陳超 常娜 趙萌 張蕊 張瑩

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，肺癌的總體5年生存率僅為15%[1]。免疫抑制在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中起著重要的作用，腫瘤會(huì)影響機(jī)體T淋巴細(xì)胞亞群，抑制細(xì)胞免疫[2]。此外，肺癌患者往往處于高凝狀態(tài)，這會(huì)增加肺栓塞的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)并影響預(yù)后[3]。MET-PI3K-Akt通路在肺癌患者中高表達(dá)，不但參與肺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和免疫抑制，還與凝血有關(guān)，研究顯示PI3K-Akt通路的激活會(huì)誘導(dǎo)高凝狀態(tài)[4-5]。微小RNA(microRNA，miRNA)可在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)參與肺癌進(jìn)程，最近的臨床研究顯示miR-15b在肺癌患者血清中降低，并可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡，但是其作用機(jī)制尚不明確[6]。并且最新研究顯示抑制miR-15b可以通過(guò)激活PI3K/AKT相關(guān)通路促進(jìn)氧葡萄糖剝奪心肌細(xì)胞模型的存活[7]。綜上，本文主要分析miR-15b通過(guò)調(diào)節(jié)MET-PI3K-Akt通路對(duì)肺癌模型鼠免疫功能及高凝狀態(tài)的影響，并探究其作用機(jī)制。

材料與方法

一、主要實(shí)驗(yàn)材料

人肺癌細(xì)胞A549(ATCC公司，美國(guó))。DMEM培養(yǎng)基血清和抗體(Invitrogen公司，美國(guó))。BALB/C裸鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，中國(guó))。miR-15b類(lèi)似物(mimic)、抑制劑(inhibitor)以及陰性對(duì)照(negative control，NC)(GenePharma公司，China)。LipofectamineTM 2000(Invitrogen，美國(guó))。ELISA試劑盒和TUNEL染色試劑盒。TRIzol(Sigma公司，美國(guó))。miScript試劑盒和PrimeScript-RT(Takara公司，日本)。anti-CyclinD1、anti-Ki67、anti-MET、anti-PI3K、anti-AKT(Abcam公司，美國(guó))。PVDF膜(Bio-Rad公司，美國(guó))。ECL 顯色試劑盒(Thermo Fisher公司，美國(guó))。FACSCanto II流式細(xì)胞儀和配套試劑盒(BD Biosciences公司，加拿大)。miR-15b類(lèi)似物(mimic)和陰性對(duì)照(NC)(GenePharma公司，China)。LipofectamineTM 2000(Invitrogen，美國(guó))。pMIR-REPORT 雙熒光素酶試劑盒和1000 Assay System檢測(cè)系統(tǒng)(Thermo Fisher公司，美國(guó))。

二、分組和建模

將DMEM培養(yǎng)基中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組等的A549細(xì)胞分為3組：NC組、mimic組和inhibitor組，mimic組和inhibitor組分別通過(guò)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染50 nM 的miR-15b mimic或者inhibitor來(lái)上調(diào)或抑制miR-15b的水平。NC組轉(zhuǎn)染等量的NC空載質(zhì)粒作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染條件為7 ℃，5%CO2，48 h。通過(guò)qPCR分析轉(zhuǎn)染效果。將轉(zhuǎn)然后的各組細(xì)胞重新配置成濃度為5×105個(gè)/mL的溶液，然后將0.2 mL的細(xì)胞懸液注射在小鼠右前腋下，每組細(xì)胞10只小鼠，在7 d時(shí)可以觸摸到有瘤體生成提示建模成功，在第28 d ，將小鼠稱(chēng)重后，取眼眶血，然后斷頭處死小鼠，收集腫瘤病灶。

三、檢測(cè)指標(biāo)和方法

1 RT-qPCR檢測(cè)miR-15b

腫瘤組織中總RNA通過(guò)TRIzol獲得，通過(guò)miScript試劑盒合成互補(bǔ)DNA(7 ℃/60分鐘，95 ℃/5分鐘，4 ℃)，利用MiScript SYBR-Green PCR試劑盒檢測(cè)互補(bǔ)DNA(95 ℃/10 s，55 ℃/30 s，72 ℃/30 s，40個(gè)循環(huán))。U6用作miR-15b的內(nèi)源參照，通過(guò)2-ΔΔCq分析RNA的相對(duì)表達(dá)水平。

2 TUNEL染色檢測(cè)凋亡

將腫瘤組織用4%的聚甲醛固定并用梯度醇脫水，包埋在石蠟中，制成厚度為5 μm的組織玻片標(biāo)本，將樣本脫蠟、抗原修復(fù)處理，并用密封液封閉。在切片中加入50 μL 的TUNEL反應(yīng)溶液，在37 ℃下孵育1 h，然后用使用PBST洗滌切片。然后加入100 μL的二氨基聯(lián)苯胺在37 ℃下孵育30 min，然后用PBST洗滌。最后，在顯微鏡下觀察樣品。隨機(jī)選擇每個(gè)組織的四個(gè)視野進(jìn)行計(jì)算，凋亡指數(shù)=凋亡數(shù)/(凋亡數(shù)+正常細(xì)胞數(shù))×100%。

3 Western blot檢測(cè)增殖蛋白Cyclin D1和Ki67

將腫瘤組織研磨后收集總蛋白并通過(guò)BCA試劑盒檢測(cè)濃度。應(yīng)用SDS-PAGE(110 V，100分鐘)分離40μg的總蛋白。分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并在膜上添加1 ∶500稀釋的anti-CyclinD1、anti-Ki67抗體并孵育過(guò)夜。然后在室溫下加入以1 ∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，4 ℃下孵育2 h。 通過(guò)ECL檢測(cè)蛋白印跡帶。GAPDH作為內(nèi)參。

4 凝血功能和內(nèi)皮功能

一部分新鮮的小鼠血液樣本送至檢驗(yàn)科檢測(cè)全血黏度，并以及血漿凝血酶原時(shí)間(PT)及活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)。ELISA檢測(cè)血清內(nèi)皮功能指標(biāo)，然后將血液樣本在2000 rps下離心20 min收集血清，通過(guò)ELISA說(shuō)明書(shū)加入試劑，顯色后使用酶標(biāo)儀在450 nm下檢測(cè)吸光度(OD)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算一氧化氮(NO)和內(nèi)皮素(ET1)的濃度。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+和CD8+細(xì)胞

使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血中CD4+和CD8+水平，按照試劑盒加入抗體孵育對(duì)標(biāo)志蛋白進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+和CD8+水平。

6 Western blot檢測(cè)MET-PI3K-Akt通路

根據(jù)1.3.1的方法檢測(cè)腫瘤組織中MET、PI3K、Akt蛋白水平。

7 雙熒光素酶報(bào)告

根據(jù)工具網(wǎng)站Starbase預(yù)測(cè)miR-15b與MET mRNA的的結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)結(jié)合部分的序列分別構(gòu)建野生型(wt-)和突變型的(mut-)的MET序列和miR-15b mimic或NC序列克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體中。使用Lipofectamine 2000將細(xì)胞用兩種載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。使用雙熒光素酶報(bào)告基因1000 Assay System分析系統(tǒng)評(píng)估熒光素酶活性。當(dāng)miR-15b與MET結(jié)合后，熒光素酶活性會(huì)降低。然后通過(guò)RT-qPCR和Western blot檢測(cè)NC組和mimic組中MET mRNA和蛋白水平。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19軟件。以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，兩組定量數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)的方法;多組定量數(shù)據(jù)地比較采用ANOVA方差分析，兩兩比較通過(guò)SNK-q。 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性表示為P<0.05。

結(jié) 果

一、miR-15b對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響

與NC組比較，mimic組的miR-15b水平(3.45±0.36)顯著升高而inhibitor組(0.52±0.07)顯著降低(P<0.05)。并且mimic組的腫瘤體積、質(zhì)量顯著低于NC組而inhibitor組顯高于NC組 (P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 各組miR-15b以及腫瘤體積、質(zhì)量比較(n=10)

二、miR-15b對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

如圖1，深棕色為凋亡細(xì)胞，NC組的凋亡指數(shù)為(5.12±0.46)%，mimic組的凋亡指數(shù)(17.72±3.57)%顯著高于NC組(P<0.05)，inhibitor組的凋亡指數(shù)(1.35±0.41)%顯著低于NC組(P<0.05)(見(jiàn)圖1)。

圖1 TUNEL染色檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況(×400)表3 各組血液流變學(xué)指標(biāo)比較(n=10)

三、miR-15b對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

與NC組(1.12±0.19，1.35±0.10)比較，mimic組的增殖相關(guān)蛋白CyclinD1和Ki67蛋白水平(0.52±0.05，0.48±0.04)明顯降低而inhibitor組的上述水平(2.67±0.24，2.55±0.26)明顯升高(P<0.05)(見(jiàn)表2、圖2)。

圖2 Western blot檢測(cè)腫瘤中CyclinD1和Ki67蛋白水平

表2 各組腫瘤組織中CyclinD1和Ki67蛋白水平比較(n=10)

組別低切(5·s-1)中切(30·s-1)高切(200·s-1)PT(s)APTT(s)NC組8.42±1.046.71±0.744.65±0.4317.52±0.7221.47±1.27mimic組10.91±1.23a8.39±0.91a5.38±0.57a15.21±0.86a18.67±1.39ainhibitor組7.06±1.08a6.12±0.83a4.06±0.53a19.78±1.15a24.05±1.45aF26.89728.95020.44324.72431.859P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

四、miR-15b對(duì)血液流變學(xué)指標(biāo)的影響

mimic組的全血黏度高于NC組而PT和APTT顯著低于NC組(P<0.05)，inhibitor組的全血黏度低于NC組而PT和APTT顯著高于NC組(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

五、miR-15b對(duì)內(nèi)皮功能的影響

與NC組比較，mimic組的NO升高而ET1降低(P<0.05)，inhibitor組的NO降低而ET1升高(P<0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 各組NO和ET1水平比較(n=10)

六、miR-15b對(duì)肺癌模型小鼠免疫功能的影響

mimic組的CD4+(19.83±2.71%)和CD4+/CD8+水平(1.30±0.34)顯著高于NC組(16.74±2.67%，1.07±0.24)(P<0.05)，而inhibitor組的CD4+(11.32±2.62%)和CD4+/CD8+水平(0.77±0.18)顯著低于NC組(P<0.05)(見(jiàn)表5)。

表5 各組CD4+和CD8+水平比較(n=10)

七、miR-15b對(duì)肺癌模型小鼠MET-PI3K-Akt通路的影響

mimic組MET、PI3K、Akt水平顯著高于NC組而inhibitor組上述指標(biāo)水平顯著低于NC組(P<0.05)(見(jiàn)表6、圖3)。

圖3 Western blot檢測(cè)腫瘤中MET、PI3K、Akt水蛋白水平

表6 各組MET、PI3K、Akt水平比較(n=10)

八、雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證miR-15b靶向抑制MET

miR-15b與MET mRNA結(jié)合位點(diǎn)(如圖4)所示。根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-15b mimic和wt-MET時(shí)，相對(duì)熒光酶素活性顯著降低(P<0.05)，提示miR-15b與MET mRNA靶向結(jié)合(如表7)。并且mimic組的MET mRNA和蛋白水平顯著低于NC組(見(jiàn)表8)。

表7 雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)靶向結(jié)合

表8 過(guò)表達(dá)miR-15b對(duì)MET mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

圖4 miR-15b與MET mRNA結(jié)合位點(diǎn)

討 論

肺癌是最致命的惡性腫瘤，最新的統(tǒng)計(jì)報(bào)告估計(jì)，肺癌約占所有女性癌癥死亡患者的26%和所有男性癌癥死亡患者的29%[8]。主動(dòng)或被動(dòng)吸煙、輻射、煙塵、職業(yè)性接觸石棉、鎳、鉻和砷等物質(zhì)均是肺癌的誘發(fā)因素。雖然診斷和治療肺癌的新方法被不斷應(yīng)用于臨床，但由于確診時(shí)約有35%的肺癌病例已經(jīng)處于晚期，肺癌的預(yù)后仍不令人滿(mǎn)意。

近年來(lái)，miRNA在肺癌中的作用被廣泛的發(fā)現(xiàn)，miRNA可通過(guò)堿基配對(duì)的方式與mRNA結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)。miR-15b是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種與腫瘤有關(guān)的miRNA，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在宮頸癌、舌癌以及胃癌中起到抑制腫瘤的作用[9-11]。在肺癌中，研究發(fā)現(xiàn)miR-15b可以通過(guò)抑制Bcl2蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抑癌作用[12]。也有臨床研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了血清中的miR-15b可以作為肺癌的標(biāo)志因子[13]。本文通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，分析提高或抑制miR-15b對(duì)肺癌裸鼠模型的的影響，結(jié)果顯示提高miR-15b的水平可以抑制肺癌裸鼠模型中腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡，抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而抑制miR-15b對(duì)肺癌產(chǎn)生促癌作用。本次研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-15b在肺癌中發(fā)揮抑癌作用。

免疫抑制是腫瘤的主要特征之一，在這個(gè)過(guò)程中，機(jī)體的免疫系統(tǒng)受到抑制，CD4+比例顯著降低，CD4+/CD8+的比例也下降[14]。并且CD4+/CD8+受到抑制也是腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移的必要條件[15]。此外對(duì)于肺癌患者，除免疫抑制外，高凝狀態(tài)也是另一大特征，并且CD4+的變化也與凝血狀態(tài)有關(guān)[16]。本次研究結(jié)果顯示對(duì)于肺癌裸鼠模型，提高miR-15b不但會(huì)緩解高凝狀態(tài)、改善內(nèi)皮功能，還可以提高CD4+和CD4+/CD8+的水平，解除免疫抑制，而抑制miR-15b具有相反的作用。此外，本次研究結(jié)果還顯示mimic組MET、PI3K、Akt水平顯著高于NC組而inhibitor組上述指標(biāo)水平顯著低于NC組。MET-PI3K-Akt通路的上調(diào)，是肺癌發(fā)生和進(jìn)展的重要機(jī)制，并且PI3K-Akt通路與凝血功能有關(guān)[17]。也有研究發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt通路也可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制抗體或調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子的分泌，從而抑制免疫反應(yīng)[18]。Li等[19]研究結(jié)果顯示抑制miR-15會(huì)激活PI3K/AKT通路。也有研究顯示提高miR-15b的水平可以通過(guò)激活PI3K/Akt相關(guān)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞起到抑制作用[20]。并且本次研究通過(guò)雙熒光素酶，報(bào)告驗(yàn)證了miR-15b與MET mRNA靶向結(jié)合，提高miR-15b的水平會(huì)抑制MET的表達(dá)，這提示miR-15b對(duì)肺癌的抑制作用與MET-PI3K-Akt通路有關(guān)。

綜上所述，在肺癌裸鼠模型中，miR-15b可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡和抑制增殖，并促進(jìn)免疫功能改善高凝狀態(tài)。但是關(guān)于miR-15b在肺癌中的作用和機(jī)制值得進(jìn)一步研究。