柴華 李上云 宋丹陽 陳晴燕（沈陽市第七人民醫(yī)院皮膚科，沈陽110003）

皮膚鱗狀細胞癌是常見的皮膚惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年增長趨勢，危害人類生命健康［1］。由于皮膚鱗狀細胞癌在臨床和組織病理學上的多樣性，通常容易被誤診。皮膚鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多階段、多基因參與的過程，因此，尋找在該疾病發(fā)病過程中發(fā)揮關鍵調控作用的分子對鱗癌的診斷和治療具有重要意義［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類小分子非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)（3′UTR）結合，抑制靶mRNA翻譯或降解靶mRNA，從而在轉錄水平調控基因表達，參與心血管、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展［3-4］。研究顯示，miR-22-3p在結直腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌等腫瘤中表達異常表達，參與調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為，是腫瘤治療的潛在靶點［5-7］。目前，miR-22-3p在皮膚鱗狀細胞癌中的作用還未知。Targetscan生物信息學軟件預測顯示，結構蛋白家族1（fectonic family member，TCTN1）的3′UTR與miR-22-3p的核苷酸序列存在連續(xù)的結合位點，提示miR-22-3p可能調控TCTN1表達。TCTN1屬于結構蛋白家族成員，也參與結腸癌、膠質瘤、食管鱗狀細胞癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展［8-10］。但TCTN1對皮膚鱗狀細胞癌的影響尚不明確。本研究主要探討了miR-22-3p對皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖和凋亡的影響及其可否通過調控TCTN1表達發(fā)揮作用，以期為皮膚鱗狀細胞癌的靶向治療提供新靶點。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 組織樣本選取2014年4月至2018年9月整形外科手術切除并經病理學確診的35例皮膚鱗狀細胞癌為研究對象，其中男性21例，女性14例，年齡37～75歲，平均年齡（56.39±4.81）歲。高分化15例，中分化11例，低分化9例；發(fā)生淋巴結轉移14例，未發(fā)現(xiàn)遠處器官轉移21例。所有患者術前均未進行放化療等治療。同時以35例正常皮膚組織為對照，男性19例，女 性16例，年 齡35～71歲，平 均 年 齡（54.59±5.21）歲。兩組年齡、性別等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究經本院倫理委員會批準同意，患者或家屬自愿簽署知情同意書。

1.1.2 細胞和實驗試劑皮膚鱗狀細胞癌A431細胞，中國科學院上海細胞庫；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和RPMI1640培養(yǎng)基，美國Gibco公司；四甲基噻唑藍（methylthiazoletrazolium，MTT）和胰蛋白酶，美國Sigma公司；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，深圳晶美生物工程有限公司；膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡試劑盒和二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；兔抗人細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細胞增殖因子-67（Ki-67）多克隆抗體，美國Santa Cruz公司；兔抗人活化的caspase-3（Cleaved caspase-3）多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；LipofectamineTM2000試劑盒，美國Invitrogen公司；PCR引物，上海生工生物工程有限公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒，美國Promega公司；miR-22-3p模擬物mimics（5′-CUGAACGUCGTAGUUCGTUCUAU-3′）及模擬陰性序列（5′-CCCGUGCUGAUAGAUCGUAAACGUC-3′）、miR-22-3p抑制劑（5′-GCUCGCGUUAGAAUAGUAAGCUGUCC-3′）及陰性序列（5′-CUUGGCCGCUGCUAGACGUAGCUCC-3′）、TCTN1的小干擾RNA（5′-GCUCAGAUGCAUCAGUUCCUUCUCGUGAUAUC-3′）及亂序無意義陰性序列（5′-UUCUCCGAACGTGUCGCUGGACGU-3′）、TCTN1過表達載體（5′-TGGCCGATGCTAGCTGCCGGGTCCA-3′）和空載體（5′-TGGCGAATGGCGTGGCACGTGGGG-3′），廣州市銳博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)A431細胞復蘇后，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、CO2體積分數(shù)5%、濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據細胞生長狀況，每2～3 d更換1次新鮮的培養(yǎng)基。待細胞匯合至80%～90%時，吸棄培養(yǎng)基，加入適量預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細胞。吸棄PBS，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞分組和轉染對數(shù)生長期的A431細胞以1×105個/孔接種于6孔板，待細胞匯合至60%時，更換無FBS的培養(yǎng)基。分別將miR-22-3p mimics（miR-22-3p組）及陰性對照（miR-NC組）、miR-22-3p抑制劑（anti-miR-22-3p組）及陰性對照（anti-miR-NC組）、TCTN1的小干擾RNA（si-TCTN1組）及陰性對照（si-NC組）以及miR-22-3p mimics與TCTN1過表達載體（miR-22-3p+pcDNA-TCTN1組）、miR-22-3p mimics與空載體（miR-22-3p+pcDNA組）轉染至A431細胞。具體操作過程參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書。轉染48 h后，qRT-PCR和Western blot分別檢測miR-22-3p和TCTN1蛋白評價轉染效果，并收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 qRT-PCR檢 測miR-22-3p和TCTN1 mRNA表達水平Trizol試劑提取組織或細胞中總RNA，經微量核酸儀檢測純度和濃度后，參照逆轉錄試劑盒操作說明，將其逆轉錄為cDNA。然后以cDNA為模板，進行PCR擴增。miR-22-3p上游5′-AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGTA-3′，下游5′-TTGGCGAATGCCAATGGCCGGCCA-3′；U6上 游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-GGCTTCCCGAATGCAAGC-3′；TCTN1上游5′-CCTTTGCGTGAATGTTGTTC-3′，下游5′-AGAGGGACTGGCTGGGTATT-3′；β-actin上游5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游5′-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3′。PCR擴增條件：95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共35個循環(huán)。miR-22-3p以U6為內參，TCTN1以β-actin為內參，采用2－ΔΔCt法計算miR-22-3p和TCTN1 mRNA的相對表達水平。

1.2.4 Western blot法檢測蛋白表達RIPA蛋白裂解液裂解細胞，12 000 r/min離心10 min，上清液即為總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白，加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。蛋白變性后，以每泳道30μg蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后，轉至聚偏乙烯二氟膜。轉膜后，將膜置于5%脫脂牛奶中進行封閉1 h。分別加入CyclinD1（1：600）、Ki-67（1：800）、Cleaved caspase-3（1：400）一抗，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗IgG（1：400），37℃孵育1 h。加入ECL顯影液，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.5 MTT檢測細胞增殖各組轉染后的A431細胞以1×103個/孔接種于96孔板，于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μl濃度為5 g/L的MTT溶液。培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后，吸棄培養(yǎng)基，加入150μl二甲基亞砜，振蕩混合均勻，于酶標儀490 nm處測定光密度（optical density，OD）值。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡各組轉染后的A431細胞以1×104個/孔接種于24孔板。培養(yǎng)48 h后，胰酶消化，收集細胞。取1×106個細胞，PBS清洗后，加入400μl結合緩沖液。輕輕吹打混懸細胞后，加入10μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。再加入5μl PI，室溫避光孵育5 min。最后加入100μl結合緩沖液，混合均勻后流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-22-3p與TCTN1靶向關系Targetscan生物信息學軟件預測顯示，TCTN1的3′UTR存在與miR-22-3p結合的核苷酸序列。PCR擴增含miR-22-3p結合位點的TCTN1的3′UTR序列，構建TCTN1野生型質粒（WTTCTN1，5′-GGGUGGGAGUGGAUGGGCAGCUC-3′）和突變型質粒（MUT-TCTN1，5′-GGGUGGGAGUGGAUGCCGUCGAC-3′）。分別將WT-TCTN1、MUTTCTN1與miR-22-3p mimic及陰性對照共轉染至A431細胞。轉染48 h后，收集細胞。參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書，檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學分析利用SPSS22.0軟件分析實驗數(shù)據。計量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 皮膚鱗狀細胞癌組織和正常皮膚組織中miR-22-3p及TCTN1表達與正常皮膚組織相比，皮膚鱗狀細胞癌組織中miR-22-3p水平明顯降低（P＜0.05），TCTN1 mRNA和蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。結果如圖1、表1所示。

表1 皮膚鱗狀細胞癌組織和正常皮膚組織中miR-22-3p和TCTN1表達（xˉ±s，n=35）Tab.1 Expression of miR-22-3p and TCTN1 in cutaneous squamous cell carcinoma tissues and normal skin tissues（xˉ±s，n=35）

圖1 Western blot檢測皮膚鱗狀細胞癌組織和正常皮膚組織中TCTN1蛋白表達Fig.1 Western blot detected expression of TCTN1 protein in cutaneous squamous cell carcinoma tissues and normal skin tissues

2.2 過表達miR-22-3p對皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖的影響與miR-con組相比，miR-22-3p組miR-22-3p水平明顯升高（P＜0.05），說明miR-22-3p mimics轉染成功，A431細胞中miR-22-3p過表達。與miRcon組相比，miR-22-3p組細胞活性、Ki-67和CyclinD1蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。結果如圖2、表2。

表2 過表達miR-22-3p對A431細胞增殖及Ki-67和CyclinD1蛋白表達的影響（xˉ±s，n=9）Tab.2 Effect of overexpressing miR-22-3p on A431 cell proliferation and expression of Ki-67 and CyclinD1 protein（xˉ±s，n=9）

圖2 Western blot檢 測A431細 胞Ki-67和CyclinD1蛋 白表達Fig.2 Western blot detected expression of Ki-67 and CyclinD1 protein in A431 cells

2.3 過表達miR-22-3p對皮膚鱗狀細胞癌A431細胞凋亡的影響與miR-con組相比，miR-22-3p組細胞凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。結果如圖3、表3。

表3 過表達miR-22-3p對A431細胞凋亡及Cleaved caspase-3蛋白表達的影響（xˉ±s，n=9）Tab.3 Effect of overexpressing miR-22-3p on A431 cell apoptosis and and the expression of Cleaved caspase-3 protein（xˉ±s，n=9）

2.4 miR-22-3p靶向TCTN1調控其表達Targetscan生物信息學軟件預測顯示，TCTN1的3′UTR與miR-22-3p核苷酸序列存在連續(xù)的結合位點。熒光素酶活性檢測結果顯示，與miR-con組相比，miR-22-3p組共轉染WT-TCTN1的A431細胞熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而共轉染MUT-TCTN1的A431細胞熒光素酶活性物無明顯變化（P＞0.05），說明miR-22-3p可與TCTN1的3′UTR靶向結合。與miR-con組相比，miR-22-3p組TCTN1蛋白水平明顯降低（P＜0.05）；與anti-miR-con組相比，anti-miR-22-3p組TCTN1蛋白水平明顯升高（P＜0.05），進一步說明miR-22-3p在A431細胞中靶向負調控TCTN1表達。結果如圖4、表4、5。

表4 雙熒光素酶報告實驗結果（xˉ±s，n=9）Tab.4 Dual luciferase reported experimental results（xˉ±s，n=9）

圖4 miR-22-3p與TCTN1互補的核苷酸序列以及miR-22-3p調控TCTN1表達Fig.4 Complementary nucleotide sequence of miR-22-3p and TCTN1 and miR-22-3p regulate TCTN1 expression

2.5 沉默TCTN1對皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖和凋亡的影響與si-con組相比，si-TCTN1組TCTN1蛋白水平明顯降低（P＜0.05），說明si-TCTN1轉染成功，A431細胞中TCTN1表達沉默。與si-con組相比，si-TCTN1組細胞活性、Ki-67和CyclinD1蛋白水平明顯降低（P＜0.05），凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。結果如圖5、表6。

表6 沉默TCTN1對A431細胞增殖和凋亡的影響（xˉ±s，n=9）Tab.6 Effect of silencing TCTN1 on proliferation and apoptosis of A431 cells（xˉ±s，n=9）

圖5 Western blot檢測A431細胞TCTN1、Ki-67、CyclinD1和Cleaved caspase-3蛋白表達Fig.5 Western blot detected expressions of TCTN1，Ki-67，CyclinD1 and Cleaved caspase-3 protein in A431 cells

2.6 過表達TCTN1部分逆轉miR-22-3p對皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖和凋亡的影響與miR-22-3p+pcDNA組相比，miR-22-3p+pcDNA-TCTN1組細胞活性、Ki-67和CyclinD1蛋白水平明顯升高（P＜0.05），凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。結果如表7、圖6。

圖6 Western blot檢測A431細胞中TCTN1、Ki-67、CyclinD1和Cleaved caspase-3蛋白表達Fig.6 Western blot detected expressions of TCTN1，Ki-67，CyclinD1 and Cleaved caspase-3 protein in A431 cells

表7 過表達TCTN1逆轉miR-22-3p對A431細胞增殖和凋亡的影響（xˉ±s，n=9）Tab.7 Overexpressing TCTN1 reversed the effect of miR-22-3p on proliferation and apoptosis of A431 cells（xˉ±s，n=9）

表5 miR-22-3p調控A431細胞中TCTN1蛋白的表達（xˉ±s）Tab.5 miR-22-3p regulated the expression of TCTN1 protein in A431 cells（xˉ±s）

3 討論

皮膚鱗狀細胞癌簡稱皮膚鱗癌，具有較高的侵襲性，易復發(fā)和轉移。遺傳因素、外部環(huán)境、細胞異常增殖等多種因素均可引起皮膚鱗狀細胞癌的發(fā)生。誘導細胞凋亡是腫瘤治療的途徑［11］。近年研究顯示，miRNA參與皮膚鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展［12］，探討皮膚鱗狀細胞癌中異常表達的miRNA及其對皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖和凋亡影響的分子機制，可為該疾病的診斷和治療提供新思路。

miR-22-3p是近年新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，參與調控腫瘤細胞的生物學行為，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。常永梅等［13］研究顯示，miR-22-3p在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織中表達降低，過表達miR-22-3p通過靶向負調控AEG-1表達抑制NSCLC細胞增殖。LV等［14］研究顯示，miR-22-3p在宮頸癌組織中表達升高，抑制miR-22-3p表達可通過靶向上調eIF4EBP3表達誘導宮頸癌細胞凋亡。這說明miR-22-3p在不同腫瘤中發(fā)揮的作用不同，既可作為抑癌基因抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展，也可作為促癌基因促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。目前，miR-22-3p對皮膚鱗狀細胞癌細胞生物學行為的影響還未知。本研究結果顯示，皮膚鱗狀細胞癌組織中miR-22-3p表達降低，過表達miR-22-3p可抑制皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖，促進細胞凋亡。CyclinD1在細胞周期G1至S期發(fā)揮調控作用，促進細胞增殖［15］。Ki-67是細胞增殖狀態(tài)的標記抗原，表達增加說明細胞增殖活躍［16］。Caspase級聯(lián)反應在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，caspase-3是細胞凋亡的“執(zhí)行者”，活化的caspase-3（Cleaved caspase-3）促進細胞凋亡［17］。本研究顯示，過表達miR-22-3p可抑制A431細胞中CyclinD1和Ki-67蛋白表達，促進Cleaved caspase-3蛋白表達，提示miR-22-3p通過影響與增殖、凋亡相關的蛋白表達抑制A431細胞增殖，促進細胞凋亡。

為了進一步探討miR-22-3p影響皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖和凋亡的作用機制，本研究通過生物信息學軟件預測顯示，TCTN1的3′UTR與miR-22-3p的核苷酸序列存在結合位點，雙熒光素酶活性檢測證實miR-22-3p可與TCTN1的3′UTR靶向結合。同時，上調皮膚鱗狀細胞癌A431細胞中miR-22-3p表達后，TCTN1蛋白表達降低，而下調miR-22-3p表達后TCTN1蛋白表達升高，說明miR-22-3p在A431細胞中靶向負調控TCTN1表達。本研究還顯示，過表達TCTN1逆轉了miR-22-3p對A431細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響，提示過表達miR-22-3p可能通過靶向下調TCTN1表達抑制皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖并促進其凋亡。

TCTN1是結構蛋白家族成員之一，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究顯示，NSCLC組織中miR-1256表達下調，TCTN1表達上調，過表達miR-1256通過靶向下調TCTN1表達抑制NSCLC細胞增殖和遷移，miR-1256/TCTN1軸可作為NSCLC的治療靶點［18］。TCTN1在甲狀腺癌細胞中表達升高，沉默TCTN1表達可抑制甲狀腺癌細胞活力、集落形成、細胞周期進展，并誘導細胞凋亡，為甲狀腺癌的治療提供了潛在新途徑［19］。目前，還未見TCTN1影響皮膚鱗狀細胞癌細胞生物學行為的相關報道。本研究結果顯示，皮膚鱗狀細胞癌組織中TCTN1 mRNA和蛋白表達升高，沉默TCTN1表達可抑制皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖，促進細胞凋亡，并抑制細胞中Ki-67和CyclinD1蛋白表達，促進Cleaved caspase-3蛋白表達，提示TCTN1參與皮膚鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，皮膚鱗狀細胞癌組織中miR-22-3p表達降低，TCTN1表達升高；過表達miR-22-3p可能通過靶向抑制抑制TCTN1表達降低皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖能力，并誘導其凋亡，miR-22-3p/TCTN1可能是皮膚鱗狀細胞癌靶向治療的新靶點。但本研究存在不足之處，僅在體外細胞層面研究了miR-22-3p/TCTN1軸對皮膚鱗狀細胞癌的影響，接下來將通過動物實驗在體內探討miR-22-3p/TCTN1對皮膚鱗狀細胞癌腫瘤生長的影響，以期為皮膚鱗狀細胞癌的靶向治療提供新途徑。