劉娟 朱春曉 肖雪瓊 莫陳汨 王高峰 肖炎農(nóng)

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070）

蛋白與蛋白之間的相互作用是生物體普遍存在的現(xiàn)象，改變蛋白間的相互作用可能調(diào)控蛋白的生物學(xué)功能，從而影響機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育［1］。因此，研究蛋白間互作關(guān)系對(duì)于揭示生命過(guò)程的調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要。目前應(yīng)用于互作蛋白篩選的技術(shù)主要有酵母雙雜交（yeast two-hybrid，Y2H）、雙分子熒光互 補(bǔ)（bimolecular fluorescent complimentary，BiFC）、pull-down 等［2］。

免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析技術(shù)（immunoprecipitation combined with mass spectrometry，IP-MS）是 指在非變性條件下進(jìn)行細(xì)胞的裂解從而保持了細(xì)胞內(nèi)蛋白間的相互作用關(guān)系不被破壞，當(dāng)目標(biāo)蛋白被蛋白瓊脂糖珠上共價(jià)連接的特異性抗體捕獲（免疫沉淀）時(shí)，可能同時(shí)捕獲參與蛋白間互作的伴侶蛋白，通過(guò)反復(fù)洗滌除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并通過(guò)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）進(jìn)行蛋白種類的鑒定［3］。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于研究蛋白間的互作。如Li 等［4］使用該技術(shù)鑒定與RBM45 特異性相互作用的蛋白質(zhì)，并通過(guò)免疫印跡和免疫細(xì)胞化學(xué)驗(yàn)證了選定的PPI，證實(shí)RBM45 主要在細(xì)胞核中依賴與RNA 的相互作用和許多其他RBP 締合。Phee等［5］使用免疫沉淀結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)篩選擬南芥中的與植物光敏色素發(fā)生直接或間接相互作用的新型潛在互作蛋白，以闡明植物中光信號(hào)通路。李耀東等［6］篩選得到與A 型流感病毒M2 結(jié)合的多種蛋白，通過(guò)質(zhì)譜分析確定ataxin 10 和3 個(gè)真核翻譯起始因子為候選互作蛋白。岳金榮等［7］通過(guò)制備多克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀，篩選出165 種特有的差異蛋白，通過(guò)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，直接與植物鹽藻MAPK 相互作用的蛋白有4 種。

親環(huán)蛋白（cyclophilin，簡(jiǎn)稱CYP）屬于肽基脯氨酰異構(gòu)酶超家族［8］。由于其典型的肽基脯氨酰異構(gòu)酶活性，親環(huán)蛋白被認(rèn)為存在蛋白質(zhì)折疊酶活性從而具有分子伴侶蛋白的功能，參與多結(jié)構(gòu)域蛋白復(fù)合體的組裝［8-10］。親環(huán)蛋白通過(guò)蛋白間的相互作用在細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中具有重要作用，如RNA 剪切［11］、轉(zhuǎn)錄調(diào)控［12-14］和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［15-16］等。研究表明，淡紫紫孢菌具有10 個(gè)親環(huán)蛋白，PlCYP6基因表達(dá)響應(yīng)氯化鈉、雙氧水和剛果紅等非生物脅迫過(guò)程［17］，但其分子調(diào)控機(jī)理未見報(bào)道。

淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）已廣泛應(yīng)用于防治植物線蟲［18］，是防治線蟲真菌中應(yīng)用前景最好的生防真菌之一［19-20］。淡紫紫孢菌多以孢子粉劑進(jìn)行田間施用［21］，施入田間的淡紫紫孢菌面臨包括鹽脅迫在內(nèi)的多種非生物脅迫，不利的環(huán)境因素將降低淡紫紫孢菌生防效能［22］。解析淡紫紫孢菌響應(yīng)非生物脅迫機(jī)制為改良和選育環(huán)境適應(yīng)性更高的生防菌株提供理論依據(jù)。本研究旨在以淡紫紫孢菌親環(huán)蛋白PlCYP6 為研究對(duì)象，采用免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜以及酵母雙雜交等技術(shù)篩選PlCYP6 候選互作蛋白，為進(jìn)一步揭示PlCYP6 在淡紫紫孢菌響應(yīng)鹽脅迫分子機(jī)制中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

用于試驗(yàn)的淡紫紫孢菌菌株36-1、Pl-GCYP6 和Pl-G，以及質(zhì)粒pKNgR-PlCYP6、pCAMBIA1303-eGFP（改造后載體）和pCAMBIA1303-PlCYP6-eGFP 均保存于本實(shí)驗(yàn)室，PGADT7-T 及PGBKT7 載體購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，大腸桿菌DH5α 感受態(tài)及酵母Y2H 菌株購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建eGFP/PlCYP6-eGFP表達(dá)載體及真核表達(dá) 根 據(jù)PlCYP6（GenBank：VFPFJ_05085）的CDS 序列并使用軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)序列特異性引物“5-CAAGCACAAGCAAAGATGGCGGGATC GGCGGCCGA-3”及“5-CCCTTGCTCACCATGGGCAT TACGTCAATGTTGAGGA-3”，以載體pKNgR-PlCYP6 為模板，采用高保真酶PrimeSTAR? GXL Premix（TaKaRa）進(jìn)行PCR 反應(yīng)擴(kuò)增PlCYP6（1 884 bp）。參照無(wú)縫克隆的方法（試劑盒TreliefTMSoSoo Cloning Kit，TSINGKE），將PlCYP6與載體pCAMBIA1303-eGFP 進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α 菌株中。以質(zhì)粒提取試劑盒AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit（愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司）從DH5α 菌株中提取pCAMBIA1303-eGFP 及pCAMBIA1303-PlCYP6-eGFP 載體質(zhì)粒。采用PEG-CaCl2介導(dǎo)的分子遺傳轉(zhuǎn)化方法［23］將各表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入淡紫紫孢菌菌株36-1 感受態(tài)中。主要試驗(yàn)步驟如下：取淡紫紫孢菌原生質(zhì)體于冰上靜置10 min，分別加入待轉(zhuǎn)化質(zhì)?；駾NA片段，使用TEC（0.01 mol/L Tris-HCl，0.001 mol/L EDTA，0.05 mol/L二水CaCl2）定容至160 μL，混勻后冰浴20 min；加入160 μL 60% PEG 3350 溶液（Sigma），室溫放置15 min。加入1 mL STC 溶液（0.8 mol/L 山梨醇，0.05 mol/L 二水CaCl2，0.01 mol/L Tris-HCl），3 750×g離心6 min，去上清，使用150 μL STC 溶液重懸沉淀，涂布于PDAS 培養(yǎng)基上，28℃ 培養(yǎng)24 h。待培養(yǎng)基上形成菌絲時(shí)覆蓋含有1.2 mg/ mL 遺傳霉素G418（Amersco）的T-TOP 培養(yǎng)基，挑選生長(zhǎng)于T-TOP 培養(yǎng)基上的菌落于新的PDA（含1.2 mg/ mL 遺傳霉素G418）上。最后，提取挑選菌株的基因組DNA，采用PCR 技術(shù)使用引物“5-GCTTCCTCATCCCACTACACA-3”和“5-TTCCGCAGGTGCTTTCAA-3”分 別 擴(kuò) 增eGFP和PlCYP6∷eGFP目標(biāo)序列，鑒定表達(dá)eGFP和PlCYP6∷eGFP的淡紫紫孢菌目標(biāo)菌株P(guān)l-G 和Pl-GCYP6。

1.2.2 總蛋白的提取 分別將100 μL 淡紫紫孢菌菌株P(guān)l-GCYP6 和Pl-G 分生孢子懸液（106CFU/mL）加入150 mL PDB 液體培養(yǎng)基，在28℃ 條件下160 r/min 震蕩培養(yǎng)2 d。使用4 層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾收集菌絲，分裝于2 mL 的離心管中。每管加入1 mL 1 mol/L 的NaCl 溶液，充分混勻，于28℃ 160 r/min 分別震蕩培養(yǎng)15 min、30 min和60 min。以未進(jìn)行NaCl 溶液震蕩培養(yǎng)的相應(yīng)菌株菌絲為對(duì)照。收集各菌絲樣品立即進(jìn)行液氮速凍和充分研磨。將各研磨后的菌絲組織（約1 g）收集于10 mL 的離心管中，加入3 mL RIPA 強(qiáng)裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司）及30 μL PMSF（Sigma）。使用振蕩器充分混勻，于冰上靜置2 h。4℃，12 000×g離心30 min，取上清液。將不同處理時(shí)間的總蛋白溶液等比例混合后立即用于免疫沉淀試驗(yàn)。

1.2.3 免疫沉淀 分別取1.2.2 中提取的Pl-GCYP6 和Pl-G總蛋白溶液各4 mL 于10 mL 離心管中，加入5 μg Anti-eGFP Antibody 抗體，使用垂直混合儀于4℃ 條件下40 r/min 孵育過(guò)夜。加入1/20 體積的Protein A /G 瓊脂糖珠（碧云天生物技術(shù)有限公司），繼續(xù)孵育4 h。1 000×g離心30 s，收集沉淀及上清液。加入1 mL PBS 緩沖液，1 000×g離心30 s，分別收集Protein A /G 瓊脂糖珠沉淀及上清液，重復(fù)上述離心操作5 次。加入200 μL 1 × loading buffer，沸水浴10 min。取40 μL 用于Western blot 檢測(cè)，剩余樣品送華大基因公司進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析。

1.2.4 Western blot 檢測(cè) 總蛋白溶液或免疫沉淀產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 電泳后電轉(zhuǎn)（30 V，50 min）至硝酸纖維素膜上，使用5% 的脫脂牛奶封閉過(guò)夜。加入一抗Anti-eGFP Antibody（1∶2 000），37℃ 孵育1 h，使用TBST 清洗3 次，每次10 min。加入羊抗鼠IgG（1∶200）二抗，37℃孵育1 h，使用TBST 清洗3 次。加入1 mL 顯色液ClarityTM Western ECL Substrate（BIO-RAD公司），進(jìn)行顯色并成像。

1.2.5 LC-MS /MS 質(zhì)譜分析及生物信息學(xué)分析 將1.2.3 中免疫沉淀后的蛋白液使用SDS-PAGE 凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行分離，切取膠片使用蛋白酶解后除鹽、冷凍抽干。將抽干的肽段樣品用流動(dòng)相A（2% CAN，0.1% FA）復(fù)溶，20 000×g離心10 min 后，取上清液進(jìn)樣。樣品采用Thermo 公司的MLtiMate 3000 UHPLC 進(jìn)行分離。納升液相分離末端直接連接質(zhì)譜儀。經(jīng)過(guò)液相分離的肽段經(jīng)nanoESI 源離子化后進(jìn)入到串聯(lián)質(zhì)譜儀Q-Exactive HF X（ThermoFisher Scientific，San Jose，CA）進(jìn)行DDA（Data Dependent Acquisition）模式檢測(cè)。采用Mascot v2.3.02 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)庫(kù)為UniProt 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)及基于基因組注釋的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。使用Percolator 軟件對(duì)搜索結(jié)果預(yù)處理并重新打分，并對(duì)輸出的結(jié)果過(guò)濾（PSM-level FDR ＜= 0.01），分別計(jì)算每個(gè)蛋白的iBAQ 值?；贕O 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.geneontology.org）及KEGG 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//www.genome.jp/kegg/）進(jìn)行蛋白功能富集分析。

1.2.6 酵母雙雜交 依次加入5 μL carrier DNA（TaKaRa）及2種預(yù)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒各100 ng 于50 μL 酵母感受態(tài)中，混勻后加入500 μL PEG/LiAC（100 μL 50% PEG 3350，100 μL 10 × TE 及 0.1 mol/l LiAC），30℃ 孵育30 min。加入20 μL DMSO，42℃ 水浴15 min。1 000 r/min 離心15 s，使用YPD plus 重懸。1 000 r/min 離心15 s，使用1 mL 0.9% NaCl 重懸。1 000 r/min 離心15 s，使用100 μL 0.9% NaCl 重懸，隨后涂布于SD/-Leu/-Trp 酵母缺陷培養(yǎng)基（二缺）（TaKaRa），于含有500 μg/mL Aureobasidin A 及20 mg/mL X-α-Gal 的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 酵母缺陷培養(yǎng)基（四缺）檢測(cè)蛋白互作情況。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 接種100 μL 濃度為1×106CFU/mL 淡紫紫孢菌野生型菌株于150 mL PDB 中培養(yǎng)1 d后使用四層無(wú)菌擦鏡紙收集菌絲，使用無(wú)菌水及1 mol/L NaCl 分別處理菌絲60 min 后提取RNA，制備cDNA 作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR），具體試驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明書（SsoFastTM EvaGreen Supermix（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）），使用Bio-Rad CFX 96 Real Time System 進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 20 s；94℃ 10 s，60℃ 20 s，45 個(gè)循環(huán)，以Actin（GenBank：VFPBJ_07912） 作為內(nèi)參進(jìn)行校正，使用引物“5-CTGCTGGGTCC- ATCAGAAAG-3”“5-CGAGACAACGCAGTCAAAT- G-3”及引物“5-GCCCTCTGTCCTGGGTCTT-3”“5- ACAGGGAGGCGAGAATGGA-3”，采用2-△△CT分別測(cè)定PlCYP6及ADH1基因相對(duì)表達(dá)量，各試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 獲得異源表達(dá)eGFP和PlCYP6-eGFP的淡紫紫孢菌菌株

經(jīng)過(guò)遺傳霉素G418 的篩選，獲得異源表達(dá)eGFP和PlCYP6-eGFP的淡紫紫孢菌菌株P(guān)l-G 和Pl-GCYP6。菌絲綠色熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，在Pl-G 和Pl-GCYP6 菌絲中均可見來(lái)自eGFP 的綠色熒光信號(hào)，而在淡紫紫孢菌野生型菌絲中無(wú)綠色熒光信號(hào)（圖1-A）。同時(shí)，PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示在Pl-G 和Pl-GCYP6 基因組DNA 中均可檢測(cè)到異源表達(dá)質(zhì)粒的目標(biāo)序列（圖1-B）。此外，Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示在Pl-G 和Pl-GCYP6 的總蛋白中可分別檢測(cè)到eGFP （約25 kD）和PlCYP6-eGFP（約100 kD）（圖1-C）。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，Pl-G 和Pl-GCYP6 分別為異源表達(dá)eGFP和PlCYP6-eGFP的淡紫紫孢菌菌株。

圖1 eGFP及PlCYP6∷eGFP在淡紫紫孢菌中的異源表達(dá)Fig.1 Heterologous expressions of eGFP and PlCYP6∷eGFP in P. lilacinum

2.2 PlCYP6特異釣取482個(gè)淡紫紫孢菌蛋白，推測(cè)其功能涉及細(xì)胞代謝

SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果顯示，從菌株P(guān)l-G 和Pl-GCYP6 中提取的總蛋白條帶明亮且清晰（圖2-A），這表明各試驗(yàn)組總蛋白提取質(zhì)量好。免疫沉淀產(chǎn)物經(jīng)過(guò)PBS 清洗后去除了大量的非特異性條帶（圖2-A）。Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，eGFP 抗體成功靶標(biāo)到蛋白eGFP 及PlCYP6∷eGFP（圖2-B）。這表明上述來(lái)自菌株P(guān)l-G 和Pl-GCYP6 的免疫沉淀產(chǎn)物分別包含了eGFP 及PlCYP6∷eGFP。蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果表明，在來(lái)自Pl-G 和Pl-GCYP6 的免疫沉淀產(chǎn)物中分別鑒定到629 個(gè)和1 033 個(gè)蛋白，其中482 個(gè)為在Pl-GCYP6 菌株中特異釣取蛋白（圖3）。GO 功能注釋結(jié)果表明，此482 個(gè)蛋白主要富集在催化酶活性和結(jié)合等分子功能條目，以及細(xì)胞過(guò)程和代謝過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程條目（圖4-A）。KEGG pathway 分析表明，上述482 個(gè)蛋白主要富集在轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝途徑，且以碳水化合物、氨基酸和能量代謝為主（圖4-B）。依據(jù)上述結(jié)果推測(cè)，PlCYP6 互作蛋白的功能主要涉及細(xì)胞代謝。

圖2 免疫沉淀釣取PlCYP6互作蛋白Fig.2 Immunoprecipitation to catch interacting proteins of PlCYP6

圖3 差異蛋白的分布Fig.3 Distribution of differential proteins

圖4 候選互作蛋白的GO 功能注釋及KEGG pathway 分析Fig.4 GO function annotation and KEGG pathway analysis of candidate interacting proteins

2.3 乙醇脫氫酶1為PlCYP6的候選互作蛋白

根據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果從上述482 個(gè)蛋白中挑選了蛋白相對(duì)豐度最高的兩個(gè)蛋白乙醇脫氫酶1（alcohol dehydrogenase 1，ADH1，GenBank：VFPBJ_05915）和延伸因子2（elongation factor 2，EF2，GenBank：PCL_12959）進(jìn)行酵母雙雜交分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，AD 與BD-PlCYP6 及截短后的氨基酸區(qū)段均不存在自激活現(xiàn)象（圖5-A，B），因此，PGADT7-T（AD）及PGBKT7（BD）載體可以用于酵母雙雜交分析。酵母雙雜交結(jié)果表明PlCYP6 可以與ADH1 發(fā)生直接互作（圖5-C），但不與EF2 直接互作（數(shù)據(jù)未展示）。此 外，PlCYP6 片 段PlCYP6（67-160）和PlCYP6（161-471）可以分別與ADH1 直接互作（圖5-A，C），其中PlCYP6（67-160）氨基酸區(qū)段為PlCYP6 的WD40 repeat 結(jié)構(gòu)域區(qū)域（圖5-A）。采用qRT-PCR 技術(shù)分析了NaCl 脅迫對(duì)淡紫紫孢菌中PlCYP6及ADH1表達(dá)的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與未進(jìn)行NaCl 脅迫處理的淡紫紫孢菌相比，使用1 mol/L 的NaCl 脅迫處理60 min后，淡紫紫孢菌中PlCYP6和ADH1均被誘導(dǎo)表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量均約為3.5 倍（圖6）。據(jù)此推測(cè)PlCYP6和ADH1同時(shí)參與了淡紫紫孢菌的鹽脅迫應(yīng)激反應(yīng)，這進(jìn)一步佐證了PlCYP6 與ADH1 互作的可能性。

圖5 酵母雙雜交驗(yàn)證PlCYP6與ADH1蛋白的互作關(guān)系Fig.5 Interaction relationship between PlCYP6 and ADH1 protein by yeast two-hybrid

圖6 PlCYP6 與ADH1 在鹽脅迫中的基因表達(dá)量分析Fig.6 Analysis of the gene expression levels of PlCYP6 and ADH1 under salt stress

3 討論

蛋白間互作是生命體生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)外界信號(hào)等各類生物學(xué)過(guò)程的基礎(chǔ)［24］。因此，互作蛋白篩選鑒定可為闡述靶標(biāo)蛋白生物學(xué)功能提供重要的數(shù)據(jù)。免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析是一種具有適應(yīng)性廣泛、高靈敏性特點(diǎn)的蛋白互作研究方法，它已成功被應(yīng)用于研究哺乳動(dòng)物、植物及病毒等生物的各種蛋白過(guò)程中，可進(jìn)行多種類型互作蛋白的篩選如轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白及細(xì)胞膜蛋白等［4-6，25-26］。

在本研究中，我們?cè)诘献湘呔胁捎昧嘶诿庖叱恋砺?lián)合質(zhì)譜分析技術(shù)篩選特定環(huán)境條件下的互作蛋白研究體系。通過(guò)在淡紫紫孢菌中異源表達(dá)靶標(biāo)蛋白PlCYP6 的融合蛋白編碼基因PlCYP6∷eGFP，并以eGFP 標(biāo)簽抗體替代PlCYP6 抗體進(jìn)行免疫沉淀，從PlCYP6∷eGFP超表達(dá)菌株總蛋白中釣取PlCYP6 互作蛋白。與傳統(tǒng)的免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析篩選互作蛋白相比［3］，該方法無(wú)需制備PlCYP6 蛋白抗體，這極大地縮短了互作蛋白篩選周期。同時(shí)，本研究所采用的eGFP 標(biāo)簽抗體蛋白具有以下優(yōu)點(diǎn)：適應(yīng)性廣，可以與不同的目標(biāo)蛋白進(jìn)行融合表達(dá)；可供選擇的標(biāo)簽抗體蛋白種類多，可以使用myc、his 和flag 等標(biāo)簽抗體蛋白替代eGFP 標(biāo)簽抗體蛋白，如Li 等［4］使用flag-IP 篩選HEK293 細(xì)胞中的RBM45 特異性相互作用的蛋白質(zhì)；標(biāo)簽抗體容易獲得且特異性和穩(wěn)定性好，可大幅提高捕獲互作蛋白的特異性［27］。

質(zhì)譜分析結(jié)果中含有豐富的潛在相互作用體成分，同時(shí)也含有大量的背景蛋白質(zhì)，如對(duì)照組中，大量的核糖體蛋白被捕獲。這些背景蛋白往往給驗(yàn)證與目標(biāo)蛋白真正發(fā)生互作的蛋白質(zhì)帶來(lái)困難。可以采取以下幾種辦法降低背景蛋白的干擾：（1）設(shè)置對(duì)照組；（2）IP 過(guò)程中洗滌背景蛋白質(zhì)；（3）根據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果選擇相對(duì)豐度高的蛋白作為候選互作蛋白［28］。本研究以異源表達(dá)eGFP的淡紫紫孢菌菌株P(guān)l-G 為對(duì)照，以消除由eGFP 捕獲的非靶標(biāo)蛋白，從而篩選出受PlCYP6 特異捕獲的蛋白。同時(shí)，本研究根據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果選擇蛋白相對(duì)豐度最高的2 個(gè)蛋白乙醇脫氫酶1（ADH1）和延伸因子2（EF2）進(jìn)行酵母雙雜交驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果表明，PlCYP6 與ADH1 存在直接互作。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)PlCYP6與ADH1均受NaCl 脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，這進(jìn)一步支持了二者間存在互作的可能性。上述研究結(jié)果表明，本研究中PlCYP6 候選互作蛋白篩選策略可行且高效。

對(duì)候選互作蛋白進(jìn)行GO 功能注釋及KEGG pathway 分析以研究PlCYP6 響應(yīng)鹽脅迫應(yīng)激反應(yīng)參與的調(diào)控途徑。真菌通過(guò)代謝物質(zhì)如脯氨酸、甘油、糖類等抵御非生物脅迫［29］。在本研究中，候選互作蛋白中大量的蛋白功能注釋為“Metabolic pathways”，表明PlCYP6 可能調(diào)控淡紫紫孢菌代謝相關(guān)基因響應(yīng)鹽脅迫應(yīng)激過(guò)程。鹽脅迫應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生氧脅迫，從而導(dǎo)致生物體內(nèi)醛含量的升高［30］。ADH在生物體內(nèi)依賴NADH+H+將乙醛轉(zhuǎn)化為乙醇［31］。Yi等［32］報(bào)道ADH參與生物的鹽脅迫調(diào)控過(guò)程。推測(cè)淡紫紫孢菌中PlCYP6 通過(guò)與ADH1 互作降低體內(nèi)醛含量，進(jìn)而提高淡紫紫孢菌對(duì)鹽脅迫的耐受力。PlCYP6 具有一個(gè)Cyclophilin-like 結(jié)構(gòu)域和WD40 repeat 結(jié)構(gòu)域。其中，Cyclophilin 結(jié)構(gòu)域?yàn)橛H環(huán)蛋白發(fā)揮其功能的主要蛋白結(jié)構(gòu)域，而WD40 repeat 結(jié)構(gòu)域在真核生物中廣泛存在，其參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、免疫響應(yīng)等過(guò)程［33］，通常作為重要識(shí)別區(qū)域?yàn)榈鞍着c蛋白相互作用的提供平臺(tái)［34-35］。研究結(jié)果表明PlCYP6 的結(jié)構(gòu)域WD40 repeat 為其與ADH1 發(fā)生直接互作的關(guān)鍵區(qū)域，這與WD40 repeat 結(jié)構(gòu)域已報(bào)道的功能相符。

4 結(jié)論

本研究采用免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)從淡紫紫孢菌中鑒定到482 個(gè)受淡紫紫孢菌PlCYP6 特異捕獲的蛋白。酵母雙雜交試驗(yàn)證實(shí)，其中的ADH1 為PlCYP6 的候選互作蛋白，且PlCYP6 中的WD40 repeat 結(jié)構(gòu)域?yàn)槎唛g互作的關(guān)鍵區(qū)域。依據(jù)這482 個(gè)蛋白的GO 和KEGG 功能注釋分析結(jié)果推測(cè)PlCYP6 互作蛋白功能涉及細(xì)胞代謝，且ADH1 與PlCYP6 受NaCl 脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，這與ADH1 作為PlCYP6 的候選互作蛋白結(jié)果相符。