劉曉倩，靳蘭杰，董艷秋，李冬杰，張 萃，谷書凱，李世杰*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 保定 071000; 2.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 石家莊 050018)

在哺乳動物細(xì)胞中，絕大多數(shù)位于常染色體上的基因在子代中表現(xiàn)為雙等位基因表達(dá)，且親本等位基因的表達(dá)水平相同。然而，一部分基因表現(xiàn)為只在母源染色體上表達(dá)或只在父源染色體上表達(dá)，此現(xiàn)象稱為基因組印記[1]。根據(jù)親本等位基因的表達(dá)狀態(tài)，分為母源印記基因和父源印記基因?；蛴∮洸粌H調(diào)控胚胎和胎盤的生長，而且在胎兒出生后的生長，以及在大腦功能方面均有重要作用[2-3]。印記基因的表達(dá)紊亂還與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[4]。

水通道蛋白1(aquaporin 1，AQP1)基因編碼質(zhì)膜水運輸?shù)鞍譡5]，在小鼠(Musmusculus)6號染色體的Mest-Nap1l5印記區(qū)域內(nèi)被鑒定為胎盤特異性的父源印記基因[6]。AQP1基因的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。AQP1基因表達(dá)上調(diào)會使細(xì)胞膜電位發(fā)生變化，并激活Wnt[7]、FAK[8]等一系列下游信號通路，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖及血管生成，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。AQP1基因的DNA甲基化調(diào)控與唾液腺腺樣囊性癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤密切相關(guān)[10-11]。AQP1基因的缺失可以保護(hù)腦外傷，降低腫瘤生長[12]。AQP1基因在其他物種中的印記狀態(tài)尚未被揭示，本研究首先對AQP1基因在牛(Bostaurus)中的印記狀態(tài)進(jìn)行分析。

調(diào)控印記的表觀遺傳修飾方式有多種，其中DNA甲基化最為重要，其中差異甲基化區(qū)(differentially methylated region, DMR)起調(diào)控作用，位于啟動子區(qū)的DMR發(fā)生甲基化異常會直接導(dǎo)致印記基因出現(xiàn)雙等位表達(dá)或沉默[13]。本研究應(yīng)用亞硫酸氫鹽測序法對牛AQP1基因啟動子和第一個外顯子區(qū)CpG島在組織和胎盤中的DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行了分析，以揭示DNA甲基化修飾在調(diào)控AQP1基因印記表達(dá)中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

32頭成年雌性荷斯坦奶牛組織樣本取自河北省保定市當(dāng)?shù)赝涝讏?，屠宰后立即采集每個個體的組織樣本(心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪)放入液氮中；15個自然分娩后的胎盤樣本取自保定市某奶牛養(yǎng)殖場，并收集每個胎盤樣本對應(yīng)的母本血液和父本精子。所有樣本-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 牛組織及胎盤的RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 利用RNAios plus試劑盒(TaKaRa，中國)提取各組織及胎盤的總RNA；利用UEIrisⅡ RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis (with dsDNase, US Everbright Inc, 美國)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20 ℃凍存。

1.2.2 牛組織及胎盤的RT-PCR 通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站查找牛AQP1 的mRNA序列(NC_037331.1)，在UCSC Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/)Blat查找AQP1基因的DNA序列，利用Primer 5軟件設(shè)計引物AQP1-2F和AQP1-R(表1)，通過PCR擴增各組織及胎盤的cDNA。以GAPDH(Accession No.:BTU85042)為內(nèi)參基因，設(shè)計引物Gap-F和Gap-R，擴增無內(nèi)含子片段長度為375 bp。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：10×LA Tap Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，LA Taq DNA聚合酶0.1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL， 模板1 μL(50 ng)，ddH2O 17.4 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，44 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 牛心組織及胎盤的DNA提取及SNP鑒定 利用DNA提取試劑盒(生工，上海)提取32頭 荷斯坦奶牛心組織的DNA和15頭荷斯坦奶牛胎盤的DNA。引物為AQP1-1F、AQP1-R(表1)通過PCR擴增技術(shù)擴增1 615 bp的DNA片段。PCR反應(yīng)體系及條件同“1.2.2”，其中退火條件為52 ℃， 60 s。擴增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對產(chǎn)物進(jìn)行純化回收及測序。查看測序結(jié)果，找到雙峰的SNP位點即可確定雜合子個體。

表1 引物信息

1.2.4 牛雜合子個體和雜合子胎盤的等位基因表達(dá)及印記狀態(tài)分析 以雜合子個體各組織(心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪)及胎盤cDNA為模板，利用跨內(nèi)含子引物AQP1-2F、AQP1-R， PCR擴增包含SNP位點的717 bp片段。反應(yīng)體系及條件同“1.2.2”，反應(yīng)條件中退火的溫度為52 ℃。對擴增產(chǎn)物進(jìn)行回收測序。通過SNP位點處測序峰圖，確定AQP1基因的等位基因表達(dá)狀態(tài)。結(jié)合雜合子胎盤對應(yīng)的父母基因型，確定AQP1基因的印記狀態(tài)，若SNP位點表達(dá)與父本相同，則為父源表達(dá)母源印記；若SNP位點表達(dá)與母本相同，則為母源表達(dá)父源印記。

1.2.5 亞硫酸氫鹽處理DNA模板及巢式PCR擴增 使用Zymo甲基化試劑盒對?；蚪MDNA模板進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取牛AQP1基因序列，分析基因啟動子區(qū)富含CG的序列，利用MethPrimer在線軟件對序列進(jìn)行轉(zhuǎn)換，即非CG位點的C均替換為T，并依據(jù)此序列設(shè)計甲基化特異的巢式PCR引物(表1)。巢式PCR外側(cè)引物為M-F1、 M-R1，擴增片段長度為582 bp；內(nèi)側(cè)引物為M-F2、M-R2，擴增序列長度為471 bp，引物序列見表1。外側(cè)引物PCR擴增體系及條件同“1.2.2”，反應(yīng)條件中退火的溫度為50.6 ℃。取1 μL PCR產(chǎn)物稀釋30倍后作為內(nèi)側(cè)引物擴增的模板，PCR反應(yīng)體系及條件同“1.2.2”，反應(yīng)條件中退火的溫度為49.9 ℃。將二次PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序。

1.2.6AQP1基因啟動子DNA甲基化PCR產(chǎn)物克隆、測序 將pMD19-T載體(TaKaRa)與膠回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入500 μL LB液體培養(yǎng)基，在37 ℃搖床內(nèi)150 r·min-1搖菌培養(yǎng)2 h。配制含有氨芐青霉素(100 mg·mL-1)的固體LB培養(yǎng)基，倒于培養(yǎng)皿中，向培養(yǎng)基中加入4 μL IPTG(200 ng·μL-1)和25 μL X-gal(20 mg·μL-1),取培養(yǎng)好的菌液200 μL， 均勻涂到培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃恒溫箱中，培養(yǎng)過夜。次日挑取白色單一陽性克隆置于加有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h。

將培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行測序。將檢測序列與轉(zhuǎn)化后的DNA序列進(jìn)行比較，分析甲基化狀態(tài)，甲基化CpG位點的C無變化，而非甲基化CpG位點的C變成T。

2 結(jié) 果

2.1 AQP1基因在不同組織中的表達(dá)檢測

用RT-PCR檢測AQP1基因在牛7個組織中的表達(dá)情況。隨機提取3頭牛心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪組織的RNA及3個胎盤的RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，相同組織cDNA混合為模板，用AQP1-2F和AQP1-R為引物，均獲得1條長為717 bp的序列條帶(圖1A，圖2A)。對擴增產(chǎn)物進(jìn)行回收并測序，序列分析確定為AQP1基因外顯子片段，表明AQP1基因在牛心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪組織和胎盤中均有較高的表達(dá)量。

2.2 AQP1基因在牛組織中的等位基因表達(dá)分析

2.2.1 牛組織中AQP1基因的SNP檢測 以32頭牛的基因組DNA為模板，擴增AQP1基因片段，引物為AQP1-1F和AQP1-R，得到1 615 bp的DNA片段，產(chǎn)物直接回收測序，分析測序峰圖發(fā)現(xiàn)兩個雜合SNPs(rs382748905、rs108948845)位點(圖1B)，分別位于擴增產(chǎn)物的786 bp(C/T)和1 033 bp (T/C)處。存在雜合SNP的個體稱為雜合子個體，鑒定出的雜合子個體與純合子個體比例為5∶27。鑒定的雜合子牛用于AQP1基因在牛組織的等位基因表達(dá)分析。

2.2.2AQP1基因在牛組織中的等位基因表達(dá)分析 對比雜合子牛的DNA水平和不同組織的轉(zhuǎn)錄水平SNP位點處測序峰圖，確定AQP1基因在牛不同組織中的表達(dá)狀態(tài)。結(jié)果顯示，AQP1基因兩個SNPs在7個被檢測的牛組織中均為雙峰(圖1C)，表明AQP1基因在被檢測的組織中為雙等位基因表達(dá)。

2.3 AQP1基因在牛胎盤中的等位基因表達(dá)分析

2.3.1 牛胎盤中AQP1基因的SNP檢測 以15頭牛胎盤的基因組DNA為模板，用2.2.1相同引物擴增AQP1基因片段，得到1 615 bp的DNA片段，產(chǎn)物直接回收測序，分析測序峰圖發(fā)現(xiàn)1個雜合SNP(rs380460668)位點(圖2B)，位于擴增產(chǎn)物680 bp(T/C)處。存在雜合SNP的胎盤稱為雜合子，鑒定出的雜合子與純合子比例為1∶4。鑒定的3個雜合子牛胎盤用于AQP1基因在牛胎盤中的表達(dá)分析。

2.3.2AQP1基因在牛胎盤中的等位基因表達(dá)分析 對比雜合子牛胎盤在DNA水平和轉(zhuǎn)錄水平的SNP位點處測序峰圖，確定AQP1基因在牛胎盤中的表達(dá)狀態(tài)。結(jié)果顯示，AQP1基因1個SNP在牛胎盤中SNP位點為單峰(C/T)，即AQP1基因在牛胎盤中為單等位基因表達(dá)。同時檢測雜合子胎盤對應(yīng)的親本基因型，結(jié)果顯示，表達(dá)為C的雜合子胎盤對應(yīng)的父本為T純合，母本為C純合；表達(dá)為T的雜合子胎盤對應(yīng)的父本為C純合，母本為T純合(圖2B)。因此確定，牛AQP1基因在胎盤中為母源等位基因表達(dá)。

2.4 AQP1等位基因特異的甲基化狀態(tài)分析

通過利用亞硫酸氫鹽測序法分析AQP1基因位于啟動子和第一個外顯子區(qū)的CpG島在牛精子、胎盤、心臟和肝臟組織中的DNA甲基化狀態(tài)，來確定DNA甲基化在AQP1基因印記表達(dá)中可能的作用。將雜合子牛組織 DNA(6號牛的心臟和肝臟DNA)、雜合子胎盤DNA(1、2號胎盤DNA)及對應(yīng)精子DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理后作為甲基化模板，使用巢式PCR引物M-1F和M-1R (表1)擴增582 bp片段，擴增產(chǎn)物直接測序，發(fā)現(xiàn)1個雜合位點A/G(rs479118658)，該位點用于區(qū)分等位基因的兩條鏈(A鏈和G鏈)。用引物M-2F和M-2R擴增包含上述雜合位點的471 bp區(qū)域，包括15個CpG位點(圖3A)。將擴增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序。克隆測序結(jié)果顯示，在雙等位基因表達(dá)的雜合子牛心臟、肝臟組織中，兩條親本鏈(A鏈和G鏈)均呈現(xiàn)重甲基化狀態(tài)；以2個單等位基因表達(dá)的雜合子牛胎盤為例，在單等位基因表達(dá)的雜合子牛胎盤中，兩條親本鏈(A鏈和G鏈)呈現(xiàn)出甲基化差異，A鏈為輕甲基化狀態(tài)，G鏈為重甲基化狀態(tài)；同時對應(yīng)的父源等位基因(G鏈)精子中為重甲基化狀態(tài)(圖3B)。以上研究結(jié)果說明，DNA甲基化修飾參與調(diào)控牛AQP1基因的胎盤印記表達(dá)。

3 討 論

目前，在人(Homosapiens)和小鼠中被鑒定的印記基因有150多個[14]，而與人和小鼠相比，已在牛中被鑒定的印記基因數(shù)目較少。水通道蛋白(AQPs)是一種小的膜蛋白家族，對水和小的中性溶質(zhì)在多種生物膜中的跨膜運輸起促進(jìn)作用[15]。其中,Aqp1基因編碼的AQP1蛋白是該家族中第一個被發(fā)現(xiàn)的成員[12,16]，是目前該家族中被主要研究的成員。AQP1是人體紅細(xì)胞的主要水分通道，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的水滲透性[17]，并協(xié)助氣體通過紅細(xì)胞膜運輸[18-19]。本研究應(yīng)用RT-PCR方法分析AQP1基因在牛不同組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AQP1基因在牛的心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪組織中廣泛表達(dá)。而Aqp1基因在小鼠的肺[20]、腎[21]、回腸[22]、微血管和心的內(nèi)皮細(xì)胞[23]中也均有表達(dá)。說明AQP1/Aqp1基因在不同組織的發(fā)育中有非常重要的作用。

A. AQP1在牛被檢測組織中的表達(dá)：1～7.心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪；M.DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000：2 000、1 000、 750、500、250、100 bp)；RT-．陰性對照。B.牛AQP1基因SNPs的鑒定，箭頭位置為SNPs位置。C.雜合子牛心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪的RT-PCR測序峰圖，箭頭位置為SNPs位置A.The expression levels of AQP1 in different tissues of cattle：1-7.RT-PCR products obtained from heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle and fat；M. DNA marker(DL2000：2 000，1 000，750，500，250，100 bp)；RT-. Negative control. B. Identification of SNPs in bovine AQP1 genes, the arrows point the position of SNPs. C. Sequence chromatograms of RT-PCR products obtained from 7 tissues of heterozygous cattle, including heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle and fat, the arrows point the position of SNPs圖1 牛AQP1基因在不同組織中的表達(dá)及印記狀態(tài)Fig.1 Expression and imprinting status of AQP1 gene in different tissues of cattle

A.AQP1在牛胎盤中的表達(dá)：1～3.胎盤1、2、3; M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000：2 000、1 000、750、500、250、100 bp)；RT-．陰性對照。B. 牛胎盤基因組中AQP1基因SNPs的鑒定，及通過SNP位點對3個雜合子胎盤的gDNA、cDNA及父母源基因型進(jìn)行對比，結(jié)果顯示，AQP1基因為母源表達(dá)父源印記A.The expression levels of AQP1 in placenta of cattle: 1-3.RT-PCR products obtained from different placentas; M. DNA marker(DL2000：2 000，1 000，750，500，250，100 bp)；RT-. Negative control. B. Identification of AQP1 gene SNPs in cattle placenta genome, and comparison of gDNA, cDNA and parental genotypes of 3 heterozygous placentas through SNP sites, results showed that AQP1 gene was the expression of maternal paternal imprinting圖2 牛AQP1基因在胎盤中的表達(dá)及印記狀態(tài)Fig.2 Expression and imprinting status of AQP1 gene in different placentas of cattle

胎盤對哺乳動物的發(fā)育至關(guān)重要，它參與了母體和胎兒之間氣體、營養(yǎng)和廢物的交換[24]。許多印記基因在胎盤中表達(dá)，在胎盤中它們合成控制細(xì)胞周期、細(xì)胞信號和血管化以及營養(yǎng)物質(zhì)攝取、利用和儲存的蛋白質(zhì)[25]，調(diào)控胚胎和胎盤的生長發(fā)育[26]。例如，Grb10調(diào)控胚胎和胎盤的重量[14]，Phlda2抑制胎盤滋養(yǎng)層的發(fā)展，調(diào)節(jié)胎盤的營養(yǎng)需求[27]。胎盤印記基因的表達(dá)也可能作為未來反映健康狀況的生物標(biāo)志物，如嬰兒神經(jīng)發(fā)育和4歲時的骨骼健康[28-29]。母源等位基因表達(dá)的缺失會促進(jìn)母體營養(yǎng)物質(zhì)向胚胎的轉(zhuǎn)移，從而抑制胎盤的生長，而父源等位基因表達(dá)的缺失則會促進(jìn)胎盤生長發(fā)育[30-32]。在小鼠中，Aqp1基因被鑒定為母源等位基因表達(dá)、胎盤特異性的印記基因[6]。在Aqp1基因敲除的小鼠中，胚胎和胎盤都過度生長，說明Aqp1基因在胎盤發(fā)育中起抑制作用[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，牛的AQP1基因在心臟等組織中為雙等位基因表達(dá)，而在胎盤中呈現(xiàn)為母源等位基因表達(dá)，這與Aqp1在小鼠為胎盤特異性印記的結(jié)果一致，說明AQP1基因在胎盤的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

A. 牛AQP1基因的基因結(jié)構(gòu)及啟動子和第一個外顯子區(qū)CpG位點位置。CpG島橫跨第1個外顯子并包含15個CpG位點；箭頭為轉(zhuǎn)錄方向，黑方框為外顯子，黑點為CpG位點。B. CpG島甲基化分析。胎盤在CpG島發(fā)現(xiàn)甲基化差異區(qū)，組織在CpG島未發(fā)現(xiàn)甲基化差異區(qū)，且精子為重甲基化；白圈為非甲基化狀態(tài)，黑圈為甲基化狀態(tài)A. Gene structure and CpG location of bovine AQP1.The CpG island spans exon 1 and contains 15 CpG sites; The arrow is the direction of transcription, the black boxes are exons, the black spots are CpG sites. B. Methylation analysis of CpG islands. The CpG islands from placenta show differentially methylated region; The tissues show no differentially methylated region, and hyper-methylation status in sperm. The white circle is the non-methylated status, the black circle is the methy-lation status圖3 AQP1基因結(jié)構(gòu)及啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)Fig.3 AQP1 gene structure and methylation status of CpG islands in its promoter in bovine

DNA甲基化是哺乳動物基因組DNA上的一種主要的表觀遺傳修飾，其主要發(fā)生在富含有CpG二核苷酸的區(qū)域，亦稱為CpG島[33]。通常發(fā)生在基因啟動子和第一個外顯子區(qū)域的甲基化，通過直接抑制轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，或通過與甲基化-CpG結(jié)合蛋白(methyl-CpG binding Proteins)相結(jié)合形成異染色質(zhì)，從而抑制基因的表達(dá)[34-35]。在小鼠中，Aqp1基因啟動子區(qū)的甲基化調(diào)控其在不同組織中的表達(dá)[6]。此外，位于基因啟動子區(qū)的差異甲基化區(qū)(DMR)還是調(diào)控基因組印記的一種主要方式。例如，在牛的印記基因ZNF597[36]和AXL[37]的啟動子區(qū)均發(fā)現(xiàn)了甲基化差異區(qū)。本研究發(fā)現(xiàn)，在AQP1印記表達(dá)的胎盤中AQP1基因的啟動子和第一個 外顯子區(qū)域存在DMR，而在AQP1雙等位基因表達(dá)的心臟、肝臟組織中缺少此DMR，說明DNA甲基化參與調(diào)控AQP1基因的胎盤特異性印記表達(dá)。

4 結(jié) 論

AQP1基因在牛中為胎盤特異性單等位基因表達(dá)的父源印記基因，胎盤中位于AQP1基因啟動子和第一個外顯子區(qū)CpG島的DMR調(diào)控該基因的父源印記表達(dá)。AQP1基因在牛中被檢測的7個組織中為雙等位基因表達(dá)。本研究關(guān)于牛AQP1基因印記狀態(tài)和CpG島甲基化狀態(tài)的試驗結(jié)果，可為深入探討牛AQP1基因功能和印記相關(guān)的分子機理提供參考依據(jù)。