于曉甜 張曉坤 高曉藝 楊洪鳴 唐金寶（濰坊醫(yī)學院藥學院，濰坊261053）

標記免疫分析技術(shù)是將抗原-抗體結(jié)合反應的特異性和各種標記物的可測量性相結(jié)合的分析技術(shù)，標記抗體是該技術(shù)中不可或缺的重要試劑［1-2］。目前，基于交聯(lián)抗體分子內(nèi)活性氨基酸殘基的化學共價偶聯(lián)技術(shù)是抗體標記的主要技術(shù)，但由于抗體表面上存在的多個活性位點（如1個IgG分子表面有86個-NH2）都可能參與偶聯(lián)，一旦偶聯(lián)反應的氨基酸殘基位于Fab端，則影響抗體與抗原的結(jié)合，導致標記后抗體的抗原結(jié)合活性降低［3-4］。因此，開發(fā)一種特異性偶聯(lián)抗體Fc位點的抗體標記技術(shù)，對于保持標記后抗體的抗原結(jié)合活性具有重要意義。蛋白A能通過疏水作用結(jié)合兔、人及小鼠等多種動物IgG的Fc段，根據(jù)這一特性，除廣泛應用于動物血清IgG和單克隆抗體純化外，還被多種標記物（過氧化物酶、堿性磷酸酶、膠體金等）偶聯(lián)標記用于免疫測定［5-6］。Z親和肽是源于蛋白A的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分子量為7 kD［7-8］。本研究以密碼子擴展修飾蛋白質(zhì)技術(shù)（aminoacyl-tRNA synthetase/suppressor tRNA，aaRS/tRNA）將含有光敏基團的非天然氨基酸（4-苯甲?；?L-苯基丙氨酸，p-benzoylphenylalanine，Bpa）引入Z親和肽的氨基酸序列，并在其C-端重組引入堿性磷酸酶，構(gòu)建帶光敏基團的ZBpa-AP重組蛋白，利用Z親和肽與IgG-Fc的親和特異性以及Bpa的共價鍵形成能力，實現(xiàn)堿性磷酸酶對抗體Fc位點的共價偶聯(lián)標記，以期為構(gòu)建一種新型的酶標抗體奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料pTXB1、pEVOL-pBpF質(zhì)粒分別購自NEB公司和Addgene公司；Bpa購自廣州氪道公司；His-Trap Chelating HP購自Amersham Biosciences公司；超濾離心管（50 kD）購自Millipore公司；兔IgG抗體購自BBI公司；Rabbit anti-goat F（ab′）2片段購自Jackson公司；BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒購自碧云天生物公司；pDAP2質(zhì)粒及E.coliBL21放于藥學專業(yè)實驗室保存；其他生化及化學試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 光敏ZBpa-AP融合蛋白表達載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫登錄的Z親和肽基因序列（No.M74186），將第17位氨基酸密碼子突變?yōu)殓昝艽a子（UAG），分別在5′及3′端設計NdeI及SalI限制性內(nèi)切酶酶切位點，上述基因序列委托上海生工生物合成并克隆至pTXB1質(zhì)粒，構(gòu)建中間質(zhì)粒載體pTXB1-ZTAG。根據(jù)大腸桿菌堿性磷酸酶基因序列，設計1對引物（上游引物：5′-GCGTCGACATGCCTGTTCTGG-3′；下游引物：5′-CAGGAAGAGCCCTCGAGTTAATG-3′，下劃線分別為SalI及XhoI酶切位點），以pDAP2質(zhì)粒為模板PCR方式獲取AP基因并克隆至pTXB1-ZTAG，構(gòu)建表達載體pZTAG-AP。

1.2.2 光敏ZBpa-AP融合蛋白的表達與純化pZTAGAP和pEVOL-pBpF共轉(zhuǎn)化至感受態(tài)菌E.coliBL21，涂布于含氯霉素（50 mg/L）和氨芐青霉素（100 mg/L）的LB平板37℃下培養(yǎng)12 h。陽性單克隆菌落于含氯霉素（50 mg/L）和氨芐青霉素（100 mg/L）的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，以1/50的接種量在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至OD600nm為0.6～0.8。然后將終濃度為300 mmol/L的Bpa加入到培養(yǎng)基中，并繼續(xù)生長1 h后，分別加入阿拉伯糖和異丙基β-D-1-硫代吡喃半 乳 糖 苷（IPTG）至 終 濃 度 為0.2%（m/v）和0.5 mmol/L，誘導表達6 h后，離心收集菌體，用含咪唑20 mmol/L的20 mmol/L PBS溶液重懸菌體，反復凍融直至菌液變得黏稠，8 000 r/min離心10 min，取上清。HisTrap Chelating HP純化目的蛋白，Amicon?Ultra-4（分子截留量50 kD）對咪唑洗脫組分進行超濾濃縮脫鹽，12%SDS-PAGE檢測。

1.2.3 ZBpa-AP與抗體光激發(fā)共價偶聯(lián)終濃度分別為10μmol/L和50μmol/L的抗體（兔IgG）和ZBpa-AP溶液于石英比色皿中混合，4℃下孵育1 h?；旌衔镏糜诒?，365 nm紫外燈照射，并分別在照射時間0 min、30 min、60 min、90 min、120 min取樣，12%變性和非變性SDS-PAGE分析偶聯(lián)效果。

1.2.4 對照實驗兔F（ab'）2片段與ZBpa-AP以物質(zhì)的量比1：5混合，4℃下孵育1 h。365 nm紫外燈于冰上照射120 min，12%變性SDS-PAGE分析。

1.2.5 Western blot將1.2.3項取樣樣品經(jīng)12%非變性SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，經(jīng)PBST洗滌3～4次后，PVDF膜浸入BCIP/NBT顯色液，室溫振蕩染色，直至出現(xiàn)明顯條帶。

2 結(jié)果

2.1 光敏ZBpa-AP融合蛋白表達載體的構(gòu)建化學合成第17位突變?yōu)門AG的Z親和肽序列片段經(jīng)測序后亞克隆至pTXB1質(zhì)粒獲得pTXB1-ZTAG質(zhì)粒；PCR方式擴增AP基因片段，經(jīng)測序正確后雙酶切插入pTXB1-ZTAG質(zhì)粒，獲得pZTAG-AP表達載體（圖1）。

圖1 pZTAG-AP質(zhì)粒圖譜Fig.1 Plasmid profile pZTAG-AP

2.2 光敏ZBpa-AP融合蛋白的表達與純化培養(yǎng)基含有Bpa培養(yǎng)的工程菌與不含Bpa培養(yǎng)的工程菌相比，在56 kD左右出現(xiàn)蛋白條帶，與ZBpa-AP融合蛋白理論值相符（圖2）。菌體凍融上清流通HisTrap層析柱，300 mmol/L咪唑（20 mmol/L PBS，150 mmol/L NaCl，pH=7.4）洗脫目的蛋白，其電泳純度可達90%。

圖2 12%SDS-PAGE分析目的蛋白的表達及純化Fig.2 12%SDS-PAGE analysis of expression and purification of target protein

2.3 ZBpa-AP與抗體的光共價偶聯(lián)結(jié)果如圖3所示，非還原電泳結(jié)果顯示，光照產(chǎn)物在IgG抗體上方出現(xiàn)兩條帶，且隨著光照時間的延長，最上方條帶著色加深，而抗體及ZBpa-AP蛋白條帶變淺，表明越來越多的抗體被兩分子ZBpa-AP偶聯(lián)，凝膠灰度掃描表明約90%的IgG被ZBpa-AP分子共價偶聯(lián)。還原SDS-PAGE結(jié) 果 表 明，ZBpa-AP與IgG重 鏈（heavy chain，HC）偶聯(lián)。為進一步考察ZBpa-AP與HC偶聯(lián)部位，兔F（ab'）2片段與ZBpa-AP按物質(zhì)的量濃度比1：5混合，4℃下孵育1 h。冰浴條件下UV光照偶聯(lián)2 h。還原SDS-PAGE結(jié)果顯示（圖4），ZBpa-AP不能偶聯(lián)F（ab'）2片段。因此，根據(jù)ZBpa-AP與IgG、F（ab'）2偶聯(lián)產(chǎn)物的電泳結(jié)果，可證明ZBpa-AP與抗體發(fā)生共價偶聯(lián)的部位是抗體Fc段。

圖3 12%非變性與變性SDS-PAGE分析光照產(chǎn)物Fig.3 12% non-reducing and reducing SDS-PAGE analysis of photoconjugation

圖4 12%變性SDS-PAGE分析ZBpa-AP與F（ab′）2的光照產(chǎn)物Fig.4 12% reducing SDS-PAGE analysis of ZBpa-AP photoconjugated F（ab′）2 fragment

2.4 Western blot結(jié)果顯示偶聯(lián)物條帶顯色，且隨照射時間延長顏色變深，而ZBpa-AP條帶隨照射時間延長顏色變淺（圖5B、D），與考馬斯亮藍染色結(jié)果一致（圖5A、C），表明偶聯(lián)物具有堿性磷酸酶活性。

圖5 偶聯(lián)產(chǎn)物的堿性磷酸酶活性分析Fig.5 Activity analysis for alkaline phosphatase of coupling produt

3 討論

通過基因工程技術(shù)構(gòu)建融合蛋白可避免化學隨機偶聯(lián)標記技術(shù)對標記蛋白生物學活性的影響，如蛋白A與標記蛋白（綠色熒光蛋白、堿性磷酸酶及熒光素酶等）構(gòu)建融合蛋白，能充分保持蛋白A及標記蛋白的生物學活性，提高基于蛋白A免疫分析的特異性與靈敏度［9-11］。然而蛋白A與兔、人、小鼠等動物IgG是可逆性結(jié)合，如以蛋白A融合的蛋白應用于人血清疾病標志物檢測時，血清中內(nèi)源性人IgG抗體會競爭性結(jié)合蛋白A融合蛋白，干擾測定的準確性［12-13］。如果將蛋白A與抗體的可逆親和轉(zhuǎn)變?yōu)楣矁r偶聯(lián)，則能突破蛋白A在臨床免疫檢驗的應用瓶頸。光親和標記技術(shù)可實現(xiàn)受體蛋白與配體蛋白之間共價結(jié)合，光敏衍生物修飾的配體與受體蛋白生物結(jié)合后，再光照激發(fā)使光敏衍生物在結(jié)合部位與受體蛋白形成共價鍵［14-15］。以Z親和肽為親和配基，研究顯示光敏基團在其第17位氨基酸位置時與兔IgG的光共價偶聯(lián)效率最高［6，16］。本研究中，為實現(xiàn)該融合蛋白與抗體的共價偶聯(lián)，利用遺傳密碼擴展技術(shù)（aaRS/tRNA）將Z親和肽的第17位氨基酸替換為光敏基團的Bpa，構(gòu)建光敏ZBpa-AP融合蛋白。實驗結(jié)果表明，光敏ZBpa-AP具有IgG-Fc的親和特性、Bpa的共價結(jié)合能力以及堿性磷酸酶的酶學活性，實現(xiàn)了堿性磷酸酶對抗體Fc位點的共價偶聯(lián)標記，這對于開發(fā)基于抗體特異性位點的抗體標記技術(shù)具有重要意義。下一步研究重點是該光偶聯(lián)標記方式對偶聯(lián)后抗體的免疫學活性以及其對標記免疫分析檢測效能的影響。