張志鋒 孫業(yè)富 王旋 沈預(yù)程（揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）（簡稱肝癌）是一種較為常見的惡性腫瘤，其預(yù)后差、病死率高，對(duì)人類健康和生命威脅較大。肝癌一般在早期較難發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已進(jìn)展到中晚期。當(dāng)前臨床普遍認(rèn)為，提高肝癌早期診斷率、盡早治療是改善肝癌患者預(yù)后的重要手段之一。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是目前臨床診斷原發(fā)性肝癌最常用的血清標(biāo)志物，但其靈敏度較差，容易造成早期原發(fā)性肝癌的漏診［1］。因此，尋找新的血清腫瘤標(biāo)志物用于原發(fā)性肝癌輔助診斷以及預(yù)后評(píng)估具有重要意義。三葉因子1（trefoil factor 1，TFF1）是一種胃腸道激素，其主要由消化道黏液細(xì)胞分泌而成［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)TFF1在結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤的進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著促進(jìn)作用［3-4］。近年來有研究報(bào)道TFF1在肝癌組織中陽性率顯著高于正常組織，且在肝癌組織中高表達(dá)，提示其可能成為一種新的血清肝癌標(biāo)志物。因此，本研究探討了血清TFF1檢測(cè)在原發(fā)性肝癌診斷及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值，旨在為臨床診斷乳腺癌及改善患者預(yù)后提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象選取2016年1～月2019年12月在海安市人民醫(yī)院腫瘤科及介入科診治的原發(fā)性肝癌患者53例作為肝癌組（PHC組），其中男性32例，女性21例；平均年齡（51.3±14.2）歲，腫瘤直徑：≥5 cm者31例，＜5 cm者22例；HBsAg（+）者37例，HBsAg（-）者16例；肝硬化狀況：伴有肝硬化者35例，無肝硬化者18例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期者21例，Ⅲ～Ⅳ期者32例，AFP水平：≥400 ng/ml者19例，＜400 ng/ml者34例；癌結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)：單個(gè)者20例，≥2個(gè)者33例。所有患者符合原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治專家共識(shí)的《原發(fā)性肝癌臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》，均經(jīng)臨床、CT、彩超影像學(xué)、AFP水平等臨床診斷HCC成立。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受過放、化療及介入治療；有較好的依從性，能定期復(fù)查或就診者，能順利完成至少12個(gè)月隨訪。慢性乙型肝炎組（CHB組）40例，平均年齡（52.4±12.5）歲；肝硬化組（LC組）40例，平均年齡（53.7±15.2）歲。依據(jù)2019版《慢性乙型肝炎防治指南》對(duì)CHB組和肝硬化組患者進(jìn)行診斷。所選患者均無甲、丙、丁、戊肝炎合并感染，并排除自身免疫性疾病、酒精性肝病等；未含孕婦、哺乳期婦女以及合并有如心臟病等其他嚴(yán)重疾病患者。健康對(duì)照組（NC組）選取同期在本院體檢健康人群30例，年齡（51.9±13.6）歲，均無腎臟、肝臟、心血管及其他疾病。本研究獲得海安人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，患者簽署知情同意書。

1.1.2 試劑及儀器TFF1試劑盒購自上海超研生物科技有限公司。線性范圍：0.215～13.760 ng/ml，cut-off：5.75 ng/ml。ELISA檢 測(cè)儀 購 自 美 國BOIRAD公司；AFP試劑盒購自羅氏公式；使用德國羅氏公司e6000-E601型全自動(dòng)電化學(xué)分析儀檢測(cè)，參考范圍＜20 ng/ml。

1.2 方法PHC患者在肝癌切除術(shù)前靜脈采血4 ml；慢性乙型肝炎組、肝硬化組入院后采血4 ml；健康對(duì)照組于體檢當(dāng)日采靜脈血4 ml，及時(shí)分離血清，置于-80℃冰箱保存。采用ELISA法檢測(cè)各組血清TFF1水平，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)各組AFP水平。

1.3 隨訪研究對(duì)象排除標(biāo)準(zhǔn)中已排除失訪患者，因此53例肝癌患者均完成了術(shù)后的隨訪，以第一次手術(shù)日期定為隨訪開始時(shí)間，隨訪方式主要以門診復(fù)查和電話為主，中位隨訪時(shí)間為9.3個(gè)月，隨訪時(shí)間范圍為5～13個(gè)月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)如呈正態(tài)分布則以±s表示，多組均數(shù)比較使用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，當(dāng)呈偏態(tài)分布時(shí)，以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率及復(fù)發(fā)率比較采用Log-rank檢驗(yàn)。采用MedCalc軟件繪制ROC曲線評(píng)估血清TFF1、AFP對(duì)肝癌診斷的價(jià)值，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清TFF1在4組受試者血清中的表達(dá)肝癌組血清AFP及TFF1水平顯著高于肝硬化組、慢性乙型肝炎組以及健康對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見表1。

表1 血清TFF1四組受試者中的表達(dá)Tab.1 Expression of serum TFF1 in four groups of subjects

2.2 血清TFF1在原發(fā)性肝癌診斷中的價(jià)值診斷原發(fā)性肝癌時(shí)TFF1、AFP的ROC曲線下面積分別為0.747、0.744；聯(lián)合檢測(cè)AUC為0.821，高于單項(xiàng)檢測(cè)。單項(xiàng)檢測(cè)時(shí)TFF1敏感度為67.65%，AFP的敏感度為57.39%；二者聯(lián)合檢測(cè)診斷原發(fā)性肝癌時(shí)，AUC為0.821，敏感度提高到81.32%。見表2、圖1。

圖1 血清TFF1在原發(fā)性肝癌診斷中的價(jià)值Fig.1 Value of serum TFF1 in diagnosis of primary hepatic carcinoma

表2 血清TFF1在原發(fā)性肝癌診斷中的價(jià)值Tab.2 Value of serum TFF1 in diagnosis of primary hepatic carcinoma

2.3 血清TFF1與肝癌不同臨床特征的關(guān)系進(jìn)一步分析血清TFF1與肝癌患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示血清TFF1水平與腫瘤大小以及TNM分期有關(guān)（P＜0.05），與腫瘤數(shù)目、AFP水平、HBV感染以及有無肝硬化無關(guān)（P＞0.05）。見表3。

表3 血清TFF1與肝癌不同臨床特征的關(guān)系Tab.3 Relationship between serum TFF1 and different clinical characteristics of liver cancer

2.4 隨訪情況隨訪期間共有14例患者死亡，21例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)部位分別是肝內(nèi)18例、肺部1例、腹腔1例、全身多發(fā)性轉(zhuǎn)移1例。

2.5 肝癌患者術(shù)前不同血清TFF1濃度的患者預(yù)后情況比較以臨界值（5.75 ng/ml）作為截?cái)嘀?，將肝癌患者分為TFF1高水平組（TFF1＞5.75 ng/ml）35例、低水平組（TFF1≤5.75 ng/ml）18例。術(shù)前TFF1高水平組患者術(shù)后4個(gè)月、8個(gè)月及12個(gè)月的生存率分別為100%、82.86%、62.85%；而TFF1低水平組患者術(shù)后4個(gè)月、8個(gè)月及其12個(gè)月的生存率分別為100%、94.44%、94.44%，Log-rank法比較顯示兩組間存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.015）。此外，TFF1高水平患者術(shù)后4個(gè)月、8個(gè)月及12個(gè)月的腫瘤復(fù)發(fā)率分別為5.71%、34.28%、54.29%；TFF1低水平組患者術(shù)后4個(gè)月、8個(gè)月及12個(gè)月的腫瘤復(fù)發(fā)率分別為0%、5.56%、11.11%，兩組間差異存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）。見圖2、3。

圖2 不同血清TFF1濃度的患者生存情況比較Fig.2 Comparison of patients′survival under different serum TFF1 concentrations

圖3 不同血清TFF1濃度的患者復(fù)發(fā)情況比較Fig.3 Comparison of relapses in patients with different serum TFF1 concentrations

3 討論

TFF1是三葉因子家族成員之一，是一種小分子多肽，主要來源于胃腸道黏液細(xì)胞［5］。研究發(fā)現(xiàn)TFF1是一種重要的癌基因，可高表達(dá)于多種腫瘤組織及患者血清中，參與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控，在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和腫瘤血管形成中也發(fā)揮重要作用。LEUNG等［6］研究發(fā)現(xiàn)TFF1在胃癌中的表達(dá)顯著低于癌旁組織和正常胃黏膜，且TFF1陽性率逐漸升高，表明TFF1進(jìn)行性缺失與早期胃癌的發(fā)生有關(guān)。與在胃癌中表達(dá)情況不同，TFF1在其他的一些實(shí)體瘤組織和患者血清中高水平表達(dá)，其被認(rèn)為是一種致癌基因。研究發(fā)現(xiàn)TFF1在乳腺癌患者血清中高表達(dá)，其參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，在乳腺癌的診斷及預(yù)后評(píng)估方面有一定價(jià)值［7］。KORNPRAT等［8］報(bào)道TFF1在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性膽囊癌中的表達(dá)顯著高于正常膽囊黏膜和有炎癥的膽囊黏膜。EMAMI等［9］發(fā)現(xiàn)TFF1在結(jié)腸癌中的表達(dá)顯著增高。尚允利等［10］研究報(bào)道TFF1在肝癌組織中陽性率顯著高于癌旁組織，其與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。以往關(guān)于TFF1在肝癌中的研究大多集中在肝癌組織中的表達(dá)，對(duì)于其在原發(fā)性肝癌患者外周血中表達(dá)的情況未見研究報(bào)道。本研究檢測(cè)了健康人群、乙型肝炎、肝硬化以及肝癌患者外周血TFF1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，肝癌組血清AFP及TFF1水平顯著高于肝硬化組、乙型肝炎組以及正常組，提示TFF1的表達(dá)可以誘發(fā)肝癌的發(fā)生，血清TFF1的表達(dá)升高對(duì)診斷肝癌有重要價(jià)值。分析血清TFF1與肝癌不同病理特征的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，肝癌患者血清TFF1水平與TNM分期相關(guān)。表明通過血清TFF1檢測(cè)能夠預(yù)測(cè)患者TNM分期。腫瘤直徑≥5 cm患者血清TFF1水平顯著高于腫瘤直徑＜5 cm患者，提示血清TFF1檢測(cè)可輔助腹部超聲檢查腫瘤大小。

目前AFP是肝癌診斷中比較常用的血清標(biāo)志物，相關(guān)研究認(rèn)為在排除妊娠、生殖系胚胎源性腫瘤等疾病后，若持續(xù)2個(gè)月血清中AFP水平高于200μg/L則可明確診斷為肝癌［11-12］。雖然AFP在肝癌的診斷中具有重要地位，但其并非完美無缺。因此，深入篩選與評(píng)價(jià)新的肝癌標(biāo)志物，不但能夠有利于肝癌的診斷與治療，更能為探討肝癌的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制提供新思路。本研究通過繪制ROC曲線評(píng)估TFF1對(duì)肝癌的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示血清TFF1診斷肝癌的AUC為0.747，AFP診斷肝癌的AUC為0.744，提示血清TFF1在肝癌術(shù)前診斷中具有一定價(jià)值。TFF1與AFP聯(lián)合檢測(cè)，診斷原發(fā)性肝癌的敏感性可提升至81.32%，AUC為0.821。提示，在肝癌的診斷上，外周血TFF1可以和AFP互補(bǔ)，二者聯(lián)合檢測(cè)可以提高肝癌的診斷準(zhǔn)確性。肝癌發(fā)病兇險(xiǎn)，用血清標(biāo)志物對(duì)其進(jìn)行診斷時(shí)，應(yīng)將敏感度放在首位，以減少漏診。肝癌患者血清中的TFF1表達(dá)與AFP水平無相關(guān)性，血清TFF1檢測(cè)可能對(duì)AFP假陰性肝癌的診斷有一定意義。

對(duì)肝癌預(yù)后的預(yù)測(cè)一直是研究熱點(diǎn)，但目前尚缺少有效的手段對(duì)術(shù)后預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)。雖然影響預(yù)后的多種危險(xiǎn)因素已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但因?yàn)楫愘|(zhì)性的存在，其對(duì)肝癌預(yù)后預(yù)測(cè)也面臨著巨大挑戰(zhàn)。本研究結(jié)果顯示，術(shù)前血清TFF1≥5.75 ng/ml組患者術(shù)后4個(gè)月、8個(gè)月及12個(gè)月的生存率分別為100%、82.86%、62.85%；與TFF1＜5.75 ng/ml組患者比較，兩組間差異存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015）。此外，TFF1≥5.75 ng/ml患者術(shù)后4個(gè)月、8個(gè)月及12個(gè)月的腫瘤復(fù)發(fā)率也顯著高于TFF1＜5.75 ng/ml組患者（P=0.009）。由此說明，血清TFF1對(duì)于肝癌患者預(yù)后具有一定判斷作用，即術(shù)前TFF1≥5.75 ng/ml，則患者術(shù)后1年更容易出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，且生存率往往較低。

綜上所述，檢測(cè)外周血TFF1可用于原發(fā)性肝癌患者的診斷及預(yù)后評(píng)估。本研究也存在一定的不足，首先本研究樣本量較小，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步確認(rèn)TFF1對(duì)肝癌患者的診斷及預(yù)后作用。其次，本研究未對(duì)肝癌患者外周血TFF1水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，下一步將動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)TFF1水平，進(jìn)一步研究TFF1在肝癌中的應(yīng)用價(jià)值。