼠IgG或羊抗兔IgG)室溫孵育2 h，TBST洗3遍，使用曝光顯影液進(jìn)行曝光。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 PEDV感染MARC-145細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

將PEDV毒株CH/HBTS/2018株以0.1和1 MOI感染MARC-145細(xì)胞，細(xì)胞在0、12和24 h后細(xì)胞病變?nèi)鐖D1a所示，在感染12 h后細(xì)胞也出現(xiàn)了融合的現(xiàn)象，但融合細(xì)胞數(shù)量比較少，在感染24 h后1 MOI感染的細(xì)胞病變出現(xiàn)了片狀融合。12和24 h病毒的滴度如圖1b所示，1 MOI感染后24 h病毒滴度在6.5 lgTCID50·mL-1左右，0.1 MOI感染24 h后病毒滴度在4.2 lg TCID50·mL-1左右。由結(jié)果可知，病毒可以在MACR-145細(xì)胞高效增殖。在病毒感染12 h后留樣，間接免疫熒光示蹤病毒，檢測(cè)病毒感染細(xì)胞的情況，如圖1c所示，病毒以0.5和0.1 MOI感染可以在MARC-145細(xì)胞內(nèi)高效復(fù)制。分別以0.0、0.1、0.5、1.0 MOI感染MARC-145細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PEDV感染MarC145細(xì)胞24 h后細(xì)胞的凋亡情況，如圖1e所示，與對(duì)照組相比，感染0.1 MOI病毒12 h后，細(xì)胞凋亡率顯著升高(圖1d)(P<0.05)，隨著感染復(fù)數(shù)的增大，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.01)。

2.2 PEDV感染引起miR-133c-3p顯著上調(diào)

為了進(jìn)一步探究PEDV感染引起細(xì)胞凋亡的原因，進(jìn)一步從RNA水平揭示PEDV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，選擇了6個(gè)文獻(xiàn)中報(bào)道的影響細(xì)胞凋亡的microRNAs，分別是miR-133c-3p、miR-7、miR-186-5p、miR-155、miR-149-5p、miR-138-5p。使用RT-qPCR方法檢測(cè)在PEDV感染前后它們的表達(dá)差異。如圖2所示，miR-133c-3p的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，miR-149-5p略有升高(P<0.05)，miR-138-5p表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，miR-7、miR-186-5p和miR-155的表達(dá)在PEDV感染前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 過表達(dá)miR-133c-3p促進(jìn)了細(xì)胞凋亡

將合成的miR-133c-3p的模擬物對(duì)照(MC)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用MTT試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果表明0、20、30、50 nmol·L-1的轉(zhuǎn)染濃度不影響細(xì)胞活性(圖3a)。轉(zhuǎn)染miR-133c-3p后6 h感染PEDV，繼續(xù)感染18 h后收樣，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，miR-133c-3p過表達(dá)并感染PEDV后細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.001)(圖3)。

2.4 敲低miR-133c-3p抑制了病毒感染引起的細(xì)胞凋亡

將miR-133c-3p的抑制劑轉(zhuǎn)染MARC-145 12 h換液后感染1 MOI病毒，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后收取細(xì)胞樣品，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，敲低miR-133c-3p后細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.01)(圖4)。

2.5 PEDV感染后下調(diào)了miR-133c-3p的靶基因BCL-w的表達(dá)

為了進(jìn)一步確認(rèn)miR-133c-3p調(diào)控的靶基因，使用生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測(cè)其靶基因，熒光素酶報(bào)告基因用來驗(yàn)證miR-133c-3p和BCL2L2 3′UTR區(qū)域的結(jié)合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCL2L2基因的3′UTR區(qū)域有miR-133c-3p的結(jié)合位點(diǎn)(圖5a)，進(jìn)一步檢測(cè)了miR-133c-3p的模擬物(mimic)和模擬物對(duì)照(MC)轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-133c-3p可以顯著降低野生型報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性，而對(duì)突變型質(zhì)粒沒有影響(P<0.01)，這表明miR-133c-3p可以與BCL2L2靶基因區(qū)域的結(jié)合(圖5b)。Western blot檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-133c-3p 24 h時(shí)BCL-w蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-133c-3p可以在細(xì)胞內(nèi)下調(diào)BCL-w基因的表達(dá)水平，并且PEDV感染也可以下調(diào)BCL-w的表達(dá)水平(P<0.001)(圖5c)。

2.6 敲低BCL-w可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡

為了檢測(cè)BCL-w是否影響細(xì)胞凋亡，合成3條siRNAs，分別將siRNA control(SC)、siBCL-w-1、siBC-Lw-2、siBCL-w-3(序列見表1)轉(zhuǎn)染MARC-145，Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)BCL-w的表達(dá)水平，由圖6a可知，siBCL2L2-3敲除效率最高。將SC和siBCL-w-3轉(zhuǎn)染細(xì)胞后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，敲低BCL-w的表達(dá)水平促進(jìn)了細(xì)胞凋亡(圖6b)。

a.不同感染復(fù)數(shù)PEDV感染MARC-145細(xì)胞的病變；b.不同感染復(fù)數(shù)感染MARC-145細(xì)胞后12和24 h后病毒的滴度；c.IFA檢測(cè)PEDV感染MARC-145細(xì)胞的感染情況；d.不同劑量 PEDV 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡百分比柱狀圖；e.流式細(xì)胞儀檢測(cè) PEDV 誘導(dǎo) MARC-145細(xì)胞凋亡程度；與Mock組比較，*. P<0.05和**. P<0.01表示顯著差異。下同a. Cytopathy infected with 0.1 and 1 MOI virus in MARC-145 cells. b. Virus titer infected with 0.1 and 1 MOI virus in MARC-145 cells; c. Results of of MARC-145 cells apoptosis that are detected by flow cytometry after 0, 0.1, 0.5, 1 MOI of the PEDV infected; d. Histogram of apoptotic rate in different dose of PEDV; e. The apoptosis of Marc-145 cells induced by PEDV detected by flow cytometry. Compared with Mock group, *.P<0.05, **.P<0.01 and * * *.P<0.001 indicate significant difference at 0.05, 0.01 and 0.001 level, separately, the same as below圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒感染MARC-145細(xì)胞的凋亡率Fig.1 The apoptotic rate of MARC-145 cells was measured after PEDV infection by using flow cytometry

3 討 論

PEDV感染仔豬后能引起仔豬尤其是7日齡以內(nèi)的仔豬嚴(yán)重的腹瀉，給我國(guó)和世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[20-21]。由于RNA病毒易突變的特性，至今沒有有效的疫苗可用，因此急需對(duì)病毒感染細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行深入研究。

圖2 與凋亡相關(guān)的microRNAs表達(dá)情況Fig.2 Expression of microRNAs related to apoptosis

本試驗(yàn)通過檢測(cè)PEDV感染細(xì)胞時(shí)凋亡相關(guān)microRNAs的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)了與PEDV感染關(guān)系密切的miR-133c-3p，為了進(jìn)一步研究miR-133c-3p在PEDV感染過程中所起的作用，過表達(dá)miR-133c-3p后發(fā)現(xiàn)miR-133c-3p抑制了PEDV的復(fù)制，并且促進(jìn)了感染細(xì)胞的凋亡。為了確定miR-133c-3p調(diào)控的主要靶點(diǎn)，用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在BCL2L2的3′UTR區(qū)域有其結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)證明miR-133c-3p可以在體外與BCL2L2 3′UTR區(qū)域結(jié)合，在過表達(dá)miR-133c-3p后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)BCL-w的表達(dá)水平下調(diào)。

a.轉(zhuǎn)染不同濃度的模擬物對(duì)照，MTT檢測(cè)細(xì)胞活性的影響；b.凋亡率的柱狀圖；c.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過表達(dá)miR-133c-3p后細(xì)胞的凋亡率a. MTT to detect the effect of cell viability after transfection of different concentrations of mimic control; b. Histogram of apoptotic rate; c. The cell apoptosis rate after over-express of miR-133c-3p and then analyzed by flow cytometry圖3 過表達(dá)miR-133c-3p對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of over-expression of miR-133c-3p on cells apoptosis

與IC組比較，**.P<0.01表示顯著差異Compared to IC group, **.P<0.01 indicate a significant difference圖4 敲低miR-133c-3p后細(xì)胞的凋亡率Fig.4 The apoptosis rate of cells after knock-down of miR-133c-3p

a.生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)在BCL2L2 3′UTR的靶向結(jié)合位點(diǎn)；b.miR-133c-3p可以下調(diào)野生型質(zhì)粒的熒光素酶活性；c.過表達(dá)miR-133c-3p下調(diào)細(xì)胞內(nèi)BCL-w和PEDV蛋白的表達(dá)的水平；與MC組比較，**.P<0.01和***.P<0.001表示顯著差異a. Bioinformatics methods to predict the target binding site in BCL2L2 3′UTR; b. miR-133c-3p down-regulate the luciferase activity of wild-type plasmids; c. Overexpression of miR-133c-3p down-regulates the level of BCL-w and PEDV in cells; **.P<0.01 and ***.P<0.001 indicate significant difference圖5 BCL2L2是miR-133c-3p的靶基因Fig.5 BCL2L2 is the target gene of miR-133c-3p

a. Western blot 檢測(cè)siRNAs的敲除效率；b.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)檢測(cè)敲低BCL-w后細(xì)胞的凋亡情況，***.P<0.001表示顯著差異a. The level of BCL-w after know-down of siRNAs; b. The cell apoptosis rate after transfection of siBCL-w and then analyzed by flow cytometry; **. P<0.01 and ***.P<0.001 indicate a significant difference圖6 敲低BCL-w誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Fig.6 Know-down of BCL-w promote the cell apoptosis

凋亡是細(xì)胞為了適應(yīng)外界刺激發(fā)生的程序性的死亡，病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡會(huì)抑制病毒持續(xù)感染和擴(kuò)散，從而防止組織進(jìn)一步損傷[22]。研究表明，許多冠狀病毒可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如中東呼吸道綜合征冠狀病毒(MERS)和SARS冠狀病毒感染都可以誘導(dǎo)感染細(xì)胞的凋亡[23-24]，傳染性胃腸炎病毒可以誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞的凋亡[25]，而PEDV可以誘導(dǎo)Vero細(xì)胞凋亡[18]，本研究結(jié)果顯示，PEDV感染可誘導(dǎo)MARC-145細(xì)胞的凋亡，并且隨著感染復(fù)數(shù)的增大凋亡率也相應(yīng)增加。病毒可以通過誘導(dǎo)凋亡促進(jìn)病毒釋放，也可以在病毒感染的前期抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)病毒的復(fù)制[26-27]，這可能也意味著凋亡在病毒感染的不同階段發(fā)揮不同的作用。

microRNAs是一類很短的RNA分子，在細(xì)胞增殖、分化、死亡和發(fā)育這些生物過程中發(fā)揮重要的作用，它發(fā)揮作用的機(jī)制是通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后水平而影響相應(yīng)蛋白表達(dá)水平[22]。病毒在感染細(xì)胞的過程中會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)microRNAs的表達(dá)譜，而這些microRNAs會(huì)靶向重要的細(xì)胞元件，導(dǎo)致細(xì)胞生理過程的改變。A型流感病毒感染A549細(xì)胞后，miR-34a 的表達(dá)顯著下降[28]，而另一篇報(bào)道稱A型流感病毒引起miR-29c的表達(dá)上調(diào)[29]，我們先前在MARC-145細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)PEDV的感染能引起miR-671-5p表達(dá)的上調(diào)[30]，本研究發(fā)現(xiàn)PEDV的感染能引起細(xì)胞miR-133c-3p表達(dá)的上調(diào)，該結(jié)果說明病毒感染可能通過改變microRNAs表達(dá)的豐度來改變細(xì)胞的生理狀態(tài)。從microRNAs水平解釋PEDV感染細(xì)胞時(shí)對(duì)凋亡的調(diào)控，這將為闡明病毒和細(xì)胞互作的分子機(jī)制提供依據(jù)，從而為抗PEDV新方法的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

病毒感染引起的microRNA變化有可能影響病毒的復(fù)制，很可能病毒存在多種促進(jìn)和抑制自身復(fù)制的機(jī)制，這些機(jī)制受多種因素的影響處于動(dòng)態(tài)變化中。一方面，microRNAs通過下調(diào)凋亡抑制蛋白的表達(dá)水平誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如miR-15/16通過下調(diào)BCL2促進(jìn)細(xì)胞凋亡[31]，miR-186-5p通過下調(diào)IGF-1(胰島素樣生長(zhǎng)因子)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[32]，miR-146a通過下調(diào)BCL2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[33]，另一方面，miRNAs通過下調(diào)凋亡激活通路的蛋白抑制細(xì)胞凋亡，如miR-C12通過抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)皰疹病毒的復(fù)制[34]，并且，先前研究表明，miR-133c-3p可以通過靶向幾個(gè)凋亡抑制蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如在狼瘡腎炎中miR-133c-3p通過靶向LASP1抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[35]；在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-133c-3p可以通過抑制EGF的表達(dá)水平促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制了細(xì)胞增殖[11]。而在本研究中，PEDV感染上調(diào)了miR-133c-3p的水平，而上調(diào)的miR-133c-3p又促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，而且敲低BCL-w后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是凋亡率沒有過表達(dá)miR-133c-3p所引起的凋亡率高，這可能提示，miR-133c-3p可能靶向多個(gè)凋亡抑制蛋白或通過多種途徑影響細(xì)胞凋亡。本研究不僅證明了miR-133c-3p誘導(dǎo)凋亡的作用，而且進(jìn)一步豐富了miR-133c-3p的調(diào)控凋亡的機(jī)制。

BCL2L2作為BCL2家族蛋白的分子，是重要的凋亡抑制劑，miR-335c-5p通過下調(diào)BCL2L2的水平促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)了化療的敏感性[36]，miR-126a-5p通過下調(diào)BCL2L2促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡[37]，BCL2L2是microRNA影響細(xì)胞凋亡的過程中一個(gè)很重要的靶基因，本研究中，miR-133c-3p靶向調(diào)控BCL2L2。該結(jié)果提示，miR-133c-3p通過靶向BCL2L2調(diào)控細(xì)胞凋亡機(jī)制有可能是PEDV感染MARC-145細(xì)胞引起凋亡很重要的因素。

綜上所述，PEDV的感染誘導(dǎo)MARC-145細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PEDV的感染顯著上調(diào)了miR-133c-3p的表達(dá)，而miR-133c-3p通過下調(diào)其靶基因下調(diào)了凋亡抑制蛋白BCL-w的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，本研究為抵抗PEDV新方法的研究提供了理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

PEDV的感染上調(diào)了miR-133c-3p的表達(dá)，導(dǎo)致BCL-w表達(dá)水平降低，從而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。