龐一雄 李萍 胡磊 胡琦 項(xiàng)安華 朱泉

肺癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell Lung carcinomas，NSCLC)占肺癌的80%，是肺癌的主要類型[1]。肺鱗癌是NSCLC主要病理亞型[1]，雖然生活條件和醫(yī)療水平有明顯改善，特別是手術(shù)切除，放療和化療等傳統(tǒng)治療有明顯進(jìn)展，但是NSCLC患者早期臨床表現(xiàn)不典型，大部分到中、晚期才確診，而中晚期患者手術(shù)治療效果往往欠佳，所以5年生存率總體偏低[2-3]。除了傳統(tǒng)的治療方法外，肺癌分子靶向治療為我們提供了新的研究方向，尋找靶向治療肺鱗癌的特異性生物標(biāo)志物是目前研究難點(diǎn)。E2F1、E2F6均為E2F轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，在多種腫瘤疾病中均有報(bào)道，但國(guó)內(nèi)有關(guān)E2F6的報(bào)道相對(duì)不多[4-5]。Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xklp2，TPX2)是在細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂時(shí)紡錘體形成過(guò)程中發(fā)揮作用的一種微管相關(guān)蛋白，與小細(xì)胞肺癌發(fā)生有關(guān)[6]。目前，E2F1、E2F6、TPX2在肺鱗癌中的表達(dá)情況及與臨床病理關(guān)系較少有人研究。因此，本研究將通過(guò)檢測(cè)E2F1、E2F6、TPX2在肺鱗癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，以期為進(jìn)一步研究肺鱗癌治療、預(yù)后提供有價(jià)值的線索。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2019年2月至2020年10月于本院收治進(jìn)行手術(shù)的肺鱗癌患者58例。取肺鱗癌患者手術(shù)中新鮮離體的肺鱗癌組織100 mg作為研究樣本，取癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm，且術(shù)后病理證實(shí)無(wú)癌細(xì)胞)50～100 mg作為對(duì)照樣本，手術(shù)樣本離體后均經(jīng)液氮速凍，-80 ℃冰箱保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。其中男39例，女19例，平均年齡53.89±7.85歲。TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)以國(guó)際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC)第8版為準(zhǔn)，分為Ⅰ期11例、Ⅱ期14例、Ⅲ期20例、Ⅳ期13例。收集肺鱗癌患者一般資料，包括：年齡、性別、腫瘤直徑、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤分化程度和吸煙史。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理確診為肺鱗癌。(2)通過(guò)本院倫理委員會(huì)審核，符合相關(guān)倫理學(xué)規(guī)定。(3)所有研究對(duì)象及其家屬知情，并簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能障礙、全身性感染、免疫系統(tǒng)疾病、精神疾病、嚴(yán)重代謝性疾病者。(2)術(shù)前接受過(guò)局部放療、全身化療、生物免疫治療、其他輔助治療或其他抗腫瘤治療者。(3)妊娠哺乳期女性。(4)資料不完整或不真實(shí)者。

二 、主要試劑

TRIzol試劑(貨號(hào)：GMS12279)購(gòu)自深圳子科生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：AB-4366596)購(gòu)自上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司；熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：KL190)購(gòu)自上?？道噬锟萍加邢薰?；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)：Prism?7500)購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；E2F1、E2F6、TPX2及GAPDH引物均由華大基因科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列(見(jiàn)表1)。

表1 引物序列

三、 qRT-PCR法檢測(cè)肺鱗癌及癌旁正常組織中E2F1、E2F6和TPX2表達(dá)水平

1 RNA提取

使用TRIzol試劑提取總RNA。每份樣本取50～100 mg于勻漿器中，加液氮研磨成粉末狀，加入1 mL TRIzol試劑處理，轉(zhuǎn)移勻漿至無(wú)RNAase的Eppendof管中，4 ℃離心20 min后取上清，之后步驟均嚴(yán)格按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260、280 nm波長(zhǎng)處的RNA樣本濃度及吸光度(A)值，當(dāng)1.8

2 cDNA合成

將總RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。20 μL體系：0.2 μg/μL RNA 2 μL，通用引物1 μL，5×buffer 4 μL，RNA酶抑制劑1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL和逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，DEPC水補(bǔ)至20 μL，充分混勻，42 ℃水浴1 h，70 ℃水浴5 min，滅活反轉(zhuǎn)錄酶。檢驗(yàn)合成的cDNA質(zhì)量，合格后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)

采用qRT-PCR法檢測(cè)肺鱗癌及癌旁正常組織中E2F1、E2F6和TPX2表達(dá)水平。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH基因。10 μL反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 5 μL，50 ng/μL cDNA 1 μL，10 μM上游引物0.5 μL，10 μM下游引物0.5 μL和ddH2O 3.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 10 min；40個(gè)循環(huán)終止。qRT-PCR儀檢測(cè)E2F1、E2F6和TPX2的相對(duì)表達(dá)值，每個(gè)標(biāo)本測(cè)3次，計(jì)算平均值，Ct值為擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到臨界閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)，E2F1、E2F6和TPX2的相對(duì)表達(dá)值以2-ΔΔCt法表示。將E2F1、E2F6和TPX2的相對(duì)表達(dá)值由低到高排序，取中位數(shù)為界點(diǎn)，高于中位值為高表達(dá)，低于中位值為低表達(dá)。

四 、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一 、E2F1、E2F6和TPX2在肺鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

與癌旁正常組織相比，肺鱗癌組織中E2F1、E2F6和TPX2表達(dá)水平均明顯上升(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 E2F1、E2F6和TPX2在肺鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)比較

二、 E2F1表達(dá)與肺鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系

58例肺鱗癌患者癌組織中E2F1表達(dá)情況分別為低表達(dá)27例，高表達(dá)31例。肺鱗癌組織中E2F1表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤直徑、臨床分期、吸煙史無(wú)關(guān)(P>0.05)，與淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度有關(guān)(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 E2F1表達(dá)與肺鱗癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

三、 E2F6表達(dá)與肺鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系

58例肺鱗癌患者癌組織中E2F6表達(dá)情況分別為低表達(dá)25例，高表達(dá)33例。肺鱗癌組織中E2F6表達(dá)與患者年齡、性別、吸煙史無(wú)關(guān)(P>0.05)，與腫瘤直徑、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤分化程度有關(guān)(P<0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 E2F6表達(dá)與肺鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系(n)

四、TPX2表達(dá)與肺鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系

58例肺鱗癌患者癌組織中TPX2表達(dá)情況分別為低表達(dá)21例，高表達(dá)37例。肺鱗癌組織中TPX2表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤直徑、吸煙史無(wú)關(guān)(P>0.05)，與淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤分化程度有關(guān)(P<0.05)(見(jiàn)表5)。

表5 TPX2表達(dá)與肺鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系(n)

五、肺鱗癌組織中E2F1、E2F6和TPX2表達(dá)的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肺鱗癌組織中E2F1和E2F6表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.455，P<0.05)，TPX2和E2F1表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.471，P<0.05)，TPX2和E2F6表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.508，P<0.05)(見(jiàn)圖1、2、3)。

圖2 肺鱗癌組織中TPX2和E2F1表達(dá)的相關(guān)性分析

討 論

肺癌是臨床上危害人類健康最常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤之一。 中國(guó)國(guó)家癌癥中心登記數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，2015年新發(fā)肺癌人數(shù)約為78.7萬(wàn)例，發(fā)病率高達(dá)57.26/10萬(wàn)，每年因肺癌死亡人數(shù)約為63.1萬(wàn)例，死亡率為45.87/10萬(wàn)。 肺癌導(dǎo)致惡性腫瘤疾病負(fù)擔(dān)日趨嚴(yán)重，成為我國(guó)惡性腫瘤死亡主要病因[7]。肺鱗癌是肺癌中常見(jiàn)的病理類型，與肺腺癌相比，其發(fā)病機(jī)制的研究和治療進(jìn)展滯后[1,8]。由于特異性靶向治療肺鱗癌的藥物相對(duì)缺乏，患者預(yù)后結(jié)果差，5年生存率低于15%，即使進(jìn)行了肺切除術(shù)，復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率仍處于較高水平[9]。雖然肺鱗癌早期臨床表現(xiàn)不典型，但臨床表現(xiàn)通常與腫瘤發(fā)生位置、病理類型、病情程度密切相關(guān)，所以，尋找與肺鱗癌臨床病理有關(guān)、可能對(duì)治療肺鱗癌有效的潛在靶基因，具有重要的臨床價(jià)值。

圖3 肺鱗癌組織中TPX2和E2F6表達(dá)的相關(guān)性分析

E2F1、E2F6均為E2F家族的重要成員，據(jù)報(bào)道，E2F家族是重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，在細(xì)胞周期進(jìn)展、DNA復(fù)制、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、增殖與凋亡等細(xì)胞過(guò)程中起調(diào)控作用[10-11]。Sun等[12]分析E2F1在肺癌患者中表達(dá)發(fā)現(xiàn)，肺鱗癌、肺腺癌組織中E2F1 mRNA和蛋白水平均高于正常肺組織。Wang等[13]分析發(fā)現(xiàn)，E2F1可以通過(guò)調(diào)控促進(jìn)小細(xì)胞肺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，參與小細(xì)胞肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。曹燕飛等[14]研究發(fā)現(xiàn)，E2F6參與肺鱗癌細(xì)胞的增殖與侵襲，通過(guò)上調(diào)miR-185，可靶向抑制E2F6蛋白表達(dá)，肺鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力亦隨之受抑制。Zheng等[15]研究結(jié)果表明，E2F6在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)上調(diào)，在低分化組織中表達(dá)高于高分化組織，在高遷移能力細(xì)胞系中表達(dá)高于低遷移能力細(xì)胞系，miR-424可通過(guò)抑制E2F6表達(dá)參與子宮內(nèi)膜癌中細(xì)胞侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抑癌基因的作用。本研究中，肺鱗癌組織中E2F1、E2F6表達(dá)水平較癌旁組織均明顯上升，提示E2F1、E2F6可能在肺鱗癌中發(fā)揮作用。分析肺鱗癌組織中E2F1、E2F6表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)肺鱗癌組織E2F1表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度有關(guān)，肺鱗癌組織E2F6表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤分化程度有關(guān)，且腫瘤低分化程度中E2F6高表達(dá)比例更高，這與Zheng等[15]在子宮內(nèi)膜癌中的研究一致，提示E2F1表達(dá)可能與細(xì)胞侵襲、分化有關(guān)，E2F6表達(dá)可能與細(xì)胞增殖、侵襲和分化有關(guān)。

TPX2表達(dá)受細(xì)胞周期調(diào)控，在有絲分裂期與紡錘體結(jié)合時(shí)，通過(guò)將TPX2靶向附著于紡錘體微管，保證正常的紡錘體極性，其過(guò)表達(dá)可能會(huì)抑制正常的核分裂，干擾其自身激活的生理途徑，在癌變、惡性腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮作用[16-17]。葉靜梅等[6]研究發(fā)現(xiàn)，TPX2在小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，可能與小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，TPX2在肺鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)，與淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤分化程度有關(guān)，提示TPX2可能在肺鱗癌發(fā)生中發(fā)揮作用，可能與肺鱗癌細(xì)胞侵襲、分化有關(guān)。肺鱗癌組織中E2F1、E2F6、TPX2表達(dá)均呈正相關(guān)，提示E2F1、E2F6、TPX2間表達(dá)聯(lián)系密切，可能共同參與肺鱗癌發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，肺鱗癌組織中E2F1、E2F6、TPX2表達(dá)均明顯上調(diào)，且相互呈正相關(guān)，均與淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度有關(guān)，可能均參與肺鱗癌細(xì)胞侵襲、分化。但由于本研究納入樣本量較少，結(jié)果可能具有局限性，下一步將繼續(xù)收集樣本，對(duì)E2F1、E2F6、TPX2在肺鱗癌中的作用進(jìn)一步深入研究，以期為肺鱗癌臨床治療、預(yù)后提供更有價(jià)值的理論參考。