楊利斌 楊林 趙恩典 王善坤 梁秋冬 柳申鵬

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院骨外科四病區(qū)，新鄉(xiāng)453100）

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的肌肉骨骼疾病，其特征在于關節(jié)進行性結構損傷，導致諸如關節(jié)僵硬和疼痛等癥狀［1］。OA為退行性關節(jié)疾病，其細胞功能喪失，細胞外基質降解。軟骨細胞通過形成細胞外基質分子維持關節(jié)軟骨強度，軟骨細胞凋亡導致軟骨基質缺乏，從而引起基質的破壞［2］。對于OA的治療，包括關節(jié)疼痛和炎癥的緩解使用非甾體抗炎藥，包括環(huán)加氧酶抑制劑［3］。但由于骨關節(jié)炎病因的復雜性和應用藥物的局限性，預防和延緩OA的發(fā)生、發(fā)展是最佳選擇。

microRNA（miRNAs）屬于小的非編碼RNA，通過轉錄后靶向mRNA表達，作為關鍵的基因調節(jié)因子，影響細胞的生物學或病理活動［4］。越來越多的證據(jù)將幾種miRNA途徑與OA進展相關聯(lián)。血清和滑液中的miR-378-5p是預測膝蓋OA嚴重程度的有效miR信號［5-6］。miR-148a可抑制軟骨細胞外基質降解酶，如MMP13和ADAMTS5在OA軟骨細胞中的表達［7］。miR-106a-5p作為miR-17家族的一員，在多種腫瘤中高表達。已有研究表明，關節(jié)內注射miR-106a agomir可 改 善OA［8］。但miR-106a-5p對OA的具體作用機制仍不清楚。本文旨在探究miR-106a-5p過表達對ACLT誘導的OA大鼠軟骨退變和細胞外基質降解的修復及血清炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物40只SD大鼠購自常州卡文斯實驗動物有限公司，雄性，7周齡，體重（200±10）g，許可證號：SCXK（蘇）2016-0010。置于溫控（22±1）℃和光控（200 lux，12 h/12 h光暗循環(huán)）動物設施中常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 主要試劑與儀器蘇木素-伊紅（HE）染液（D006-1-1）、IL-6（H007）和TNF-α（H052）ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；U6引物、miR-106a-5p Scramble及miR-106a-5p激動劑購自上海吉瑪制藥公司；阿利新藍染液（0298-50G）購自青島捷世康生物科技有限公司；聚集蛋白聚糖（Aggrecan）（ab36861）、SOX-9（ab26414）、Ⅱ型膠原蛋白（typeⅡcollagen，ColⅡ）（ab34712）、Caspase-3（ab13847）、cleaved Caspase-3（ab2302）、Caspase-9（ab52298）、cleaved Caspase-9（ab2324）、Bax（ab53154）、Bcl-2（ab196495）、β-actin（ab8227）購自英國Abcam公司。半自動圖像數(shù)字化分析儀（GRT-3002）購自濟南格利特科技有限公司；Nanodrop分光光度計購自美國ThermoFisher公司；熒光顯微鏡購自德國徠卡。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立與分組將大鼠按隨機數(shù)字表法分為4組：Control組、ACLT組、ACLT+Scramble組 和ACLT+miR-106a agomir組。除Control組外，其余3組參照郇松瑋等［9］的方法行前交叉韌帶橫斷手術，ACLT+Scramble組轉染無序序列，ACLT+miR-106a agomir組轉染miR-106a-5p激動劑。

1.2.2 HE染色取各組大鼠軟骨組織石蠟包埋切片，采用HE染液，將石蠟切片脫蠟，蒸餾水潤濕組織，核染液染色5 min，水洗5 s，漿染液染色30 s，水洗后，濾紙吸干，無水乙醇脫水2次后封片，在熒光顯微鏡下觀測。

1.2.3 RT-PCR檢測miR-106a-5p表達Trizol法提取軟骨組織總RNA，Nanodrop分光光度計測定吸光度（A260/A280），按照試劑盒說明書進行cDNA合成和PCR擴增，引物序列為：miR-106a-5p F：5'-AAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAG-3'，R：5'-GGAAAAGTGCTTACAGTGCAGGT-3'；U6 F：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴增35個循環(huán)，72℃延長10 min。存儲在4℃條件下。反應產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。以U6為內參，用2-ΔΔCt方法計算。

1.2.4 骨組織形態(tài)計量學測量采用半自動圖像數(shù)字化分析儀測量骨小梁數(shù)目（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp）及骨小梁體積比（BV/TV）。測量范圍為：距離骺線0.1 mm至遠端0.4 mm，兩側皮質骨內膜面范圍內。

1.2.5 阿利新藍染色將軟骨細胞接種于3.5 cm細胞培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后，去除培養(yǎng)液，PBS洗3次。4%多聚甲醛室溫下固定1 h，PBS洗3次，加入1 ml 1%阿利新藍染液（配于0.1 mol/L的HCl），37℃孵育過夜。去除多余染液，PBS洗3次，加1 ml無水乙醇脫色。倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 Western blot將各組大鼠軟骨組織冰上溶解25 min。以12 000 r/min離心10 min，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白質含量。提取等量的蛋白質樣品（20 mg），100℃變性5 min。然后使用SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉移至PVDF膜，4℃條件下加入相應一抗并孵育過夜，清洗，4℃下加入辣根過氧化物酶標記的二抗，孵育2 h，最后加入發(fā)光液，曝光處理。Image J軟件統(tǒng)計灰度值。

1.2.7 ELISA采用ELISA法檢測各組大鼠外周血和骨組織中IL-6、TNF-α水平，操作步驟嚴格按照IL-6、TNF-α ELISA試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學分析所有實驗數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計軟件SPSS18.0進行統(tǒng)計分析，實驗結果以±s表示，兩兩比較采用獨立的t檢驗，組間差異采用單因素方差分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-106a-5p過表達改善ACLT誘導的OA大鼠病理損傷HE染色檢測各組大鼠病理損傷程度結果如圖1A所示，Control組軟骨組織完整，ALCT組結構紊亂，可見纖維變形和裂隙。ACLT+Scramble組潮線模糊、增生。ACLT+miR-106a agomir組軟骨及基質排列較整齊，軟骨表層輕度粗糙，較ACLT+Scramble組病理損傷程度有所減輕。RT-PCR檢測各組大鼠miR-106a-5p表達結果如圖1B所示，與Control組相比，ACLT組miR-106a-5p表達降低（P＜0.05）。與ACLT+Scramble組相比，ACLT+miR-106a agomir組miR-106a-5p表達升高（P＜0.05）；半自動圖像數(shù)字化分析儀檢測各組大鼠Tb.N、Tb.Sp、BV/TV結果如圖1C～E所示，與Control組相比，ACLT組Tb.N、BV/TV明顯降低，Tb.Sp明顯升高（P＜0.05）。與ACLT+Scramble組相比，ACLT+miR-106a agomir組Tb.N、BV/TV明顯升高（P＜0.05），Tb.Sp明顯降低（P＜0.05）。

圖1 miR-106a-5p過表達對ACLT誘導的OA大鼠病理損傷的影響Fig.1 Effect of miR-106a-5p overexpression on pathological damage in ACLT-induced OA rats

2.2 miR-106a-5p過表達改善ACLT誘導的OA大鼠軟骨損傷通過阿利新藍染色檢測各組大鼠軟骨損傷情況結果如圖2所示，阿利新藍與細胞中的蛋白聚糖結合，使軟骨細胞的細胞質呈淺藍色，細胞核呈深藍色。ACLT組染色明顯淺于Control組，ACLT+miR-106a agomir組染色明顯淺于ACLT+Scramble組。

圖2 miR-106a-5p過表達對ACLT誘導的OA大鼠軟骨損傷的影響Fig.2 Effect of miR-106a-5p overexpression on cartilage damage in ACLT-induced OA rats

2.3 miR-106a-5p過表達上調ACLT誘導的OA大鼠Aggrecan、SOX-9、ColⅡ蛋白表達水平Western blot檢測各組大鼠Aggrecan、SOX-9、ColⅡ蛋白表達水平結果如圖3所示，與Control組相比，ACLT組Aggrecan、SOX-9、ColⅡ蛋 白 水 平 明 顯 降 低（P＜0.05）。與ACLT+Scramble組相比，ACLT+miR-106a agomir組Aggrecan、SOX-9、ColⅡ蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。

圖3 miR-106a-5p過表達對ACLT誘導的OA大鼠Aggrecan、SOX-9、ColⅡ蛋白表達水平的影響Fig.3 Effect of miR-106a-5p overexpression on Aggrecan，SOX-9 and ColⅡprotein expression levels in ACLT-induced OA rats

2.4 miR-106a-5p過表達降低ACLT誘導的OA大鼠cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2 Western blot檢測各組大鼠Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表達水平結果如圖4所示，與Control組相比，ACLT組cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2明顯升高（P＜0.05）。與ACLT+Scramble組相比，ACLT+miR-106a agomir組cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2明顯降低（P＜0.05）。

圖4 miR-106a-5p過表達對ACLT誘導的OA大鼠Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of miR-106a-5p overexpression on protein expression levels of Caspase-3，Caspase-9，Bax and Bcl-2 in ACLT-induced OA rats

2.5 miR-106a-5p過表達降低ACLT誘導的OA大鼠外周血和骨組織中IL-6、TNF-α水平ELISA檢測各組大鼠外周血和骨組織中IL-6、TNF-α水平結果如圖5所示，與Control組相比，ACLT組外周血和骨組織中IL-6、TNF-α水平明顯升高（P＜0.05）。與ACLT+Scramble組 相比，ACLT+miR-106a agomir組外周血和骨組織中IL-6、TNF-α水平明顯降低（P＜0.05）。

圖5 miR-106a-5p過表達對ACLT誘導的OA大鼠外周血和骨組織中IL-6、TNF-α水平的影響Fig.5 Effect of miR-106a-5p overexpression on IL-6 and TNF-α levels in peripheral blood and bone tissues of ACLT-induced OA rats

3 討論

OA為中老年人多發(fā)病，會導致關節(jié)明顯疼痛和僵硬。全球每年有數(shù)百萬人受OA的影響［10］。盡管骨關節(jié)炎遺傳學已引起關注，但臨床結果尚未得到明顯改善［11］。因此，迫切需要對OA患者的候選者進行更好的識別，以增強OA的臨床管理。

在OA中，關節(jié)軟骨缺失是OA最典型的病理變化之一，軟骨下骨小梁骨質改變在骨關節(jié)炎病理變化的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［12］。軟骨下骨主要病理變化為骨質象牙化、骨囊腫形成及骨贅形成等，微觀上則表現(xiàn)為軟骨下骨骨小梁數(shù)目增加，密度增高，間距變小，骨小梁方向與關節(jié)表面更垂直，而厚度無改變［13］。本文研究發(fā)現(xiàn)，miR-106a-5p過表達具有升高ACLT誘導的OA大鼠Tb.N、BV/TV，降低Tb.Sp的作用。提示miR-106a-5p過表達抑制軟骨下骨的骨質疏松，改善軟骨下骨的生物力學性能，從而延緩關節(jié)軟骨退變。

軟骨細胞外基質降解導致的關節(jié)軟骨退變是OA的主要病理變化［14］。細胞外基質主要由ColⅡ和Aggrecan組成，成熟軟骨細胞能夠合成及分泌細胞外基質，在維持細胞外基質合成代謝和分解代謝之間的動態(tài)平衡中發(fā)揮關鍵作用［15］。SOX-9為SOX蛋白家族成員，在關節(jié)軟骨細胞外基質代謝方面發(fā)揮重要的調節(jié)作用，能夠促進軟骨標志物Ⅱ型膠原、蛋白聚糖和Ⅸ型膠原的基因轉錄，并能夠抑制聚蛋白多糖酶、基質金屬蛋白酶表達，從而維持關節(jié)軟骨細胞表型［16］。張國梁等［17］研究發(fā)現(xiàn)miR-502-5p上調Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達緩解軟骨細胞損傷。李燦鋒等［18］研究發(fā)現(xiàn)，miR-140上調SOX-9表達維持骨關節(jié)炎軟骨細胞表型。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-106a-5p過表達具有上調ACLT誘導的骨關節(jié)炎大鼠Aggrecan、SOX-9、ColⅡ蛋白表達水平的作用。提示miR-106a-5p過表達可減緩軟骨細胞外基質降解。

細胞凋亡與人類骨關節(jié)炎組織標本中軟骨破壞和基質耗竭的嚴重程度呈正相關［19］。Caspase家族在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，其中Caspase-9、Caspase-3在凋亡級聯(lián)中的過度活化能夠促進細胞凋亡［20］?？辜毎蛲龀蓡TBcl-2可防止細胞凋亡，而促凋亡成員Bax位于線粒體外膜或細胞質，并在應激下寡聚化，促進線粒體釋放因子，從而引發(fā)細胞凋亡［21］。本文研究發(fā)現(xiàn)，miR-106a-5p過表達具有降低ACLT誘導的OA大鼠cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2的作用。提示miR-106a-5p過表達抑制ACLT誘導的OA大鼠軟骨細胞凋亡。

炎癥是OA的早期過程，可導致軟骨細胞的代謝功能障礙，加劇關節(jié)軟骨的功能障礙，并最終導致滑膜關節(jié)的功能性破壞［22］。在OA患者中，各種炎癥介質如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等表達水平明顯升高［23］。因此，抑制炎癥因子的釋放有助于改善OA。李坤等［24］研究發(fā)現(xiàn)miR-543過表達抑制骨關節(jié)炎大鼠TNF-α、IL-6表達減輕炎癥損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-106a-5p過表達具有降低ACLT誘導的骨關節(jié)炎大鼠外周血和骨組織中IL-6、TNF-α水平的作用。提示miR-106a-5p過表達通過抑制炎癥因子的釋放改善OA。

綜上所述，miR-106a-5p通過緩解病理損傷程度，抑制細胞外基質降解，抑制軟骨細胞凋亡，抑制炎癥因子，對ACLT誘導的OA大鼠起改善作用。