陳倩 張露源 陳伯昌 吳海燕

（廣西農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004）

大豆是全球糧食安全的重要作物，每年因大豆病害造成了嚴(yán)重?fù)p失，其中大豆孢囊線蟲(chóng)?。⊿CN，Soybean cyst nematode，Heterodera glycines）是 危 害大豆最嚴(yán)重的病原之一［1-2］，在世界上各大豆產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，中國(guó)、美國(guó)、加拿大、巴西、阿根廷、俄羅斯等大豆生產(chǎn)國(guó)廣泛發(fā)生，每年造成大豆減產(chǎn)10%左右［3］，給世界大豆造成的產(chǎn)量損失在900萬(wàn)t以上，在中國(guó)，截止到2015年共有23個(gè)?。ㄊ?自治區(qū)）相繼發(fā)現(xiàn)大豆孢囊線蟲(chóng)［4］，使大豆產(chǎn)量大大降低，影響豆類作物生產(chǎn)安全［5］。

目前，防治植物線蟲(chóng)病害仍以化學(xué)防治為主，但隨之也帶了許多問(wèn)題，如環(huán)境污染、抗藥性問(wèn)題等，許多高毒高殘留的化學(xué)殺線蟲(chóng)劑如溴甲烷［6-7］、呋喃丹［8］等已被禁用。隨著人們環(huán)保意識(shí)逐步提高，尋求低毒、低殘留、對(duì)環(huán)境友好的生物制劑越來(lái)越受到關(guān)注，并成為防治植物線蟲(chóng)病害的關(guān)注熱點(diǎn)。近年，菲律賓、中國(guó)、美國(guó)、南非、印度、加拿大等國(guó)登記注冊(cè)了以淡紫擬青霉為活性成分的菌劑來(lái)防治植物線蟲(chóng)［9］。淡紫擬青霉菌和蓖麻油防治獼猴桃幼苗的根結(jié)線蟲(chóng)病，防治效果分別在55%和73.61%以上，防效良好［10］。芽孢桿菌Sneb207可降低大豆孢囊線蟲(chóng)孢囊、幼蟲(chóng)以及卵的數(shù)量，還可促進(jìn)大豆植株的生長(zhǎng)［11］；芽胞桿菌BL-21與HNDF2的混合菌液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)孢囊孵化的相對(duì)抑制率達(dá)到了80.93%，對(duì)2齡幼蟲(chóng)（J2）的校正死亡率也達(dá)到91.08%［12］。研究報(bào)道疣孢漆斑菌的發(fā)酵產(chǎn)物二萜化合物實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化［13］，廣泛應(yīng)用于高價(jià)值水果、蔬菜和觀賞作物，對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)、禾谷類孢囊線蟲(chóng)、短體線蟲(chóng)等十余種線蟲(chóng)有防效［14］；疣孢漆斑菌麥芽提取物液體可有效減少番茄根部根結(jié)數(shù)以及土壤中根結(jié)線蟲(chóng)的數(shù)量［15］；然而，我國(guó)該方面的研究進(jìn)展較慢，僅報(bào)道菌株X-16可有效控制北方根結(jié)線蟲(chóng)群體［16］。本研究在明確疣孢漆斑菌ZW-2菌株發(fā)酵液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)有毒殺作用的基礎(chǔ)上［17］，通過(guò)篩選菌株活性物質(zhì)產(chǎn)生的最佳發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、裝瓶量、pH以及培養(yǎng)基的最佳營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，確定其產(chǎn)生殺線蟲(chóng)活性代謝產(chǎn)物的最優(yōu)培養(yǎng)條件，并且利用代謝組分析ZW-2菌株代謝物質(zhì)中的活性成分，為開(kāi)發(fā)和應(yīng)用M. verrucariaZW-2菌株的殺線蟲(chóng)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 ZW-2菌株學(xué)名為Myrothecium verrucaria，GenBank登錄號(hào)KR708633。保存在中國(guó)菌種保藏中心（登記號(hào)CCTCC NO：M 2015522）。

1.1.2 供試線蟲(chóng) 供試線蟲(chóng)為大豆孢囊線蟲(chóng)（Heterodera glycines，4號(hào)生理小種），收集接種大豆孢囊線蟲(chóng)后35 d后的大豆植株（品種為魯豆4號(hào)）根系上新鮮孢囊，用70%酒精消毒3 min，無(wú)菌水沖洗4次，在立體顯微鏡下，用玻璃棒將300目孵化篩中的孢囊碾碎分解，加少許滅菌水，得到卵懸浮液。將孵化篩置于25℃的智能光照培養(yǎng)箱中避光孵化，收集新鮮的J2用于當(dāng)天的試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 基礎(chǔ)發(fā)酵液制備 25℃恒溫條件下，菌株ZW-2在PDA平板（直徑為9 cm）培養(yǎng)5 d后，用直徑為6 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌塊，將菌塊轉(zhuǎn)接至裝有100 mL Czapek培養(yǎng)液（NaNO32.00 g，KCl 0.50 g，F(xiàn)eSO40.01 g，K2HPO41.00 g，MgSO40.50 g，蔗糖30.0 g，H2O 1 000 mL）的250 mL錐形瓶中，置于28℃、160 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)14 d，發(fā)酵液通過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾獲得發(fā)酵濾液。

1.2.2 發(fā)酵液殺蟲(chóng)活性檢測(cè) 在96孔板中，每孔中大豆孢囊線蟲(chóng)J2（24 h內(nèi)收集的）約50條左右，并加入200 μL菌株ZW-2發(fā)酵濾液，以滅菌蒸餾水為對(duì)照（由于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明培養(yǎng)基和滅菌水對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)無(wú)顯著影響［17］，故本研究?jī)H設(shè)滅菌水為對(duì)照），每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)，將96孔板置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每隔6、12、24、48、72 h在顯微鏡下觀察記錄線蟲(chóng)的死亡數(shù)量，并計(jì)算出死亡率。線蟲(chóng)死亡判定標(biāo)準(zhǔn)：線蟲(chóng)僵直，且用毛針刺激后不活動(dòng)，確定線蟲(chóng)死亡。

死亡率=（死亡J2總數(shù)/處理J2總數(shù)）×100%

校正死亡率=（處理組死亡率-對(duì)照組死亡率）/（1-對(duì)照組死亡率）×100%

1.2.3 發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基pH以及裝瓶量對(duì)發(fā)酵液殺蟲(chóng)活性的影響 為了篩選出菌株ZW-2的最佳發(fā)酵條件，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基pH以及裝瓶量作為4個(gè)因素，設(shè)置發(fā)酵溫度（A1=26℃、A2=28℃、A3=30℃）、發(fā)酵轉(zhuǎn)速（B1=140 r/min、B2=160 r/min、B3=180 r/min）、培養(yǎng)基pH（C1=6、C2=7、C3=8）以及裝瓶量（D1=75 mL、D2=100 mL、D3=125 mL）進(jìn)行4因素3水平的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，然后按照1.2.2的方法培養(yǎng)：培養(yǎng)菌株1周（前期試驗(yàn)表明培養(yǎng)菌株1周、2周、3周發(fā)酵濾液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)死亡率無(wú)顯著差異，故選用發(fā)酵1周進(jìn)行試驗(yàn)）后，發(fā)酵液稀釋5倍［17］，0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾，通過(guò)測(cè)定對(duì)大豆孢囊的毒殺作用，篩選最優(yōu)組合后做碳氮源的優(yōu)化。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：菌株ZW-2發(fā)酵濾液處理大豆孢囊線蟲(chóng)72 h的死亡率。

1.2.4 營(yíng)養(yǎng)條件優(yōu)化 碳源篩選：用葡萄糖、麥芽糖和可溶性淀粉3種碳源替代基礎(chǔ)發(fā)酵液培養(yǎng)基（Czapek培養(yǎng)基）中的蔗糖作為碳源，其他成分不變。發(fā)酵方法同1.2.1，搖床溫度28℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min。培養(yǎng)菌株1周后，發(fā)酵液稀釋5倍，0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾，通過(guò)測(cè)定殺線活性試驗(yàn)，方法同1.2.2，滅菌水為對(duì)照。進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

氮源篩選：用氯化銨、牛肉膏和硫酸銨這3種氮源替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（Czapek培養(yǎng)基）中的硝酸鈉作為氮源，其它成分保持不變。發(fā)酵方法同1.2.1，搖床溫度28℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min。培養(yǎng)菌株1周后，發(fā)酵液稀釋5倍，0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾，測(cè)定殺線活性方法同1.2.2，滅菌水為對(duì)照。進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。篩選出最佳碳源，最后根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果篩選出最佳碳源和氮源。

正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)：根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳碳源A（A1=20 g、A2=25 g、A3=30 g、A4=35 g、A5=40 g）和氮源B（B1=1.0 g、B2=1.5 g、B3=2.0 g、B4=2.5 g、B5=3.0 g）進(jìn)行2因素5水平的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵方法同1.2.1，搖床溫度28℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min。培養(yǎng)1周后取出，將發(fā)酵液稀釋5倍，用0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾后，進(jìn)行殺線活性測(cè)定，方法同1.2.2，以滅菌水為對(duì)照。此試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 ZW-2菌株發(fā)酵液的代謝產(chǎn)物殺線蟲(chóng)活性成分研究 將1.2.1得到的8 L菌株ZW-2液體發(fā)酵液濾液過(guò)濾后旋蒸濃縮至500 mL，由正丁醇萃取的粗提產(chǎn)物經(jīng)甲醇凝膠柱層析分離收集得到不同的流分，每隔2 min收集一次洗脫液。洗脫液各極性組分可通過(guò)薄層色譜法（TCL）分析檢測(cè)，經(jīng)顯色的斑點(diǎn)不同指引合并，純化后篩選殺線蟲(chóng)效果最好的流分進(jìn)行化合物代謝組學(xué)分析。

應(yīng)用超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)72 h死亡率達(dá)到了80%以上的流分加以處理進(jìn)行代謝物質(zhì)鑒定。色譜條件為流動(dòng)相A相為水和0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B相為甲醇溶液，進(jìn)樣量2 μL，洗脫條件為：0-10.00 min，90.0% A（V∶V，下同），10.0% B；10.00-12 .00 min，5.0%A，95.0%B；12.10-15.00 min，90.0%A，10.0%B。質(zhì)譜掃描模式為MSECentroid，正、負(fù)離子。離子源為ESI。質(zhì)量掃描范圍：100-1 200 Da。毛細(xì)血管電壓設(shè)置為3 Kv，離子源溫度設(shè)置為100℃，脫溶劑氣體溫度設(shè)置為450℃，氣體流速設(shè)置為650 L/h，錐孔氣體流量設(shè)置為50 L/h。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 用SPSS 19.0進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差分析，根據(jù)Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn)P＜ 0.05水平下的差異顯著性，用Sigmaplot10.0作圖。

根據(jù)多元統(tǒng)計(jì)分析（PLS-DA）結(jié)果得到的變量權(quán)重值選擇差異變量。通過(guò)UNIFI Protal軟件分析，ProgenesisQI作圖，之后通過(guò)代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG、PlantCyc等）確認(rèn)差異物及其結(jié)構(gòu)式。

2 結(jié)果

2.1 菌株ZW-2殺線蟲(chóng)活性發(fā)酵液條件優(yōu)化分析

2.1.1 發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基pH以及裝瓶量對(duì)發(fā)酵液殺蟲(chóng)活性的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)ZW-2菌株發(fā)酵液殺線效果影響的重要因素依次為因素B（搖床轉(zhuǎn)速）、因素A（發(fā)酵溫度）、因素D（裝瓶量）和因素C（培養(yǎng)基pH）。并且當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵溫度為28℃，裝瓶量為100 mL，培養(yǎng)基pH為8（表1）時(shí)，殺線效果最好，為菌株ZW-2發(fā)酵液的最佳發(fā)酵條件。

表1 不同發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基pH和裝瓶量的ZW-2菌株發(fā)酵液處理大豆孢囊線蟲(chóng)J2校正死亡率Table 1 Adjusted mortality rate of H. glycines J2 treated with ZW-2 strain fermentation broth under different fermentation temperature，shaking speed，medium pH and bottle volume

2.1.2 菌株ZW-2發(fā)酵液碳源和氮源種類殺線蟲(chóng)活性優(yōu)化 菌株ZW-2在不同成分碳源條件的Czapek培養(yǎng)基中發(fā)酵1周5倍稀釋濾液處理大豆孢囊線蟲(chóng)SCN毒殺效果顯著（P＜0.05），均隨時(shí)間的增加死亡率逐漸升高，72 h后大豆孢囊線蟲(chóng)的死亡率達(dá)到了87.00%以上。72 h菌株ZW-2的發(fā)酵液處理大豆孢囊線蟲(chóng)J2后，死亡率最高的處理是以蔗糖以及淀粉作為培養(yǎng)基碳源，死亡率分別為96.29%和93.35%，殺線效果顯著高于其他處理及滅菌水對(duì)照（P＜ 0.05）（圖1）。

圖1 菌株ZW-2在不同碳源培養(yǎng)基中發(fā)酵1周的5倍稀釋發(fā)酵液處理大豆孢囊線蟲(chóng)J2校正死亡率Fig.1 Adjusted mortality rate of H. glycines J2 treated with 5-fold diluted fermentation broth of strain ZW-2 in different carbon source medium for 1 week

菌株ZW-2在不同氮源條件的Czapek培養(yǎng)基中發(fā)酵1周，培養(yǎng)菌株ZW-2獲得的5倍稀釋濾液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)J2毒殺效果顯著（P＜0.05）（圖2），當(dāng)以硝酸鈉、硫酸銨、牛肉膏和蛋白胨作為培養(yǎng)基的氮源時(shí)，死亡率隨時(shí)間的增加而增加。當(dāng)?shù)礊槁然@時(shí)，處理72 h發(fā)酵濾液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)J2的毒殺效果低于處理48 h，此時(shí)存在部分線蟲(chóng)活動(dòng)能力恢復(fù)的現(xiàn)象。當(dāng)?shù)礊橄跛徕c、牛肉膏和蛋白胨時(shí)，72 h發(fā)酵濾液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)J2 的毒殺效果最好，死亡率分別為96.29%、88.01%和91.36%，并且與對(duì)照組相比，死亡率明顯升高，差異效果顯著（P ＜0.05）。但由于經(jīng)濟(jì)效益的影響，最終選擇蔗糖以及硝酸鈉作為培養(yǎng)基的最佳碳源以及最佳氮源。

圖2 菌株ZW-2在不同氮源培養(yǎng)基中發(fā)酵1周的5倍稀釋發(fā)酵液處理大豆孢囊線蟲(chóng)J2校正死亡率Fig.2 Adjusted mortality rate of H. glycines J2 treated with 5-fold diluted fermentation broth of strain ZW-2 in different nitrogen source medium for 1 week

2.2 菌株ZW-2發(fā)酵液代謝產(chǎn)物殺線蟲(chóng)活性成分研究

發(fā)酵液旋蒸萃取洗脫后，洗脫液根據(jù)TLC檢測(cè)和紫外分析檢測(cè)的斑點(diǎn)合并后得到的組分，經(jīng)檢測(cè)后對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)具有毒殺作用，72 h后線蟲(chóng)死亡率達(dá)到了87.65%，與對(duì)照組相比，毒殺效果顯著。

利用UPLC-Q-TOF對(duì)ZW-2菌株發(fā)酵液流分以及溶于甲醇的Czapek培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)照檢測(cè)，對(duì)主要的差異性物質(zhì)通過(guò)PCA和PLS-DA法進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，分析組間的差異性以及組內(nèi)的重復(fù)穩(wěn)定性，再通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行人工對(duì)比，對(duì)檢測(cè)中的可能性的差異性物質(zhì)進(jìn)行推測(cè)。

由圖3可知，對(duì)照組和流分分布在不同的區(qū)間，兩者之間差異顯著，分離趨勢(shì)比較明顯，同一處理能夠近距離聚焦，能較好地區(qū)分流分與對(duì)照，這初步說(shuō)明數(shù)據(jù)有效可信。我們可以進(jìn)一步采用PLS-DA法差異性代謝物進(jìn)行判別檢測(cè)。由PLS-DA模型的變量重要性投影值（VIP）值的各代謝物積累差異的影響強(qiáng)度以及解釋能力，綜合顯著性檢驗(yàn)結(jié)果，對(duì)潛在的差異性代謝物進(jìn)行分析，準(zhǔn)確的反映標(biāo)志性代謝物信息。

圖3 ZW-2菌株液體發(fā)酵液流分正離子（A）和負(fù)離子（B）PCA散點(diǎn)圖Fig. 3 PCA score plot of positive（A）and negative（B）ions in the fermentation broth of strain ZW-2

由PLS-DA結(jié)果及獲得的多變量分析模型的變量重要性投影值（VIP）初步篩選出差異代謝物，得到4 393個(gè)物質(zhì)數(shù)據(jù)矩陣，以碎片正負(fù)離子得分以及發(fā)酵液活性物質(zhì)性質(zhì)以及物質(zhì)功能，篩選出具有發(fā)酵液活性成分的20個(gè)物質(zhì)。

同時(shí)通過(guò)檢測(cè)出的正負(fù)離子特征經(jīng)分析在ChemSpider數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)比可得，篩選出物質(zhì)為脂肪族化合物，如脂肪酸脂類、醇與多元醇、醚類、酯類化合物等。標(biāo)志性差異物質(zhì)可能是磷酸三（丁氧基乙基）酯，NP-40（乙基苯基聚乙二醇）、六聚乙二醇單十二醚、氟氯菊酯、verrucarin A、roridin A、verruculogen、三月桂胺等（表2）。

表2 標(biāo)志性差異物中可能發(fā)酵液活性物質(zhì)列表Table 2 List of possible fermentation broth active substances in differences iconic objects

3 討論

近年來(lái)利用微生物的代謝產(chǎn)物來(lái)防治病害越來(lái)越受到人們的關(guān)注，篩選出生長(zhǎng)速率快、產(chǎn)孢量高、安全高效的菌株具有重要意義以及應(yīng)用價(jià)值［18］。本試驗(yàn)所選用的疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria），抑菌譜較廣［19］，抑菌活性較強(qiáng)［20-21］，可用于防治植物寄生線蟲(chóng)［22］，同時(shí)對(duì)野葛、馬齒莧、長(zhǎng)芒莧等雜草具有生物除草活性［23］。因此，疣孢漆斑菌的代謝產(chǎn)物具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量顯著影響了生防菌的生防效用。發(fā)酵的溫度、轉(zhuǎn)速、pH、裝瓶量及培養(yǎng)基的碳源氮源等都影響菌株的生長(zhǎng)以及代謝產(chǎn)物的活性［24-25］。人們可通過(guò)優(yōu)化生防菌發(fā)酵液培養(yǎng)條件，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)以及提高菌株的防效［26］，促進(jìn)毒殺根結(jié)線蟲(chóng)J2活性物質(zhì)的產(chǎn)生［27］。拮抗根結(jié)線蟲(chóng)的微白黃鏈霉菌Streptomyces albidoflavus以燕麥片為碳源、酵母粉為氮源，培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速210 r/min，培養(yǎng)4 d，起始pH 7，裝液量75 mL時(shí)毒殺線蟲(chóng)活性達(dá)93.29%，提高了8.93個(gè)百分點(diǎn)［28］。微白黃鏈霉菌 G-1發(fā)酵液在8% 麥芽糖、馬鈴薯 16.5%、pH 6.5、溫度 30℃、轉(zhuǎn)速 160 r/min、發(fā)酵 5 d的條件下抗真菌活性提高，抗菌物質(zhì)增加［29］。粉紅螺旋聚孢屬NF-06固體發(fā)酵液培養(yǎng)條件pH為7，含水量40%，接種量5%時(shí)，產(chǎn)孢量增加，南方根結(jié)線蟲(chóng)數(shù)量以及番茄根結(jié)數(shù)有效降低［30］；芽孢桿菌SMrs在發(fā)酵48 h，溫度28℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，裝液量30 mL，初始pH 7.2時(shí)，殺線蟲(chóng)活性明顯提高［31］。

代謝組學(xué)（metabolomics）是對(duì)生物代謝物質(zhì)的分析［32］，可用于疾病診斷藥物鑒定、植物代謝以及抗逆響應(yīng)機(jī)制等［33］。本研究通過(guò)對(duì)M. verrucariaZW-2菌株發(fā)酵液進(jìn)行代謝組分析，在試驗(yàn)中經(jīng)代謝組分析得到Verrucarin A、Roridin A等20種可能與殺蟲(chóng)殺線蟲(chóng)有關(guān)的標(biāo)志物。羌活體內(nèi)生菌疣孢漆斑菌的發(fā)酵液中分離純化得到了Verrucarin B、8-acetoxyroridin H、Verrucarin M、Verrucarin J、Roridin D、Verrucarin L acetate、Isororidin E、Oridin E、Roridin H、Roridin A、Roridin E acetate、Isotrichoverrin A、Isotrichoverrin B、Verrucarin A等14種化合物，在1 000 ppm濃度下除Isotrichoverrin A均具有良好的殺蟲(chóng)活性，對(duì)綠棉鈴蟲(chóng)致死率在70%以上［21］；從土壤分離的漆斑菌Myrotheciumsp. KX136897液體發(fā)酵后純化鑒定出Verrucarins A、Roridin D、Roridin A、Verrucarin J、Roridin A、Verrucarin B等，其 中Roridin D對(duì) 大 腸 桿 菌有弱抑菌活性、Roridin A對(duì)蠟狀芽孢桿菌和鰻弧菌也具有抑菌活性［34］；Nguyen等［15］從疣孢漆斑菌KACC40321菌株的丙酮提取物中分離得到Verrucarin A和Roridin A具有殺南方根結(jié)線蟲(chóng)J2的活性；Murakami等［35］從來(lái)自土壤的Myrothecium verrucaria中分離得到Roridin L、Roridin M、Verrucarin M；將疣孢漆斑菌IT6菌株接種在菠菜上可產(chǎn)生Verrucarin A and Roridin E［36］；本研究通過(guò)代謝組分析發(fā)現(xiàn)ZW-2菌株發(fā)酵液中有多種與殺蟲(chóng)相關(guān)的物質(zhì)，其中Verruculogen，是一種過(guò)氧化物的生物堿［37］；氟氯菊酯（聯(lián)苯菊酯）是一種擬除蟲(chóng)菊酯類［38］，可防治小麥蚜蟲(chóng)［39］、白蟻［40］等農(nóng)田害蟲(chóng)；三月桂胺可用作萃取劑負(fù)載液膜去除工業(yè)廢水中的砷［41］。但Verruculogen、氟氯菊酯、三月桂胺等物質(zhì)是否具有殺線蟲(chóng)功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，董海龍等［22］從疣孢漆斑菌X-16代謝產(chǎn)物中分離出了 3-異丁基六氫吡咯并［1，2-a］吡嗪-1，4-二酮和乙酸丁酯，對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)J2有較好的毒殺活性。但本研究中未檢測(cè)到該物質(zhì)，原因可能是分離提取方法不同。因此，本研究的疣孢漆斑菌ZW-2菌株代謝組中標(biāo)志性差異物，為深入研發(fā)該生防菌株提了供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化菌株ZW-2發(fā)酵液毒殺大豆孢囊線蟲(chóng)活性的培養(yǎng)條件，最優(yōu)條件為：以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，最佳培養(yǎng)溫度為28℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，裝瓶量為100 mL，培養(yǎng)基pH為8，以蔗糖和硝酸鈉為碳源和氮源。通過(guò)代謝組學(xué)分析，共篩選出20種差異代謝物，包括酰胺類化合物和脂肪族化合物，這些差異代謝物可能是疣孢漆斑菌具有殺線蟲(chóng)活性的標(biāo)志物，研究結(jié)果可為進(jìn)一步探索疣孢漆斑菌ZW-2菌株發(fā)酵生產(chǎn)以及精深加工提供參考依據(jù)。