王方迪 侯瑞霞 趙新程 李俊琴 張開(kāi)明 李新華

（山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，太原030009）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一群中胚層來(lái)源的多能干細(xì)胞，可通過(guò)釋放細(xì)胞因子等對(duì)微環(huán)境中的T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC細(xì)胞）等免疫細(xì)胞的活化、增殖和炎癥因子的釋放等發(fā)揮抑制作用，因而被認(rèn)為是一種免疫抑制細(xì)胞［1］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者的皮損MSCs具有特殊的細(xì)胞因子表達(dá)特點(diǎn)和功能，可能參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展，本實(shí)驗(yàn)室從銀屑病患者皮損處分離出的真皮間充質(zhì)干細(xì)胞（dermal mesenchymal stem cells，DMSCs）的炎癥相關(guān)基因如白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、趨化因子14（CXCL14）等表達(dá)異常，對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用減弱［2-4］，另外CAMPANATI等［5］也發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損中分離出的MSCs的Th1、Th17型 炎 癥 因 子 高 表 達(dá) 如IFN-γ、IL-17、IL-23、TNF-α等，ORCIANI等［6］同樣研究發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損處MSCs的血管內(nèi)皮生成因子（VEGF）及NO分泌增多。MSCs的功能可受到IFN-γ、TNF-α等炎癥因子的影響［7］，因此推測(cè)銀屑病患者皮損異常表達(dá)的Th1/Th17炎癥因子可能誘導(dǎo)了局部DMSCs功能的異常。為探討銀屑病皮損處DMSCs異常的原因，進(jìn)一步明確DMSCs在銀屑病發(fā)病過(guò)程中的作用，本研究擬用銀屑病患者血清作用于正常DMSCs，觀察其對(duì)DMSCs免疫功能相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響以及其對(duì)PHA誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖的抑制作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源收集銀屑病患者20例，均經(jīng)臨床和病理確診為尋常型銀屑病，男13例，女7例，年齡18~60歲，病程10~20年，選擇20例同期在我院體檢正常的志愿者作為對(duì)照組及5例在我院泌尿外科、整形外科進(jìn)行手術(shù)的健康志愿者的多余皮膚組織，年齡、性別與銀屑病患者相匹配，所有志愿者均排除銀屑病等免疫相關(guān)性疾病。本研究已通過(guò)太原市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有樣本取材前均征得本人同意，并簽署知情同意書(shū)。所有對(duì)象均排除其他慢性炎癥性疾病以及自身免疫疾病，取材前1個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)使用過(guò)糖皮質(zhì)激素、生物制劑及免疫抑制劑等。

1.1.2 主要試劑與儀器DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、Dispase酶、淋巴細(xì)胞分離液及胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olym?pus公司；MACS CD3磁珠、LS分選柱和Vario MACS分選器購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec公司；37℃恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Sheldon Manufactuing Inc公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；SYBR premix EX?TaqⅡ熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 DMSCs的分離和培養(yǎng)用本實(shí)驗(yàn)室之前研究描述的方法進(jìn)行5例皮膚組織的DMSCs的分離和培養(yǎng)［8］，無(wú)菌條件下切取皮膚組織1 mm3大小，去除皮下組織及角質(zhì)層，加入0.25% Dispase酶37℃消化2~4 h，分離真、表皮，收集真皮部分，進(jìn)一步將組織塊剪碎，吸管吹打，篩網(wǎng)過(guò)濾，濾過(guò)液離心棄上清，沉淀中加含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，以1.0×105個(gè)/cm2密度接種于T25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。72 h后棄去未貼壁細(xì)胞，每3~4 d半量換液1次。待細(xì)胞融合90%以上時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代。細(xì)胞傳至第三代后收獲計(jì)數(shù)，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面標(biāo)記物如CD29、CD44、CD34、CD105、CD45及HLA-DR，體外成骨和成脂分化實(shí)驗(yàn)也如之前研究所述［8］。

1.2.2 血清采集及DMSCs培養(yǎng)40例研究對(duì)象（20例銀屑病、20例正常對(duì)照）均清晨空腹采集靜脈血液5 ml，置于添加了促凝劑的采血管中，4 000 r/min離心5 min后吸取血清，過(guò)濾后放置于低溫冰箱-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。待DMSCs傳至第三代并有70%以上貼壁后，棄原培養(yǎng)基，將含50%人血清（預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索確定）的DMEM/F12培養(yǎng)基加入細(xì)胞中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后胰酶消化，收獲細(xì)胞。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用Trizol法提取DMSCs的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)體積為20μl，包括SYBR premix EX TaqⅡ10μl，ROX Reference Dye 0.4 μl，上下游引物各0.4 μl，cDNA模板2 μl，ddH2O 6.8 μl。擴(kuò)增條件為95℃10 min，95℃30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)2次，得到每個(gè)樣品的Ct值，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行結(jié)果分析。熒光定量引物及序列見(jiàn)表1。

表1 各基因引物序列Tab.1 Primer sequences of genes

1.2.4 T細(xì)胞分離及共培養(yǎng)采集3例正常對(duì)照者（取自上述20例體檢者）外周血5 ml，EDTA抗凝，采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（periph?eral blood mononuclear cells，PBMCs）［4］，分 離 出 的PBMCs用PBS洗2次，根據(jù)說(shuō)明書(shū)用MACS CD3磁珠，LS分選柱和VarioMACS分選器分選出T細(xì)胞，調(diào) 整 細(xì) 胞 濃 度 為6.7×105個(gè)/ml，血 清 刺 激 后 的DMSCs為4×105個(gè)/ml待用。用PHA（植物凝集素）刺激T細(xì)胞誘導(dǎo)其活化，PHA加入細(xì)胞懸液的濃度為50μg/ml。

本實(shí)驗(yàn)分為3組：①正常血清組：正常血清作用的DMSCs（HD-tr-DMSCs）+T細(xì)胞；②銀屑病血清組：銀屑病血清作用的DMSCs（Pso-tr-DMSCs）+T細(xì)胞；③單獨(dú)T細(xì)胞培養(yǎng)為對(duì)照。所有培養(yǎng)組均用12孔Transwell板共培養(yǎng)，DMSCs種于上室（500 μl/孔），T細(xì)胞種于下室（1.5 ml/孔）（DMSCs∶T=1∶5），并置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育72 h，收集懸浮細(xì)胞以備后續(xù)檢測(cè)。

1.2.5 CCK-8檢測(cè)T細(xì)胞的增殖率T細(xì)胞與不同刺激作用的DMSCs共培養(yǎng)72 h后收獲，用相同的稀釋倍數(shù)將細(xì)胞按每孔100μl接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24 h后，每孔加入10μl CCK-8，繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度值（即OD值），用OD值反映T細(xì)胞的增殖情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，大于兩組時(shí)組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞早期未貼壁，呈小圓形，培養(yǎng)2 d后可見(jiàn)長(zhǎng)梭形細(xì)胞貼壁，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞增多，細(xì)胞逐漸增大，基本為梭形成纖維細(xì)胞形態(tài)且互相連接，培養(yǎng)14 d左右，細(xì)胞90%融合，梭形排列，呈漩渦狀。血清加入細(xì)胞后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，形態(tài)未發(fā)生明顯變化，銀屑病組與正常血清組無(wú)差別。見(jiàn)圖1。

圖1 血清作用后的DMSCs形態(tài)（×100）Fig.1 Morphology of DMSCs after serum action（×100）

2.2 血清作用后DMSCs的IL-10、PGE2、TLR4表達(dá)水平熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，與HD-tr-DMSCs表達(dá)水平相比，Pso-tr-DMSCs的IL-10、前列腺素E2（PGE2）、Toll樣受體4（TLR4）低表達(dá)，分別為對(duì)照組的0.48倍、0.11倍、0.37倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表2 血清作用后各基因mRNA表達(dá)水平Tab.2 mRNA expression levels of genes treated with serum

2.3 不同血清刺激后的DMSCs對(duì)PHA活化的T細(xì)胞增殖能力的影響為明確銀屑病患者血清對(duì)DMSCs免疫功能的影響，將Pso-tr-DMSCs與PHA活化后的T細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)以HD-tr-DMSCs以及T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)作為對(duì)照。共培養(yǎng)結(jié)束后采用CCK-8法檢測(cè)各組T細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果如圖2所示，相比活化的T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組，與Pso-tr-DMSCs及HD-tr-DMSCs共培養(yǎng)的T細(xì)胞的增殖能力均顯著降低，且Pso-tr-DMSCs組的T細(xì)胞增殖能力較HD-tr-DMSCs組高，說(shuō)明不管是正常血清還是銀屑病血清作用于正常DMSCs后，均可發(fā)揮抑制活化T細(xì)胞增殖的作用，且銀屑病血清可使DMSCs的免疫抑制能力減弱，各組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖2 與不同組DMSCs共培養(yǎng)后的T細(xì)胞增殖情況Fig.2 Proliferation of T cells co-cultured with different DMSCs

3 討論

銀屑病目前被認(rèn)為是一種以T細(xì)胞為主介導(dǎo)，多種免疫細(xì)胞共同參與的自身免疫性疾?。?］。眾多研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者血清中IL-1、IL-6、TNF-α、IL-8、IL-22、IL-17等炎癥性細(xì)胞因子高表達(dá)，且部分炎癥因子的表達(dá)水平與皮損嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［10］。此外BOEHNCKE等［11］認(rèn)為，銀屑病的斑塊是由皮損處的細(xì)胞與免疫系統(tǒng)的作用紊亂引起的，樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞是關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞，皮損處活化的樹(shù)突狀細(xì)胞釋放TNF-α及IL-23，誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，Th1、Th17、Th22細(xì)胞增殖同時(shí)釋放了IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-22等炎癥因子，炎癥因子協(xié)同作用刺激角質(zhì)形成細(xì)胞分泌TNF-α、IL-20、IL-8等炎癥趨化因子，各種細(xì)胞的功能紊亂及炎癥因子的相互作用在銀屑病皮損局部形成了炎癥性微環(huán)境［6］。

間充質(zhì)干細(xì)胞幾乎存在于所有組織中，具有多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)特性，可通過(guò)細(xì)胞間直接接觸或者釋放細(xì)胞因子、趨化因子等方式發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能［1］。MSCs的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完全清楚，據(jù)報(bào)道其可能的機(jī)制有：①M(fèi)SCs通過(guò)吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）、PGE2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、IFNγ、TLR4等抑制NK細(xì)胞的增殖及殺傷功能［12-14］；②分泌PGE2促使巨噬細(xì)胞向抗炎表型分化［15-16］；③通過(guò)分泌IL-6、PGE2等抑制抗原提呈細(xì)胞如樹(shù)突狀細(xì)胞的分化成熟［17］；④分泌IDO、TGF-β、IL-10等抑制Th1、Th17的產(chǎn)生及其細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)Th2產(chǎn)生，誘導(dǎo)Treg產(chǎn)生［18-19］；⑤通過(guò)細(xì)胞間接觸抑制B細(xì)胞的增殖及功能［19］。

本研究前期及國(guó)內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損中分離的DMSCs在基因表達(dá)模式、促血管生成功能及免疫調(diào)節(jié)功能等方面均存在一定異常［2-6］。XU等［7］用炎癥因子TNF-α、IFN-γ刺激骨髓MSCs后，發(fā)現(xiàn)miR-155顯著高表達(dá)，且miR-155可通過(guò)靶向TAB2抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的產(chǎn)生，從而削弱了MSCs的免疫抑制能力，降低對(duì)活化T細(xì)胞增殖的抑制作用。因此推測(cè)，銀屑病皮損MSCs功能的異?？赡苡善p處升高的多種炎癥因子誘導(dǎo)。

MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能主要通過(guò)PGE2、IL-10、IDO、TLR4等細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)。因此，本實(shí)驗(yàn)在體外用銀屑病患者的血清模擬其體內(nèi)的炎癥環(huán)境，觀察其對(duì)正常DMSCs的IL-10、PGE2、TLR4表達(dá)水平的影響，并將不同血清處理過(guò)的DMSCs與PHA活化的T細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察其對(duì)T細(xì)胞增殖抑制功能的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者血清處理可引起正常DMSCs低表達(dá)抗炎因子TLR4、IL-10、PGE2，且在體外抑制活化T細(xì)胞增殖的能力降低，這種異常與銀屑病患者皮損處的DMSCs相似。以上結(jié)果提示，銀屑病患者血清中的炎癥因子確實(shí)可以抑制DMSCs抗炎因子的表達(dá)，進(jìn)而降低DMSCs的免疫抑制功能。

研究表明，MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能可受多種因素的影響［20-23］，如前所述，炎癥因子刺激MSCs后高表達(dá)的miR-155可通過(guò)靶向TAB2降低MSCs的免疫抑制功能，但是，關(guān)于炎癥因子對(duì)MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的影響也有不同的報(bào)道，如在炎癥早期，促炎細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-1等水平較低，MSCs會(huì)產(chǎn)生大量的促炎因子及趨化因子促進(jìn)炎癥及免疫反應(yīng)，而在炎癥的晚期，促炎細(xì)胞因子水平較高，MSCs則會(huì)獲得免疫抑制表型，產(chǎn)生大量的IDO、NO及趨化因子，協(xié)同作用抑制免疫反應(yīng)［20-22］，MSCs表型的變化也與TLR的激活有關(guān)，但目前關(guān)于TLR4活化后會(huì)促進(jìn)免疫還是抑制免疫暫時(shí)沒(méi)有定論［23］。

綜上所述，銀屑病血清中升高的炎癥因子可能引起其作用的MSCs表型變化，進(jìn)而引起其細(xì)胞因子表達(dá)及功能的變化。當(dāng)然，尚需進(jìn)一步更詳細(xì)的研究來(lái)明確患者的血清中引起DMSCs發(fā)生了什么樣的變化，以及這些變化所涉及的分子機(jī)制。