魏英 羅萌 戴良英 彭德良 劉敬

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院 植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室，長沙 410128；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

植物寄生線蟲是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要病原線蟲，每年造成全球超過上千億美元的損失［1-3］。已知的引起作物嚴重病害的植物寄生線蟲主要有根結(jié)線蟲（Meloidogyne）、孢囊線蟲（Heterodera）、滑刃線蟲（Aphelenchoides）、穿孔線蟲（Radophoius）、短體線蟲（Pratylenchus）、莖線蟲（Ditylenchus）、傘滑刃線蟲（Bursaphelenchus）等［4］。其中最為嚴重的是孢囊線蟲和根結(jié)線蟲引起的病害，孢囊線蟲大多具有寄主?；裕患纳谔囟ɑ蛴邢薜募闹髦参锷?，小麥（Triticum aestivum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、大 豆（Glycine max）和 甜 菜（Beta vulgaris）是受危害較為嚴重的作物。而根結(jié)線蟲的寄主范圍較廣，可同時寄生多種植物，包括熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)的多種糧食作物、蔬菜、水果、觀賞植物均受到根結(jié)線蟲侵染和危害。與分布范圍相似，根結(jié)線蟲不同種類的寄主范圍差異明顯［5-6］。香蕉穿孔線蟲（R. similis）廣泛分布在熱帶和亞熱帶的香蕉產(chǎn)區(qū)，是香蕉產(chǎn)業(yè)中的主要線蟲病害，為害香蕉最明顯的癥狀是引起倒伏。松材線蟲（B. xylophilus）對日本、韓國、葡萄牙和加拿大等國的林業(yè)造成了十分嚴重的危害，在我國也有發(fā)生 分布［7］。

植物寄生線蟲侵染寄主時，通過口針刺穿植物細胞壁，向寄主體內(nèi)分泌物質(zhì)來改變寄主細胞的結(jié)構(gòu)和功能，通常將這些分泌物稱為效應(yīng)蛋白［8］。隨著植物寄生線蟲與寄主互作研究體系的建立，已克隆多個效應(yīng)蛋白基因，并對其功能進行研究［9-10］。馬鈴薯白線蟲（Globodera pallida）效應(yīng)蛋白RHA1B是一種具有E3泛素連接酶活性的效應(yīng)蛋白［11］。甜菜胞囊線蟲（H.schachtii）效應(yīng)蛋白Hs10A07利用寄主修飾系統(tǒng)，磷酸化144號和231號的絲氨酸，在細胞質(zhì)到細胞核的運輸途徑中發(fā)揮作用［12］。擬禾本科根結(jié)線蟲（M. graminicola）效應(yīng)蛋白MgGPP通過寄主的翻譯后修飾途徑在細胞質(zhì)內(nèi)進行C端水解，在進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后進行自身N端糖基化，從而抑制寄主的免疫反應(yīng)，促進線蟲寄生［13］。鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）作為效應(yīng)蛋白首次在南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）中被發(fā)現(xiàn)，隨后其他植物寄生線蟲鈣網(wǎng)蛋白基因也陸續(xù)被克隆報道。但是對于更多的植物寄生線蟲鈣網(wǎng)蛋白的研究還相對較少，大多數(shù)的植物寄生線蟲鈣網(wǎng)蛋白的功能還不明確。因此，有關(guān)植物寄生線蟲鈣網(wǎng)蛋白的研究可能會成為線蟲與植物互作機制研究的一個重要方向。

1 鈣網(wǎng)蛋白家族

1974年，鈣網(wǎng)蛋白首次在兔骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)中被分離［14］。鈣網(wǎng)蛋白是一類高度保守且功能豐富的蛋白家族，廣泛存在于高等生物中，屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）滯留蛋白家族，在脊椎動物、無脊椎動物和高等植物中均能分離得到CRT，但目前認為在酵母菌和原核生物中不存在CRT基因［15-20］。它通常包含3個主要內(nèi)部結(jié)構(gòu)域：由球狀的N結(jié)構(gòu)域和兩個Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成。兩個Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域分別是高親和力但低容量的P域，以及低親和力但高容量的C域，且包含了ER保留信號（HDEL/KDEL）。N末端區(qū)（a1-180）氨基酸序列高度保守，P區(qū)（a181-280）富含脯氨酸，在CRT發(fā)揮分子伴侶功能時與底物結(jié)合，C末端區(qū)（aa291-400）呈強酸性［21-22］（圖1）。系統(tǒng)發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)，玉米、大麥、擬南芥等高等植物含有兩組不同的CRT：CRT1 / CRT2組和CRT3組［23-24］。這3種亞型的CRT均在擬南芥中有發(fā)現(xiàn)，擬南芥CRT亞型AtCRT1A與動物CRT相似，可作為分子伴侶和鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)劑［25-27］。前人對人、猴、鼠、雞、爪蟾、河豚、斑馬魚、文昌魚、海鞘、海膽和線蟲的CRT的進化進行了分析，無脊椎動物及尾索動物的CRT基因結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；而頭索動物文昌魚和脊椎動物的CRT基因結(jié)構(gòu)則相對穩(wěn)定，從無脊椎動物到脊椎動物CRT基因結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜和穩(wěn)定［20，28-29］。小麥白粉菌的CRT在高溫處理下表達量高于未經(jīng)高溫處理的，可能在這種不良條件下對小麥白粉菌起到一種保護作用［30］。植物寄生線蟲中，水稻干尖線蟲（A.besseyi）的AbCRT-1與松材線蟲的BxCRT-1高度相似，香蕉穿孔線蟲的Rs-CRT與南方根結(jié)線蟲的Mi-CRT高度相似，在進化樹上處于同一分枝。在NCBI進行對比，象耳豆根結(jié)線蟲和南方根結(jié)線蟲的鈣網(wǎng)蛋白具有高度相似性，同時與來自禾谷孢囊線蟲、短體線蟲、松材線蟲、香蕉穿孔線蟲、水稻干尖線蟲和馬鈴薯腐爛莖線蟲的鈣網(wǎng)蛋白的相似度也較高（圖2）。

圖1 鈣網(wǎng)蛋白的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of calreticulin

圖2 植物寄生線蟲鈣網(wǎng)蛋白進化關(guān)系示意圖Fig. 2 Schematic diagram of plant parasitic nematode CRTs evolution relationship

2 植物寄生線蟲鈣網(wǎng)蛋白的合成及分泌

2.1 鈣網(wǎng)蛋白在線蟲體內(nèi)的合成位點

南方根結(jié)線蟲的鈣網(wǎng)蛋白Mi-CRT是第一個從植物寄生線蟲鑒定獲得的鈣網(wǎng)蛋白，它是抑制宿主防御的效應(yīng)蛋白。原位雜交顯示Mi-CRT主要在侵染前二齡（J2）期線蟲的亞腹食道腺和寄生時期的背食道腺中表達，表明其主要在食道腺中合成［31］。在之后的研究中也發(fā)現(xiàn)效應(yīng)蛋白HaCRT1，一種禾谷孢囊線蟲所分泌的鈣網(wǎng)蛋白，也在食道腺中合成［32］。香蕉穿孔線蟲鈣網(wǎng)蛋白基因Rs-crt是多拷貝基因，在雌性的食道腺和性腺，幼蟲的腸和卵中均有表達［33］。類似的研究證實水稻干尖線蟲的鈣網(wǎng)蛋白AbCRT-1在特異性定位于食道腺和性腺內(nèi)，且都在食道腺和性腺內(nèi)表達［34］。除食道腺以外，鈣網(wǎng)蛋白在植物寄生線蟲的性腺、腸道、卵中合成。這些鈣網(wǎng)蛋白在植物線蟲不同的部位合成，可能與鈣網(wǎng)蛋白在不同線蟲中發(fā)揮的功能不同相關(guān)。

2.2 鈣網(wǎng)蛋白在線蟲不同齡期的發(fā)育表達

固著性內(nèi)寄生線蟲生活史通常分為6個階段，分別是卵（一齡幼蟲）、侵染前二齡（J2）和侵染后二齡（ParJ2）、三齡（J3）、四齡（J4）及成蟲（adult）。條件適宜時，卵孵化發(fā)育成J2幼蟲；J2齡幼蟲侵入根組織后，在根內(nèi)建立永久的取食位點（nematode feeding site，NFS），誘導(dǎo)根部細胞形成合胞體和巨細胞；J2線蟲在根內(nèi)逐漸發(fā)育成J3幼蟲，J4幼蟲，最后再蛻皮形成雌成蟲［7］。

明確植物寄生線蟲鈣網(wǎng)蛋白在不同齡期的表達量有助于了解其在線蟲寄生過程中的功能。對水稻干尖線蟲AbCRT-1進行qRT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)AbCRT-1在雌蟲中高表達，而在卵，幼蟲和雄蟲中表達水平低，與AbCRT-1高度同源的BxCRT-1在成蟲中表達量高于幼蟲，表明AbCRT-1 和BxCRT-1可能與線蟲的繁殖有關(guān)［34］。而qRT-PCR檢測表明，禾谷孢囊線蟲的HaCRT1在各齡期均有表達，在侵染后二齡幼蟲中最高，說明HaCRT1可能在的早期寄生過程中發(fā)揮作用［32］。Mi-CRT在四齡幼蟲和雌蟲均有表達，原位雜交顯示在四齡幼蟲背食道腺有很強的信號，因此認為Mi-CRT在南方根結(jié)線蟲侵入根組織和線蟲取食位點的形成過程中起著關(guān)鍵的作用［35-36］。香蕉穿孔線蟲的鈣網(wǎng)蛋白Rs-crt，在雌蟲的食道腺和性腺、雄蟲的性腺、幼蟲的腸和卵中均表達，并且在雌蟲中的表達最高。與雌性相比，雄性、幼蟲和卵中Rs-crt表達量較低，雄蟲中Rs-crt的表達明顯低于幼蟲和卵中的，幼蟲和卵之間未觀察到顯著差異［33］。以上表明，不同植物線蟲的鈣網(wǎng)蛋白不同齡期表達量不同，預(yù)示鈣網(wǎng)蛋白在植物寄生線蟲寄生寄主時發(fā)揮著不同的功能。

2.3 植物寄生線蟲鈣網(wǎng)蛋白在植物細胞中的定位

植物寄生線蟲侵染寄主時利用口針向寄主植物分泌效應(yīng)蛋白來改變植物細胞的結(jié)構(gòu)和功能來促進寄生［8，37］。目前，植物寄生線蟲缺乏遺傳操作技術(shù)，免疫組織定位是研究效應(yīng)蛋白分泌最直接的手段。在番茄和擬南芥根中對Mi-CRT的分泌進行免疫組織定位，在J3幼蟲的口針尖端清楚地檢測到Mi-CRT的積累，說明植物寄生線蟲在侵染寄主后會將Mi-CRT分泌到植物細胞中。另外，在組成取食部位的巨細胞的細胞壁上也觀察到Mi-CRT的積累。同時對南方根結(jié)線蟲整個寄生過程中的Mi-CRT在植物體內(nèi)的分泌進行了研究，結(jié)果表明J2幼蟲會把Mi-CRT分泌到植物組織中，最終分泌到NFS中，表明Mi-CRT對于NFS的形成和維持是必需的［31］。

Mi-CRT在本氏煙（Nicotiana benthamiana）葉片進行亞細胞定位，結(jié)果表明無信號肽Mi-CRT定位于煙草葉片細胞的細胞質(zhì)中，可能由于融合蛋白的被動擴散無信號肽Mi-CRT在細胞核中也檢測到信號。有信號肽 Mi-CRT定位于細胞質(zhì)中。此外，帶信號肽 Mi-CRT融合蛋白與ER和高爾基體標記的共定位，表明該蛋白進入了植物的分泌途徑。說明Mi-CRT的分泌信號肽在植物細胞中起作用，有信號肽 Mi-CRT通過植物分泌途徑被分泌到質(zhì)體中［31］。而禾谷孢囊線蟲的HaCRT1在煙草葉片細胞中的亞細胞定位顯示，帶有信號肽的和無信號肽的HaCRT1與均與ER標記的信號重疊，表明HaCRT1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，信號肽不影響其定位［32］。

3 植物寄生線蟲鈣網(wǎng)蛋白的功能

3.1 促進線蟲寄生

通 過HIGS（host-induced gene silencing）介 導(dǎo)的Mi-CRT沉默顯著降低了南方根結(jié)線蟲對擬南芥侵染，而過表達Mi-CRT的擬南芥對南方根結(jié)線蟲和及煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica）的易感性增強［31，35］。以上結(jié)論表明Mi-CRT在南方根結(jié)線蟲致病方面發(fā)揮重要作用。此外，香蕉穿孔線蟲經(jīng)Rs-crt的dsRNA處理36 h后，線蟲的生殖能力和致病性明顯降低。HIGS介導(dǎo)的Rs-crt沉默可以有效地傳遞給后代，而且也顯著降低了Rs-crt在線蟲體內(nèi)的表達并提高了轉(zhuǎn)基因番茄對香蕉穿孔線蟲的抗性［33］。因此，Rs-crt對擬南芥的繁殖和致病性至關(guān)重要。過表達HaCRT1影響擬南芥對丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）的抗性。過表達HaCRT1轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型相比，在接種后第3天，過表達HaCRT1轉(zhuǎn)基因株系的葉片上的病斑更加明顯，丁香假單胞菌繁殖量明顯增加。水稻干尖線蟲鈣網(wǎng)蛋白AbCRT-1特異性定位于食道腺和性腺內(nèi)，并在雌蟲中大量表達，瞬時基因沉默后線蟲的取食能力降低［34］。此外，在松材線蟲中，沉默鈣網(wǎng)蛋白基因Bxcrt后，松材線蟲的運動異常，并且該線蟲的繁殖能力下降，說明BxCRT-1對線蟲的繁殖十分重要［38］。以上結(jié)論說明在不適宜的環(huán)境壓力下，植物寄生線蟲需要鈣網(wǎng)蛋白促進自身寄生與繁殖。

3.2 抑制植物的免疫反應(yīng)

植物利用兩層先天免疫系統(tǒng)抵抗病原體的侵入，第一層是病原相關(guān)的分子模式觸發(fā)的免疫（PAMPtriggered immunity，PTI）；第二層是植物進化出的第二道防線，即效應(yīng)子觸發(fā)的免疫（effector-triggered immunity，ETI）［39-40］。為了分析Mi-CRT在根結(jié)線蟲寄生擬南芥中的作用，敲除Mi-CRT基因在線蟲中的表達降低了寄生蟲侵染擬南芥的能力。相反，過表達Mi-CRT的轉(zhuǎn)基因擬南芥更易受到根結(jié)線蟲的侵染。在過表達Mi-CRT擬南芥中，防御相關(guān)基因PAD4，WRKY33，F(xiàn)RK1和WRKY29的 轉(zhuǎn) 錄 水平降低，表明線蟲在寄生過程中Mi-CRT抑制寄主PTI［24，31］。同樣地，在野生型擬南芥中，flg22強烈誘導(dǎo)了PAD4，WRKY33，F(xiàn)RK1和WRKY29的表達，但是在過表達HaCRT1擬南芥中它們表達量顯著低于野生型植物，而且過表達HaCRT1擬南芥flg22誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS也低于野生型。以上結(jié)論說明禾谷孢囊線蟲HaCRT1抑制了PTI途徑。BAX表達可以引起的煙草葉片的細胞死亡，但BAX和HaCRT1的共表達沒有誘導(dǎo)細胞死亡，結(jié)果表明HaCRT1可以抑制煙草葉片中的BAX誘導(dǎo)的細胞死亡［32］。但是HaCRT1抑制細胞死亡的具體機制還不清楚，是否通過抑制細胞死亡來調(diào)控寄主免疫來促進寄生需要進一步研究。

3.3 干擾Ca2+信號傳導(dǎo)

鈣網(wǎng)蛋白屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留蛋白家族，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是Ca2+儲存的重要部位。Ca2+通常作為第二信使，在動植物細胞的眾多信通路中都起著至關(guān)重要的作用［22］。存儲在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+可以與緩沖和釋放Ca2+的特定蛋白質(zhì)結(jié)合在一起并控制其局部濃度。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣網(wǎng)蛋白具有兩個主要功能：伴侶蛋白和調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)［15，41］。

已經(jīng)有研究表明植物CRT是主要的Ca2+結(jié)合蛋白，并且在細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)和信號傳導(dǎo)中發(fā)揮作用［42］。蓖麻子CRT含有兩個鈣結(jié)合位點，其CRT也在細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)中起重要作用［43］。過表達ZmCRT的轉(zhuǎn)基因擬南芥對Ca2+消耗低于野生型植物，轉(zhuǎn)基因植物在缺Ca2+的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，顯示出葉綠素損失延遲。表明ZmCRT的過量表達增加了Ca2+的緩沖能力，并且該Ca2+儲備在生物學(xué)上可用于植物的生長發(fā)育和對脅迫的反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)植物寄生線蟲的鈣網(wǎng)蛋白也會影響植物細胞內(nèi)的Ca2+的濃度變化，在野生型和過表達HaCRT1擬南芥中表達水母發(fā)光蛋白（aequorin），利用水母發(fā)光蛋白進行 Ca2+濃度標定。用NaCl處理幼苗，植物體內(nèi)的Ca2+濃度迅速上升形成峰值，發(fā)現(xiàn)過表達HaCRT1擬南芥的Ca2+濃度峰值明顯高于野生型。盡管研究表明HaCRT1可能通過影響Ca2+信號傳導(dǎo)來抑制植物免疫，但是HaCRT1是否具有Ca2+結(jié)合的特性，如何調(diào)節(jié)植物細胞內(nèi)Ca2+濃度還不清楚。

4 問題與展望

有關(guān)鈣網(wǎng)蛋白的研究主要在哺乳動物、高等植物、寄生于動物的寄生蟲等中研究較多，在植物寄生線蟲中的研究還比較少。植物寄生線蟲鈣網(wǎng)蛋白的研究，目前已知的有水稻干尖線蟲鈣網(wǎng)蛋白AbCRT-1、松材線蟲鈣網(wǎng)蛋白BxCRT-1、南方根結(jié)線蟲鈣網(wǎng)蛋白Mi-CRT、禾谷孢囊線蟲鈣網(wǎng)蛋白HaCRT1、香蕉穿孔線蟲的鈣網(wǎng)蛋白Rs-CRT、短體線蟲鈣網(wǎng)蛋白、馬鈴薯腐爛莖線蟲鈣網(wǎng)蛋白和象耳豆根結(jié)線蟲鈣網(wǎng)蛋白。AbCRT-1包含多個短的內(nèi)含子，它參與應(yīng)激適應(yīng)，行為模式和生殖。與其高度相似的BxCRT-1只有2個長的內(nèi)含子，但BxCRT-1是否與松材線蟲的寄生有關(guān)還不清楚。AbCRT-1和Mi-CRT結(jié)構(gòu)是相似的，雖然RANi介導(dǎo)的AbCRT-1和Mi-CRT都能降低線蟲的繁殖能力，但Mi-CRT作為效應(yīng)蛋白被分泌到寄主體內(nèi)抑制寄主的防御免疫反應(yīng)。HaCRT1具有與Mi-CRT相似的功能，可以抑制植物的免疫反應(yīng)、促進線蟲寄生、抑制Bax引起的細胞壞死等。HaCRT1和Mi-CRT在植物內(nèi)的互作靶標還未找到，所以植物寄生線蟲鈣網(wǎng)蛋白作為效應(yīng)蛋白抑制寄主免疫防御反應(yīng)的分子機制仍不清楚。綜述所屬鈣網(wǎng)蛋白對線蟲的寄生、發(fā)育及繁殖具有重要作用，并且會降低植物的免疫力。但是植物寄生線蟲鈣網(wǎng)蛋白的作用機制并不清楚，例如是否具有Ca2+結(jié)合特性，作為效應(yīng)蛋白在寄主體內(nèi)調(diào)控的信號通路。因此，拓展植物寄生線蟲鈣網(wǎng)蛋白的研究范圍和深度，明確鈣網(wǎng)蛋白促進線蟲寄生的功能和分子機制，對于深入揭示線蟲寄生植物的分子機制和綠色防控植物寄生線蟲具有重要意義。