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        哮喘患兒呼吸道病毒感染特征及其與α-干擾素治療前后Th1、Th2細(xì)胞因子平衡的相關(guān)性研究

        2021-08-23 05:12:16吳建剛陳玉梅陳美元沈燕黃麗珍蘇州市第九人民醫(yī)院兒科蘇州215200
        中國(guó)免疫學(xué)雜志 2021年15期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)

        吳建剛 陳玉梅 陳美元 沈燕 黃麗珍(蘇州市第九人民醫(yī)院兒科,蘇州215200)

        哮喘是一種以喘息、咳嗽、胸悶為主的慢性氣道炎癥,哮喘發(fā)病率高,特別是兒童患者發(fā)病率逐年上升。研究表明,國(guó)內(nèi)每十年哮喘患兒的發(fā)病率升高20%~50%,這消耗了巨大的醫(yī)療資源,嚴(yán)重影響了患兒的身心健康[1]。過(guò)去一直認(rèn)為過(guò)敏是導(dǎo)致哮喘的主要因素;近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),病毒可能是引起兒童哮喘急性發(fā)作的重要病原體,包括呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、鼻病毒(rhinovirus,RV)、腺病毒(adenovirus,ADV)、流感病毒(influenza,IF)、副流感病毒(parainfluenza vi?rus,HPIV)、腸病毒(enterovirus,EV)、人偏肺病毒(human meta lung virus,hMPV)、博卡病毒(Boka vi?rus,BOCA)等[2],但目前關(guān)于哮喘兒童呼吸道相關(guān)病毒感染特征的研究還較少?;純涸诟腥静《竞?,機(jī)體產(chǎn)生T細(xì)胞活化觸發(fā)相關(guān)免疫反應(yīng),T細(xì)胞活化后被分化成Th1和Th2細(xì)胞,分別分泌對(duì)應(yīng)的Th1型細(xì)胞因子和Th2型細(xì)胞因子,分別促進(jìn)Th1型免疫反應(yīng)和Th2型免疫反應(yīng)。目前臨床已有研究證實(shí),哮喘急性發(fā)作及其進(jìn)程與其體內(nèi)Th1/Th2型免疫失衡密切相關(guān)[3]。干擾素是一種光譜抗病毒制劑,可以通過(guò)作用于細(xì)胞表面受體產(chǎn)生抗病毒蛋白發(fā)揮抗病毒作用。本研究擬分析哮喘兒童病毒感染的特征,并探討其在經(jīng)過(guò)干擾素治療后體內(nèi)的Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡的變化及其相關(guān)性,以期為臨床治療提供理論參考。

        1 資料與方法

        1.1 資料

        1.1.1 一般資料本研究為前瞻性研究,選擇2017年1月至2020年1月在我院就診的220例哮喘患兒和同期的100例健康兒童為研究對(duì)象。對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行病原體檢查,并進(jìn)一步納入其中的病毒性哮喘患兒進(jìn)行干擾素治療。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

        1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)①年齡<14歲;②臨床癥狀主要為突然發(fā)生喘息、氣促、咳嗽、胸悶等,符合支氣管哮喘相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[4];③急性發(fā)作期;④發(fā)病時(shí)間72 h內(nèi);⑤獲得患兒監(jiān)護(hù)人知情同意書(shū)。

        1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)①排除肝腎功能不全者;②哮喘慢性持續(xù)期及臨床緩解期;③合并其他先天性肺部疾病以及氣道畸形等呼吸系統(tǒng)疾?。虎芫驮\前2周內(nèi)使用過(guò)免疫制劑者。

        1.1.4 藥品與試劑布地奈德混懸液(普米克令舒,批準(zhǔn)文號(hào):H20140475,2 ml);異丙托溴銨溶液(愛(ài)全樂(lè),批準(zhǔn)文號(hào):H20150159,500 μg∶2 ml);重組人干擾素α-2b注射液(北京凱因科技股份有限公司提供,批準(zhǔn)文號(hào)201601018,3 mU/0.3 ml);RTPCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江萊生物;Th1、Th2檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司;流式細(xì)胞儀(賽默飛Attune NxT流式細(xì)胞儀);ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 分組及治療納入病毒檢測(cè)為陽(yáng)性的患兒進(jìn)一步研究,根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和觀察組,其余患兒進(jìn)行常規(guī)對(duì)癥處理。病毒感染患兒首先進(jìn)行止咳、平喘、祛痰常規(guī)治療,對(duì)照組進(jìn)行布地奈德混懸液、異丙托溴銨溶液霧化治療,觀察組在此基礎(chǔ)上增加1.2 ml重組人干擾素α-2b注射液霧化治療,2次/d,連續(xù)治療7 d,觀察不良反應(yīng)。分別于就診當(dāng)日和治療7 d后采用肺功能儀檢測(cè)患兒肺功能,包括第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in first second,F(xiàn)EV1)、呼氣流量峰值(peak expiratory flow,PEF)及用力肺活量(forced vital ca?pacity,F(xiàn)VC)。

        1.2.2 觀察指標(biāo)

        1.2.2.1 病毒檢測(cè)采集所有受試者的鼻咽拭子,使用2 ml樣本保存液斡旋離心后取上清進(jìn)行病毒檢測(cè)。病毒檢測(cè)操作采用熒光定量RT-PCR,檢測(cè)的病毒包RSV、RV、ADV、IF、HPIV、EV、hMPV、Boka virus、BOCA等,所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,結(jié)果根據(jù)熒光信號(hào)曲線進(jìn)行判定,以Ct值>40為陰性,≤40為陽(yáng)性。

        1.2.2.2 肺功能指標(biāo)檢測(cè)分別于就診當(dāng)日和治療7 d后采用肺功能儀檢測(cè)患兒肺功能,包括FEV1、PEF及FVC。

        1.2.2.3 炎癥因子檢測(cè)分別于就診當(dāng)日和治療7 d后采集外周靜脈血3 ml兩份其中一份置于抗凝管中,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1、Th2水平;另一份3 000 r/min離心取上清,檢測(cè)Th1、Th2型細(xì)胞因子的水平,具體如下:①Th1、Th2檢測(cè):樣本于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4~6 h,分別加入10 μl CD4-PC7和CD3-PC5,室溫避光孵育15 min,加入3 ml緩沖液,混勻,離心,留下層沉淀,加入100μl破膜劑,分別加入10 μl IFN-γ-FITC熒光抗體和IL-4-PE單克隆抗體,室溫避光孵育15 min,緩沖液重懸后上流式細(xì)胞儀檢測(cè),獲得只分泌IFN-γ和IL-4的CD4+細(xì)胞,分別代表Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞,并計(jì)算其比值。②Th1、Th2型細(xì)胞因子檢測(cè):采用ELISA法檢測(cè)外周血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6水平,所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料采用百分比表示,卡方檢驗(yàn),計(jì)量資料的采用±s表示,多組比較采用F檢驗(yàn),組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 哮喘患兒病毒感染特征220例患兒中有164例病毒陽(yáng)性,陽(yáng)性率74.55%。其中RSV(82/220,37.27%)、RV(65/220,29.55%)、ADV(19/220,8.64%)、IF(27/220,12.27%)、HPIV(30/220,13.64%)、EV(38/220,17.27%)、hMPV(10/220,4.55%)、Boka virus(12/220,5.45%)、BOCA(8/220,3.64%)。其中122例為單一病毒感染,42例為混合感染。其中不同季節(jié)的病毒陽(yáng)性率為:春季38/54(70.37%)、夏 季17/30(56.67%)、秋 季33/48(68.75%)、冬季76/88(86.36%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.881,P=0.004),冬季陽(yáng)性率顯著高于其他3個(gè)季節(jié)。

        220例患兒根據(jù)病情嚴(yán)重程度分為輕度(96例)、中度(80例)、重度(44例)3個(gè)亞組,比較3個(gè)亞組病毒感染情況,單個(gè)病毒感染上3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但中度組和重度組病毒總陽(yáng)性率顯著高于輕度組(P<0.05),詳見(jiàn)表1。

        表1 輕、中、重組哮喘患兒病毒感染情況[例(%)]Tab.1 Viral infection in children with mild,moderate and severe asthma[n(%)]

        2.2 肺功能比較健康組兒童男52例,女48例,年齡3~12歲,平均(6.72±1.16)歲。164例病毒陽(yáng)性患兒隨機(jī)分為對(duì)照組(82例)和觀察組(82例);其中對(duì)照組患兒男45例,女37例,年齡3~12歲,平均(7.10±1.24)歲,輕度17例,中度28例,重度37例;觀察組男48例,女34例,年齡3~12歲,平均(7.23±1.05)歲,輕度14例,中度22例,重度46例。3組性別和年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),對(duì)照組和觀察組病情嚴(yán)重程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。對(duì)照組、觀察組FEV1%、PEF%、FVC%治療前無(wú)顯著差異(P>0.05),但顯著低于健康組(P<0.05);治療后,對(duì)照組和觀察組FEV1%、PEF%、FVC%顯著升高(P<0.05),組間比較,觀察組和健康組無(wú)顯著差異(P>0.05),但觀察組顯著高于對(duì)照組(P<0.05),詳見(jiàn)表2。

        表2 治療前后肺功能指標(biāo)比較(±s)Tab.2 Comparison of pulmonary function indexes before and after treatment(±s)

        表2 治療前后肺功能指標(biāo)比較(±s)Tab.2 Comparison of pulmonary function indexes before and after treatment(±s)

        Note:Compared with Healthy group,1)P<0.05;compared with before treatment,2)P<0.05;compared with control group after treatment,3)P<0.05.

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        2.3 Th細(xì)胞比較對(duì)照組、觀察組Th1%、Th2%、Th1/Th2治療前無(wú)顯著差異(P>0.05),但Th1%、Th1/Th2顯著低于健康組(P<0.05),Th2%顯著高于健康組(P<0.05);治療后,對(duì)照組和觀察組Th1%、Th1/Th2顯著 升 高、Th2%顯著 下 降(P<0.05),組間比較,觀察組和健康組無(wú)顯著差異(P>0.05),但觀察組Th1%、Th1/Th2顯著高于對(duì)照組(P<0.05),Th2%顯著低于對(duì)照組(P<0.05),詳見(jiàn)表3。2.4 Th細(xì)胞因子比較對(duì)照組、觀察組IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6治療前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但

        表3 治療前后Th1、Th2細(xì)胞比較(±s)Tab.3 Comparison of Th1 and Th2 cells before and after treatment(±s)

        表3 治療前后Th1、Th2細(xì)胞比較(±s)Tab.3 Comparison of Th1 and Th2 cells before and after treatment(±s)

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        Note:Compared with Healthy group,1)P<0.05;compared with before treatment,2)P<0.05;compared with control group after treatment,3)P<0.05.

        IL-2、IFN-γ顯著低于健康組,IL-4、IL-6顯著高于健康組(P<0.05);治療后,對(duì)照組和觀察組IL-2、IFN-γ顯著升高,IL-4、IL-6顯著下降(P<0.05),組間比較,觀察組和健康組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但觀察組IL-2、IFN-γ顯著高于對(duì)照組(P<0.05),IL-4、IL-6顯著低于對(duì)照組(P<0.05);詳見(jiàn)表4。

        表4 治療前后IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6比較(±s)Tab.4 Comparison of IL-2,IFN-γ,IL-4,IL-6 before and after treatment(±s)

        表4 治療前后IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6比較(±s)Tab.4 Comparison of IL-2,IFN-γ,IL-4,IL-6 before and after treatment(±s)

        Note:Compared with Healthy group,1)P<0.05;compared with before treatment,2)P<0.05;compared with control group after treatment,3)P<0.05.

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        2.5 肺功能與Th1/Th2的相關(guān)性研究將164例患兒治療前后的FEV1%、PEF%、FVC%與治療前后的Th1、Th2、Th1/Th2納入Pearson相關(guān)性研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FEV1%與Th1呈正相關(guān)(P<0.05)、與Th2呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),F(xiàn)EV1%、PEF%、FVC%與Th1/Th2均呈正相關(guān)(P<0.05);詳見(jiàn)表5。

        表5 FEV1%、PEF%、FVC%與Th1、Th2、Th1/Th2的相關(guān)性Tab.5 Correlation between FEV1%,PEF%,F(xiàn)VC% and Th1,Th2,Th1/Th2

        2.6 不良反應(yīng)治療期間,未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)。

        3 討論

        哮喘是一種氣道慢性炎癥,臨床癥狀以反復(fù)喘息、氣促、胸悶和咳嗽為主。一項(xiàng)收集2015年1月至2019年3月的484 719例兒童Meta分析表明,中國(guó)兒童哮喘平均患病率為4.90%,進(jìn)一步亞組分析表明發(fā)病率逐年升高,由3.8%上升6.5%[5]。哮喘嚴(yán)重影響兒童的生長(zhǎng)發(fā)育健康,帶來(lái)了巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。近年來(lái),現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),病毒感染可能是導(dǎo)致哮喘發(fā)病的主要原因之一。患兒支氣管壁在感染病毒后,發(fā)生炎性改變,形成炎癥浸潤(rùn),氣道表現(xiàn)出高反應(yīng)性,即支氣管壁黏膜發(fā)生水腫,分泌物不斷增加,逐漸導(dǎo)致氣管痙攣、氣流受限,表現(xiàn)出咳嗽、喘息等臨床癥狀[6]。與此同時(shí),體內(nèi)的免疫系統(tǒng)啟動(dòng),氣管內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞升高,釋放炎癥因子和過(guò)敏介質(zhì),擴(kuò)大炎癥反應(yīng),殺滅病原菌的同時(shí)也會(huì)損傷氣管組織,加劇氣道高反應(yīng)性和喘息癥狀[7]。

        病毒作為可能是誘發(fā)哮喘急性發(fā)作的重要原因,但具有一定的地域性差異。能誘導(dǎo)急性哮喘的病毒種類眾多,本研究對(duì)在我院就診的220例哮喘患兒進(jìn)行病毒篩查檢測(cè),發(fā)現(xiàn)74.54%伴有單一或多重病毒感染,其中以RSV和RV的感染率最高,分別為37.27%、29.55%,RSV和RV是被報(bào)道的最常見(jiàn)單位兩種導(dǎo)致呼吸道疾病的病毒[8]。王婷等[9]對(duì)喘息發(fā)作期哮喘嬰幼兒的病毒原檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),鼻咽部標(biāo)本病毒陽(yáng)性率為49.6%;盧可斌等[10]對(duì)菏澤115例支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒的調(diào)查發(fā)現(xiàn)病毒感染率為67.83%,說(shuō)明病毒感染在哮喘中不可小覷。分別對(duì)季節(jié)和嚴(yán)重程度進(jìn)行分析以后發(fā)現(xiàn)冬季是病毒感染的高發(fā)季節(jié),而春夏秋感染率較低,這與病毒本身單鏈RNA不耐熱的特征有關(guān),提示哮喘病毒感染具有一定的季節(jié)流行性。分析病毒感染與病情的特征發(fā)現(xiàn),中重度患兒病毒感染率顯著高于輕度患兒,這與孫遜等[11]報(bào)道的RSV和PIV感染與哮喘中重度哮喘急性發(fā)作有關(guān)具有相似性,說(shuō)明病毒感染可能是導(dǎo)致病情加重的原因。這可能與病毒感染會(huì)影響機(jī)體的免疫平衡,加重氣道炎癥相關(guān)。

        目前臨床已經(jīng)達(dá)成共識(shí),認(rèn)為嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子共同參與了哮喘的整個(gè)發(fā)病過(guò)程,但是單純地針對(duì)過(guò)敏機(jī)制以及減輕氣道反應(yīng)癥狀的常規(guī)治療仍然無(wú)法完全控制患兒的病情,特別是伴有病毒感染的重癥患兒。病毒感染與哮喘的病情進(jìn)展的關(guān)系已經(jīng)獲得了臨床大多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可[12],因此,本研究進(jìn)一步對(duì)病毒感染的患兒進(jìn)行α-干擾素抗病毒治療,結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療1周后觀察組肺功能顯著改善且優(yōu)于對(duì)照組,F(xiàn)EV1%、PEF%、FVC%與健康組兒童比較無(wú)顯著差異,說(shuō)明α-干擾素通過(guò)霧化吸入能顯著改善急性發(fā)作哮喘患兒的臨床癥狀。顧霞等[13]使用IFN-γ治療支氣管哮喘,發(fā)現(xiàn)能提高臨床有效率、改善肺功能。分析認(rèn)為霧化吸入能有效提高病灶局部藥物有效濃度,針對(duì)氣道炎癥進(jìn)行快速干預(yù),同時(shí)有效減輕全身副作用。α-干擾素是一種能作用于細(xì)胞表面受體的活性蛋白質(zhì),具有廣譜的抗病毒作用,其機(jī)制主要是通過(guò)與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合產(chǎn)生抗病毒蛋白發(fā)揮抑制蛋白復(fù)制、擴(kuò)增作用,已經(jīng)被應(yīng)用于多種病毒感染的相關(guān)治療[14]。此外,α-干擾素還可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng),可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體T淋巴細(xì)胞亞群的平衡來(lái)間接發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用[15]。

        目前,已有相關(guān)研究證實(shí)哮喘患兒存在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能紊亂現(xiàn)象,T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是機(jī)體清除病毒感染的重要機(jī)制[16]。T細(xì)胞分為Th1和Th2,Th1主要通過(guò)產(chǎn)生IL-2、IFN-γ來(lái)減輕免疫炎癥、緩解臨床癥狀,Th2主要通過(guò)產(chǎn)生IL-4、IL-6發(fā)揮免疫促進(jìn)、加重炎癥反應(yīng)作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與健康組比較,治療前兩組患兒的Th1%降低、Th2%升高,Th1/Th2偏低,提示病毒感染的哮喘患兒存在T細(xì)胞免疫向Th2偏移現(xiàn)象。在治療1周后,觀察組Th1/Th2顯著高于對(duì)照組,并接近健康組水平,說(shuō)明α-干擾素干預(yù)能調(diào)節(jié)機(jī)體的Th1、Th2免疫平衡。同時(shí),我們分別觀察了Th1和Th2分泌的代表性細(xì)胞因子,發(fā)現(xiàn)其規(guī)律與Th細(xì)胞類似,治療前,兩組患兒IL-2、IFN-γ顯著低于健康組,IL-4、IL-6顯著高于健康組,治療后觀察組IL-2、IFN-γ顯著升高,IL-4、IL-6顯著下降,且與健康組比較均無(wú)顯著差異,提示α-干擾素治療有利于調(diào)節(jié)Th1和Th2分米的細(xì)胞因子的平衡,這些可能是支持α-干擾素能調(diào)節(jié)哮喘患兒免疫平衡的證據(jù)之一。機(jī)體在感染病毒后,Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IFN-γ,有助于減輕炎癥反應(yīng),其中IFN-γ又可以進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞分化成Th1細(xì)胞,發(fā)揮免疫炎癥抑制作用,減輕對(duì)氣管壁正常組織的損傷[17]。Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4和IL-6參與嗜酸性粒細(xì)胞的免疫放大炎癥反應(yīng),這些細(xì)胞因子可以招募更多的炎癥因子,加重放大炎癥反應(yīng),并抑制Th1型炎癥保護(hù)作用,促進(jìn)T細(xì)胞免疫平衡向Th2偏移[18]。臨床也有相關(guān)報(bào)道認(rèn)為病毒感染的呼吸道病毒中,免疫應(yīng)答方式以Th2為優(yōu)勢(shì)應(yīng)答,并以Th1/Th2的平衡狀態(tài)來(lái)衡量疾病的嚴(yán)重程度[19]。本研究中進(jìn)一步的相關(guān)性分析也有類似發(fā)現(xiàn):FEV1%與Th1呈正相關(guān)(P<0.05)、與Th2呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),F(xiàn)EV1%、PEF%、FVC%與Th1/Th2比值均呈正相關(guān)(P<0.05),這也進(jìn)一步說(shuō)明哮喘患兒的肺功能與Th1/Th2有密切相關(guān)性,α-干擾素的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用能有利于改善肺功能以及Th1/Th2平衡。

        綜上所述,急性哮喘病毒感染率高,采用α-干擾素進(jìn)行抗病毒治療有利于改善患兒肺功能,調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡以及其對(duì)應(yīng)的細(xì)胞因子平衡。

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