吳建剛 陳玉梅 陳美元 沈燕 黃麗珍（蘇州市第九人民醫(yī)院兒科，蘇州215200）

哮喘是一種以喘息、咳嗽、胸悶為主的慢性氣道炎癥，哮喘發(fā)病率高，特別是兒童患者發(fā)病率逐年上升。研究表明，國(guó)內(nèi)每十年哮喘患兒的發(fā)病率升高20%~50%，這消耗了巨大的醫(yī)療資源，嚴(yán)重影響了患兒的身心健康［1］。過(guò)去一直認(rèn)為過(guò)敏是導(dǎo)致哮喘的主要因素；近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，病毒可能是引起兒童哮喘急性發(fā)作的重要病原體，包括呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）、鼻病毒（rhinovirus，RV）、腺病毒（adenovirus，ADV）、流感病毒（influenza，IF）、副流感病毒（parainfluenza vi?rus，HPIV）、腸病毒（enterovirus，EV）、人偏肺病毒（human meta lung virus，hMPV）、博卡病毒（Boka vi?rus，BOCA）等［2］，但目前關(guān)于哮喘兒童呼吸道相關(guān)病毒感染特征的研究還較少?；純涸诟腥静《竞?，機(jī)體產(chǎn)生T細(xì)胞活化觸發(fā)相關(guān)免疫反應(yīng)，T細(xì)胞活化后被分化成Th1和Th2細(xì)胞，分別分泌對(duì)應(yīng)的Th1型細(xì)胞因子和Th2型細(xì)胞因子，分別促進(jìn)Th1型免疫反應(yīng)和Th2型免疫反應(yīng)。目前臨床已有研究證實(shí)，哮喘急性發(fā)作及其進(jìn)程與其體內(nèi)Th1/Th2型免疫失衡密切相關(guān)［3］。干擾素是一種光譜抗病毒制劑，可以通過(guò)作用于細(xì)胞表面受體產(chǎn)生抗病毒蛋白發(fā)揮抗病毒作用。本研究擬分析哮喘兒童病毒感染的特征，并探討其在經(jīng)過(guò)干擾素治療后體內(nèi)的Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡的變化及其相關(guān)性，以期為臨床治療提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料本研究為前瞻性研究，選擇2017年1月至2020年1月在我院就診的220例哮喘患兒和同期的100例健康兒童為研究對(duì)象。對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行病原體檢查，并進(jìn)一步納入其中的病毒性哮喘患兒進(jìn)行干擾素治療。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)①年齡<14歲；②臨床癥狀主要為突然發(fā)生喘息、氣促、咳嗽、胸悶等，符合支氣管哮喘相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］；③急性發(fā)作期；④發(fā)病時(shí)間72 h內(nèi)；⑤獲得患兒監(jiān)護(hù)人知情同意書(shū)。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)①排除肝腎功能不全者；②哮喘慢性持續(xù)期及臨床緩解期；③合并其他先天性肺部疾病以及氣道畸形等呼吸系統(tǒng)疾?。虎芫驮\前2周內(nèi)使用過(guò)免疫制劑者。

1.1.4 藥品與試劑布地奈德混懸液（普米克令舒，批準(zhǔn)文號(hào)：H20140475，2 ml）；異丙托溴銨溶液（愛(ài)全樂(lè)，批準(zhǔn)文號(hào)：H20150159，500 μg∶2 ml）；重組人干擾素α-2b注射液（北京凱因科技股份有限公司提供，批準(zhǔn)文號(hào)201601018，3 mU/0.3 ml）；RTPCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江萊生物；Th1、Th2檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；流式細(xì)胞儀（賽默飛Attune NxT流式細(xì)胞儀）；ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及治療納入病毒檢測(cè)為陽(yáng)性的患兒進(jìn)一步研究，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和觀察組，其余患兒進(jìn)行常規(guī)對(duì)癥處理。病毒感染患兒首先進(jìn)行止咳、平喘、祛痰常規(guī)治療，對(duì)照組進(jìn)行布地奈德混懸液、異丙托溴銨溶液霧化治療，觀察組在此基礎(chǔ)上增加1.2 ml重組人干擾素α-2b注射液霧化治療，2次/d，連續(xù)治療7 d，觀察不良反應(yīng)。分別于就診當(dāng)日和治療7 d后采用肺功能儀檢測(cè)患兒肺功能，包括第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in first second，F(xiàn)EV1）、呼氣流量峰值（peak expiratory flow，PEF）及用力肺活量（forced vital ca?pacity，F(xiàn)VC）。

1.2.2 觀察指標(biāo)

1.2.2.1 病毒檢測(cè)采集所有受試者的鼻咽拭子，使用2 ml樣本保存液斡旋離心后取上清進(jìn)行病毒檢測(cè)。病毒檢測(cè)操作采用熒光定量RT-PCR，檢測(cè)的病毒包RSV、RV、ADV、IF、HPIV、EV、hMPV、Boka virus、BOCA等，所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，結(jié)果根據(jù)熒光信號(hào)曲線進(jìn)行判定，以Ct值>40為陰性，≤40為陽(yáng)性。

1.2.2.2 肺功能指標(biāo)檢測(cè)分別于就診當(dāng)日和治療7 d后采用肺功能儀檢測(cè)患兒肺功能，包括FEV1、PEF及FVC。

1.2.2.3 炎癥因子檢測(cè)分別于就診當(dāng)日和治療7 d后采集外周靜脈血3 ml兩份其中一份置于抗凝管中，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1、Th2水平；另一份3 000 r/min離心取上清，檢測(cè)Th1、Th2型細(xì)胞因子的水平，具體如下：①Th1、Th2檢測(cè)：樣本于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4~6 h，分別加入10 μl CD4-PC7和CD3-PC5，室溫避光孵育15 min，加入3 ml緩沖液，混勻，離心，留下層沉淀，加入100μl破膜劑，分別加入10 μl IFN-γ-FITC熒光抗體和IL-4-PE單克隆抗體，室溫避光孵育15 min，緩沖液重懸后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，獲得只分泌IFN-γ和IL-4的CD4+細(xì)胞，分別代表Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞，并計(jì)算其比值。②Th1、Th2型細(xì)胞因子檢測(cè)：采用ELISA法檢測(cè)外周血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6水平，所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料的采用±s表示，多組比較采用F檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘患兒病毒感染特征220例患兒中有164例病毒陽(yáng)性，陽(yáng)性率74.55%。其中RSV（82/220，37.27%）、RV（65/220，29.55%）、ADV（19/220，8.64%）、IF（27/220，12.27%）、HPIV（30/220，13.64%）、EV（38/220，17.27%）、hMPV（10/220，4.55%）、Boka virus（12/220，5.45%）、BOCA（8/220，3.64%）。其中122例為單一病毒感染，42例為混合感染。其中不同季節(jié)的病毒陽(yáng)性率為：春季38/54（70.37%）、夏 季17/30（56.67%）、秋 季33/48（68.75%）、冬季76/88（86.36%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.881，P=0.004），冬季陽(yáng)性率顯著高于其他3個(gè)季節(jié)。

220例患兒根據(jù)病情嚴(yán)重程度分為輕度（96例）、中度（80例）、重度（44例）3個(gè)亞組，比較3個(gè)亞組病毒感染情況，單個(gè)病毒感染上3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但中度組和重度組病毒總陽(yáng)性率顯著高于輕度組（P<0.05），詳見(jiàn)表1。

表1 輕、中、重組哮喘患兒病毒感染情況［例（%）］Tab.1 Viral infection in children with mild，moderate and severe asthma［n（%）］

2.2 肺功能比較健康組兒童男52例，女48例，年齡3~12歲，平均（6.72±1.16）歲。164例病毒陽(yáng)性患兒隨機(jī)分為對(duì)照組（82例）和觀察組（82例）；其中對(duì)照組患兒男45例，女37例，年齡3~12歲，平均（7.10±1.24）歲，輕度17例，中度28例，重度37例；觀察組男48例，女34例，年齡3~12歲，平均（7.23±1.05）歲，輕度14例，中度22例，重度46例。3組性別和年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），對(duì)照組和觀察組病情嚴(yán)重程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。對(duì)照組、觀察組FEV1%、PEF%、FVC%治療前無(wú)顯著差異（P>0.05），但顯著低于健康組（P<0.05）；治療后，對(duì)照組和觀察組FEV1%、PEF%、FVC%顯著升高（P<0.05），組間比較，觀察組和健康組無(wú)顯著差異（P>0.05），但觀察組顯著高于對(duì)照組（P<0.05），詳見(jiàn)表2。

表2 治療前后肺功能指標(biāo)比較（±s）Tab.2 Comparison of pulmonary function indexes before and after treatment（±s）

表2 治療前后肺功能指標(biāo)比較（±s）Tab.2 Comparison of pulmonary function indexes before and after treatment（±s）

Note：Compared with Healthy group，1）P<0.05；compared with before treatment，2）P<0.05；compared with control group after treatment，3）P<0.05.

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2.3 Th細(xì)胞比較對(duì)照組、觀察組Th1%、Th2%、Th1/Th2治療前無(wú)顯著差異（P>0.05），但Th1%、Th1/Th2顯著低于健康組（P<0.05），Th2%顯著高于健康組（P<0.05）；治療后，對(duì)照組和觀察組Th1%、Th1/Th2顯著 升 高、Th2%顯著 下 降（P<0.05），組間比較，觀察組和健康組無(wú)顯著差異（P>0.05），但觀察組Th1%、Th1/Th2顯著高于對(duì)照組（P<0.05），Th2%顯著低于對(duì)照組（P<0.05），詳見(jiàn)表3。2.4 Th細(xì)胞因子比較對(duì)照組、觀察組IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6治療前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但

表3 治療前后Th1、Th2細(xì)胞比較（±s）Tab.3 Comparison of Th1 and Th2 cells before and after treatment（±s）

表3 治療前后Th1、Th2細(xì)胞比較（±s）Tab.3 Comparison of Th1 and Th2 cells before and after treatment（±s）

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Note：Compared with Healthy group，1）P<0.05；compared with before treatment，2）P<0.05；compared with control group after treatment，3）P<0.05.

IL-2、IFN-γ顯著低于健康組，IL-4、IL-6顯著高于健康組（P<0.05）；治療后，對(duì)照組和觀察組IL-2、IFN-γ顯著升高，IL-4、IL-6顯著下降（P<0.05），組間比較，觀察組和健康組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但觀察組IL-2、IFN-γ顯著高于對(duì)照組（P<0.05），IL-4、IL-6顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；詳見(jiàn)表4。

表4 治療前后IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6比較（±s）Tab.4 Comparison of IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-6 before and after treatment（±s）

表4 治療前后IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6比較（±s）Tab.4 Comparison of IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-6 before and after treatment（±s）

Note：Compared with Healthy group，1）P<0.05；compared with before treatment，2）P<0.05；compared with control group after treatment，3）P<0.05.

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2.5 肺功能與Th1/Th2的相關(guān)性研究將164例患兒治療前后的FEV1%、PEF%、FVC%與治療前后的Th1、Th2、Th1/Th2納入Pearson相關(guān)性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FEV1%與Th1呈正相關(guān)（P<0.05）、與Th2呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），F(xiàn)EV1%、PEF%、FVC%與Th1/Th2均呈正相關(guān)（P<0.05）；詳見(jiàn)表5。

表5 FEV1%、PEF%、FVC%與Th1、Th2、Th1/Th2的相關(guān)性Tab.5 Correlation between FEV1%，PEF%，F(xiàn)VC% and Th1，Th2，Th1/Th2

2.6 不良反應(yīng)治療期間，未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)。

3 討論

哮喘是一種氣道慢性炎癥，臨床癥狀以反復(fù)喘息、氣促、胸悶和咳嗽為主。一項(xiàng)收集2015年1月至2019年3月的484 719例兒童Meta分析表明，中國(guó)兒童哮喘平均患病率為4.90%，進(jìn)一步亞組分析表明發(fā)病率逐年升高，由3.8%上升6.5%［5］。哮喘嚴(yán)重影響兒童的生長(zhǎng)發(fā)育健康，帶來(lái)了巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。近年來(lái)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染可能是導(dǎo)致哮喘發(fā)病的主要原因之一。患兒支氣管壁在感染病毒后，發(fā)生炎性改變，形成炎癥浸潤(rùn)，氣道表現(xiàn)出高反應(yīng)性，即支氣管壁黏膜發(fā)生水腫，分泌物不斷增加，逐漸導(dǎo)致氣管痙攣、氣流受限，表現(xiàn)出咳嗽、喘息等臨床癥狀［6］。與此同時(shí)，體內(nèi)的免疫系統(tǒng)啟動(dòng)，氣管內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞升高，釋放炎癥因子和過(guò)敏介質(zhì)，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，殺滅病原菌的同時(shí)也會(huì)損傷氣管組織，加劇氣道高反應(yīng)性和喘息癥狀［7］。

病毒作為可能是誘發(fā)哮喘急性發(fā)作的重要原因，但具有一定的地域性差異。能誘導(dǎo)急性哮喘的病毒種類眾多，本研究對(duì)在我院就診的220例哮喘患兒進(jìn)行病毒篩查檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)74.54%伴有單一或多重病毒感染，其中以RSV和RV的感染率最高，分別為37.27%、29.55%，RSV和RV是被報(bào)道的最常見(jiàn)單位兩種導(dǎo)致呼吸道疾病的病毒［8］。王婷等［9］對(duì)喘息發(fā)作期哮喘嬰幼兒的病毒原檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，鼻咽部標(biāo)本病毒陽(yáng)性率為49.6%；盧可斌等［10］對(duì)菏澤115例支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒的調(diào)查發(fā)現(xiàn)病毒感染率為67.83%，說(shuō)明病毒感染在哮喘中不可小覷。分別對(duì)季節(jié)和嚴(yán)重程度進(jìn)行分析以后發(fā)現(xiàn)冬季是病毒感染的高發(fā)季節(jié)，而春夏秋感染率較低，這與病毒本身單鏈RNA不耐熱的特征有關(guān)，提示哮喘病毒感染具有一定的季節(jié)流行性。分析病毒感染與病情的特征發(fā)現(xiàn)，中重度患兒病毒感染率顯著高于輕度患兒，這與孫遜等［11］報(bào)道的RSV和PIV感染與哮喘中重度哮喘急性發(fā)作有關(guān)具有相似性，說(shuō)明病毒感染可能是導(dǎo)致病情加重的原因。這可能與病毒感染會(huì)影響機(jī)體的免疫平衡，加重氣道炎癥相關(guān)。

目前臨床已經(jīng)達(dá)成共識(shí)，認(rèn)為嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子共同參與了哮喘的整個(gè)發(fā)病過(guò)程，但是單純地針對(duì)過(guò)敏機(jī)制以及減輕氣道反應(yīng)癥狀的常規(guī)治療仍然無(wú)法完全控制患兒的病情，特別是伴有病毒感染的重癥患兒。病毒感染與哮喘的病情進(jìn)展的關(guān)系已經(jīng)獲得了臨床大多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可［12］，因此，本研究進(jìn)一步對(duì)病毒感染的患兒進(jìn)行α-干擾素抗病毒治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療1周后觀察組肺功能顯著改善且優(yōu)于對(duì)照組，F(xiàn)EV1%、PEF%、FVC%與健康組兒童比較無(wú)顯著差異，說(shuō)明α-干擾素通過(guò)霧化吸入能顯著改善急性發(fā)作哮喘患兒的臨床癥狀。顧霞等［13］使用IFN-γ治療支氣管哮喘，發(fā)現(xiàn)能提高臨床有效率、改善肺功能。分析認(rèn)為霧化吸入能有效提高病灶局部藥物有效濃度，針對(duì)氣道炎癥進(jìn)行快速干預(yù)，同時(shí)有效減輕全身副作用。α-干擾素是一種能作用于細(xì)胞表面受體的活性蛋白質(zhì)，具有廣譜的抗病毒作用，其機(jī)制主要是通過(guò)與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合產(chǎn)生抗病毒蛋白發(fā)揮抑制蛋白復(fù)制、擴(kuò)增作用，已經(jīng)被應(yīng)用于多種病毒感染的相關(guān)治療［14］。此外，α-干擾素還可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體T淋巴細(xì)胞亞群的平衡來(lái)間接發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用［15］。

目前，已有相關(guān)研究證實(shí)哮喘患兒存在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能紊亂現(xiàn)象，T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是機(jī)體清除病毒感染的重要機(jī)制［16］。T細(xì)胞分為Th1和Th2，Th1主要通過(guò)產(chǎn)生IL-2、IFN-γ來(lái)減輕免疫炎癥、緩解臨床癥狀，Th2主要通過(guò)產(chǎn)生IL-4、IL-6發(fā)揮免疫促進(jìn)、加重炎癥反應(yīng)作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康組比較，治療前兩組患兒的Th1%降低、Th2%升高，Th1/Th2偏低，提示病毒感染的哮喘患兒存在T細(xì)胞免疫向Th2偏移現(xiàn)象。在治療1周后，觀察組Th1/Th2顯著高于對(duì)照組，并接近健康組水平，說(shuō)明α-干擾素干預(yù)能調(diào)節(jié)機(jī)體的Th1、Th2免疫平衡。同時(shí)，我們分別觀察了Th1和Th2分泌的代表性細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)其規(guī)律與Th細(xì)胞類似，治療前，兩組患兒IL-2、IFN-γ顯著低于健康組，IL-4、IL-6顯著高于健康組，治療后觀察組IL-2、IFN-γ顯著升高，IL-4、IL-6顯著下降，且與健康組比較均無(wú)顯著差異，提示α-干擾素治療有利于調(diào)節(jié)Th1和Th2分米的細(xì)胞因子的平衡，這些可能是支持α-干擾素能調(diào)節(jié)哮喘患兒免疫平衡的證據(jù)之一。機(jī)體在感染病毒后，Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IFN-γ，有助于減輕炎癥反應(yīng)，其中IFN-γ又可以進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞分化成Th1細(xì)胞，發(fā)揮免疫炎癥抑制作用，減輕對(duì)氣管壁正常組織的損傷［17］。Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4和IL-6參與嗜酸性粒細(xì)胞的免疫放大炎癥反應(yīng)，這些細(xì)胞因子可以招募更多的炎癥因子，加重放大炎癥反應(yīng)，并抑制Th1型炎癥保護(hù)作用，促進(jìn)T細(xì)胞免疫平衡向Th2偏移［18］。臨床也有相關(guān)報(bào)道認(rèn)為病毒感染的呼吸道病毒中，免疫應(yīng)答方式以Th2為優(yōu)勢(shì)應(yīng)答，并以Th1/Th2的平衡狀態(tài)來(lái)衡量疾病的嚴(yán)重程度［19］。本研究中進(jìn)一步的相關(guān)性分析也有類似發(fā)現(xiàn)：FEV1%與Th1呈正相關(guān)（P<0.05）、與Th2呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），F(xiàn)EV1%、PEF%、FVC%與Th1/Th2比值均呈正相關(guān)（P<0.05），這也進(jìn)一步說(shuō)明哮喘患兒的肺功能與Th1/Th2有密切相關(guān)性，α-干擾素的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用能有利于改善肺功能以及Th1/Th2平衡。

綜上所述，急性哮喘病毒感染率高，采用α-干擾素進(jìn)行抗病毒治療有利于改善患兒肺功能，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡以及其對(duì)應(yīng)的細(xì)胞因子平衡。