李沫宓 淑芳 王孝信（北華大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林132011）

宮頸癌是全球最常見的女性惡性腫瘤之一，五年生存率較低［1］，嚴重威脅著女性健康。因而，尋找宮頸癌治療和預后的新方法對提高宮頸癌的診治水平具有重大意義。結腸癌相關轉錄因子1（colon cancer associated transcript-1，CCAT1）一種長鏈非編碼RNA（lncRNA），在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中占有重要地位，可參與調控細胞周期、增殖、侵襲與轉移等生物學功能。已有研究顯示，lncRNA-CCAT1在宮頸癌組織中高表達，與患者腫瘤分期、腫瘤大小及預后相關，并且CCAT1可以促進宮頸癌HeLa和CaSki細胞增殖、侵襲和轉移，并抑制其凋亡［2-3］。眾所周知，自噬是腫瘤進展中的一個重要過程，然而CCAT1是否對宮頸癌自噬有調控作用目前尚不清楚。多項研究顯示，CCAT1能夠激活PI3K/Akt信號通路，而PI3K/Akt信號通路可進一步激活mTOR并抑制自噬的形成［4-6］。故推測CCAT1過表達可能通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制宮頸癌細胞自噬。因此，本研究擬通過向宮頸癌HeLa細胞中轉染CCAT1過 表達質粒（pcDNA3.1-CCAT1），探討CCAT1過表達對宮頸癌HeLa細胞自噬的影響，并初步闡明其機制。

1 材料與方法

1.1 材料人宮頸癌HeLa細胞株購自上海中科院細胞庫；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；CCAT1過表達質粒pcDNA3.1-CCAT1及其空載對照組質粒pcDNA3.1-vector均由漢恒生物科技（上海）有限公司構建；PI3K特異性抑制劑LY294002購 自 美 國MedChemExpress公 司；Lipo?fectamineTM2000轉染試劑、TRIzol RNA分離試劑均購自美國Thermo Fisher公司；CCK8檢測試劑盒、單丹磺酰戊二酸（MDC）染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；Beclin1抗體、p62抗體、LC3抗體、p-PI3K抗體、PI3K抗體、p-Akt抗體、Akt抗體、p-mTOR抗體、mTOR抗體和GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；倒置顯微鏡購自日本Nikon公司；PCR擴增儀購自美國Thermo公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉染用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細胞，細胞復蘇后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2~3 d傳代1次。取對數(shù)期生長的HeLa細胞，用胰酶消化制備單細胞懸液，以2×105個/孔的細胞接種量將細胞接種于6孔板中，根據(jù)實驗需求將細胞分為空白對照組（Blank，不做任何處理）、空載對照組（Vector，轉染pcDNA3.1-vector質粒）和CCAT1過表達組（pcD?NA3.1-CCAT1，轉染pcDNA3.1-CCAT1質粒）。待細胞融合度達到約85%時，按照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書，將pcDNA3.1-vector質粒和pcD?NA3.1-CCAT1質粒分別轉染至HeLa細胞中，轉染48 h后，采用qRT-PCR檢測細胞中CCAT1表達水平以驗證轉染效果。

1.2.2 qRT-PCR檢測細胞中CCAT1表達水平收集各組轉染后的HeLa細胞，采用TRIzol法提取各樣本的總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度。取3μg總RNA，采用逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增。引物序列：CCAT1 For?ward 5'-TTTATGCTTGAGCCTTGA-3'，Reverse 5'-CTTGCCTGAAATACTTGC-3'；GAPDH Forward 5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'，Reverse 5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。反應條件為95℃預變性60 s，92℃變性30 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min，共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算CCAT1相對表達量。

1.2.3 CCK8檢測細胞增殖活性取對數(shù)期各組轉染后的HeLa細胞，以4×103個/孔的細胞接種量重新接種于96孔板，每組設置4個復孔，分別培養(yǎng)12 h、24 h和48 h后，每孔加入20 μl CCK8溶液，37℃繼續(xù)孵育4 h，采用酶標儀測定各組在490 nm處的吸光度值（OD），取均值表示各組細胞增殖活性。1.2.4 MDC染色取對數(shù)期各組轉染后的HeLa細胞，以1×105個/孔的細胞接種量接種于內置有無菌玻片的6孔板中，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，1×PBS洗滌3次，加入0.05 mmol/L MDC染色液覆蓋皿底，37℃避光染色15 min，1×PBS洗滌3次，取出玻片置于載玻片上，熒光顯微鏡下拍照觀察，其中激發(fā)濾光片波長355 nm，阻斷濾光片波長512 nm，以細胞內出現(xiàn)點狀染色為陽性表現(xiàn)。

1.2.5 Western blot檢測細胞中相關蛋白表達水平收集各組轉染后HeLa細胞，加入適量RIPA裂解液于冰上裂解，4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取25 μg蛋白經(jīng)沸水浴變性后，用10% SDS-PAGE分離蛋白并將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入一抗Beclin1（1∶1 000）、p62（1∶1 000）、LC3（1∶2 000）、p-PI3K（1∶500）、PI3K（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、Akt（1∶2 000）、p-mTOR（1∶500）、mTOR（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000），4℃孵育膜過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔或小鼠二抗于室溫封閉1 h，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，化學發(fā)光儀采集圖像，Image J軟件分析條帶灰度值，目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.2.6 PI3K特異性抑制劑LY294002處理細胞取對數(shù)生長期的HeLa細胞接種于6孔板，每孔2×105個細胞，根據(jù)實驗需求將細胞分空白對照組（Blank，不做任何處理）、CCAT1過表達組（pcD?NA3.1-CCAT1，轉 染pcDNA3.1-CCAT1質 粒）、LY294002組（LY294002，采用10 mmol/L LY294002處理24 h）和聯(lián)合處理組（pcDNA3.1-CCAT1+LY294002，在CCAT1過表達組的基礎上再經(jīng)10 mmol/L LY294002處理24 h），處理結束后收集各組細胞，采用上述Western blot法檢測自噬和PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CCAT1過表達對HeLa細胞中CCAT1表達水平的影響RT-PCR實驗結果（圖1）顯示，與Blank和Vector組比較，pcDNA3.1-CCAT1組細胞中CCAT1表達水平顯著升高（P<0.05），提示pcD?NA3.1-CCAT1轉染成功。

圖1 HeLa細胞中CCAT1表達水平比較Fig.1 Expression level of CCAT1 in HeLa cells

2.2 CCAT1過表達對HeLa細胞增殖活性的影響

CCK8實驗結果顯示，與Blank和Vector組比較，pcD?NA3.1-CCAT1組細胞在培養(yǎng)24 h和48 h時其增殖活性顯著增強（P<0.05），如圖2所示。

圖2 CCAT1過表達對HeLa細胞增殖活性的影響Fig.2 Effect of CCAT1 overexpression on proliferation activity of HeLa cells

2.3 CCAT1過表達對HeLa細胞自噬的影響

MDC染色結果顯示，與Blank和Vector組比較，pcD?NA3.1-CCAT1組細胞內紫色點狀熒光亮度明顯減弱，如圖3所示。Western blot檢測結果顯示，與Blank和Vector組比較，pcDNA3.1-CCAT1組細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin1蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），而p62蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），如圖4所示。

圖3 MDC染色（×400）Fig.3 MDC staining（×400）

圖4 CCAT1過表達對HeLa細胞自噬相關蛋白表達的影響Fig.4 Effects of CCAT1 overexpression on expression of autophagy-related proteins in HeLa cells

2.4 CCAT1過表達對HeLa細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響Western blot實驗結果顯示，與Blank和Vector組比較，pcDNA3.1-CCAT1組細胞中p-PI3K、p-Akt和p-mTOR等水平顯著升高（P<0.05，圖5），而PI3K、Akt和mTOR蛋白表達水平無顯著性變化（P>0.05）。

圖5 CCAT1過表達對HeLa細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達的影響Fig.5 Effects of CCAT1 overexpression on expression of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway proteins in HeLa cells

2.5 聯(lián)合干預對HeLa細胞自噬相關蛋白表達的影響Western blot實驗結果（圖6）顯示，與Blank組比較，pcDNA3.1-CCAT1組細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin1蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），p62蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），而LY294002組細胞

圖6 LY294002對HeLa細胞自噬相關蛋白表達的影響Fig.6 Effects of LY294002 on expression of autophagy-re?lated proteins in HeLa cells

中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin1蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），p62蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）；與pcDNA3.1-CCAT1組比較，pcDNA3.1-CCAT1+LY294002細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin1蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），p62蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。

2.6 聯(lián)合干預對HeLa細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響Western blot實驗結果（圖7）顯示，與Blank組 比較，pcDNA3.1-CCAT1組細 胞中p-Akt和p-mTOR蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），LY294002組細胞中p-Akt和p-mTOR蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）；與pcDNA3.1-CCAT1組比較，pcDNA3.1-CCAT1+LY294002細胞中p-Akt和p-mTOR蛋白表達水平顯著減少（P<0.05）。

圖7 LY294002對HeLa細胞p-Akt和p-mTOR蛋白表達的影響Fig.7 Effects of LY294002 on p-Akt and p-mTOR pro?tein expression in HeLa cells

3 討論

越來越多的研究表明，lncRNAs在包括宮頸癌在內的各種腫瘤生物學進程中起關鍵作用［7］。ZHANG等［8］發(fā)現(xiàn)，CCAT1在宮頸癌細胞中高表達并促進癌細胞增殖，抑制凋亡；同時也有研究表明，沉默CCAT1能抑制宮頸癌HeLa細胞增殖和遷移，最終誘導癌細胞凋亡［9］。自噬是在應激條件下參與細胞穩(wěn)態(tài)的一種分解代謝過程，可影響腫瘤的形成、轉移、增殖、能量代謝以及誘導腫瘤細胞存活與死亡等多個方面，通過藥物或其他途徑使腫瘤細胞過度自噬，并誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬依賴性死亡，正在成為腫瘤治療的新策略［10］。眾多研究顯示，CCAT1可以通過激活PI3K/Akt信號通路抑制細胞自噬［4-6］。但也有研究顯示，CCAT1過表達可促進肝癌細胞自噬，這可能是由于腫瘤的異質性所致［11］。本研究結果顯示，過表達CCAT1能夠通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制宮頸癌HeLa細胞自噬。

自噬的發(fā)生與發(fā)展需要很多基因和蛋白質參與，多種自噬相關蛋白的表達水平和自噬相關信號的通路活性正在越來越多地被用于宮頸癌的病程和預后分析。Beclin1、LC3和p62都是檢測自噬活性的標志性蛋白。當自噬發(fā)生時，Beclin1會通過調控其他自噬蛋白定位到前自噬小體膜上來控制自噬小體的形成［12］。細胞自噬過程中，細胞內的LC3-Ⅰ被加工轉化為LC3-Ⅱ，并聚集在自噬體膜上，隨著自噬過程中自噬體的形成增多，LC3-Ⅰ型蛋白向LC3-Ⅱ型蛋白轉換增加，因此可以通過檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ來衡量細胞的自噬活性，而自噬底物蛋白p62參與自噬體的降解過程，其表達量增加可抑制細胞自噬［13-14］。GUO等［11］研究顯示，CCAT1誘導肝癌HCC細胞自噬的同時上調細胞內LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，并抑制p62的表達；SU等［4］對足突細胞的研究結果顯示，CCAT1過表達可以通過抑制細胞自噬減少細胞凋亡，并伴隨著細胞內p62蛋白表達水平上調以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低。為了研究CCAT1在宮頸癌細胞中是否具有作用，本實驗首先采CCAT1過表達質粒（pcDNA3.1-CCAT1）轉染HeLa細胞，發(fā)現(xiàn)HeLa細胞增殖能力顯著上調，MDC染色實驗結果顯示，轉染組細胞內自噬囊泡聚集較對照組和陰性轉染組明顯減少。同時，Western blot實驗結果顯示，CCAT1過表達可以降低HeLa細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ以及下調Beclin1蛋白表達水平，并促進p62蛋白表達，進一步證實過表達CCAT1可以抑制HeLa細胞自噬活性。

自噬受多條信號通路調控，其中PI3K/Akt/mTOR信號通路是研究最為廣泛的信號通路之一，其核心蛋白mTOR的活化是決定自噬體形成和成熟的關鍵蛋白。有研究報道，PI3K/Akt信號通路激活后，會進一步激活下游mTOR的功能，從而發(fā)揮細胞自噬的抑制作用［15-18］。為了進一步探討過表達CCAT1抑制HeLa細胞自噬的可能分子機制，本文研究了過表達CCAT1對p-Akt、Akt、p-PI3K、PI3K、p-mTOR和mTOR表達的影響，并觀察PI3K特異性抑制劑LY294002對HeLa細胞自噬的影響。結果顯示，CCAT1過表達可以促進HeLa細胞中p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達，而采用LY294002干預會抑制相關通路蛋白的表達，但pcDNA3.1-CCAT1和LY294002聯(lián)合干預可以逆轉LY294002對相關蛋白的抑制作用，表明過表達CCAT1可以通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路的磷酸化抑制HeLa細胞的自噬。

綜上所述，本文初步探究了CCAT1對宮頸癌HeLa細胞自噬的影響，發(fā)現(xiàn)CCAT1對宮頸癌Hela細胞的作用機制與PI3K/Akt/mTOR信號通路激活有關，該研究有望為以自噬為靶標的宮頸癌生物治療研究和藥物研發(fā)奠定基礎。