朱曉芹,裴志斐,嚴石煥,覃 楊,藍慧琴,王博龍,朱 丹*

(1.宜春學院化學與生物工程學院,江西 宜春 336000;2.宜春市第二人民醫(yī)院,江西 宜春 336000;3.廣西醫(yī)科大學藥學院,南寧 530021)

桂枝茯苓丸出自東漢醫(yī)圣張仲景的《金匱要略》一書,由桂枝、茯苓、芍藥(白芍)、牡丹皮、桃仁組成,是活血化瘀消癥的經(jīng)典名方。桂枝茯苓膠囊是其現(xiàn)代制劑,具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、調(diào)節(jié)平滑肌、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等藥理作用,在臨床上廣泛應(yīng)用于乳腺增生癥、原發(fā)性痛經(jīng)、子宮肌瘤、盆腔炎、多囊卵巢綜合征等婦科疾病治療[1]。臨床及實驗研究發(fā)現(xiàn)其治療乳腺增生癥的療效優(yōu)于乳寧片[2]、乳癖消片[3]、小金丸[4]等,且毒副作用小,具有較高的應(yīng)用價值。由于桂枝茯苓膠囊是多成分、多靶點的復(fù)方中藥,其治療乳腺增生癥的藥效物質(zhì)及分子機理尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學可挖掘數(shù)據(jù)庫的海量資源,全面研究復(fù)方中藥的藥效物質(zhì)及作用機理。然而,大多數(shù)網(wǎng)絡(luò)藥理學研究,主要根據(jù)OB、DL等參數(shù)來篩選復(fù)方中藥的藥效物質(zhì)。而血清藥物化學認為口服藥物的藥效物質(zhì)必須進入血液循環(huán)才能發(fā)揮藥理作用,故以入血成分作為藥效物質(zhì)進行網(wǎng)絡(luò)藥理學研究將會更加客觀、嚴謹。尹權(quán)微等[5]通過血清藥物化學研究發(fā)現(xiàn)了芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苦杏仁苷(代謝產(chǎn)物為野櫻苷)、沒食子酸、沒食子酸乙酯等12種桂枝茯苓膠囊入血成分,為其藥理研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究基于桂枝茯苓膠囊12種入血成分,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學挖掘它們抗乳腺增生癥的作用靶點、生物過程及信號通路,進而揭示其作用機理。

1 材料和方法

1.1 入血成分抗乳腺增生癥靶點預(yù)測

在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站下載桂枝茯苓膠囊12種入血成分的3D結(jié)構(gòu),運用ChemBioOffice 2014軟件對3D結(jié)構(gòu)進行MM2能量最小化并保存為mol2格式,通過PharmMapper服 務(wù) 器 在 Targetbank、Drugbank、Binding DB、PDTD數(shù)據(jù)庫中自動匹配潛在靶蛋白。最后運用UniProt數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一上述靶蛋白。再在GeneCards、PubMed、GenCLip 3數(shù)據(jù)庫中,檢索"hyperplasia of mammary glands"以挖掘乳腺增生癥靶點。最后將入血成分靶點與乳腺增生癥靶點輸入Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)網(wǎng)站,定義重合靶點為桂枝茯苓膠囊治療乳腺增生癥的靶點。

1.2 入血成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape軟件構(gòu)建12種入血成分及其抗乳腺增生癥靶點網(wǎng)絡(luò),以節(jié)點度(degree)表示入血成分作用的靶點個數(shù),分析桂枝茯苓膠囊入血成分、抗乳腺增生癥靶點的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點的篩選

將桂枝茯苓膠囊抗乳腺增生癥的入血成分及對應(yīng)靶點導(dǎo)入STRING(https://string-db.org/),設(shè)置物種為"Homo sapiens",最低相互作用閾值為0.4,其他參數(shù)保持默認值,以構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction,PPI)。

再利用CytoNCA插件計算PPI網(wǎng)絡(luò)的自由度中心性(degree centrality,DC)、介度中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality,EC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(network centrality,NC)和局部邊連通性(local average connectivity,LAC)等參數(shù)。篩選標準:①DC值大于所有節(jié)點DC值中位數(shù)2倍;②其他5個參數(shù)均大于所有節(jié)點中位數(shù),即得到關(guān)鍵靶點。

1.4 關(guān)鍵靶點的GO生物過程分析

利用Cytoscape軟件中"ClueGO"插件進行關(guān)鍵靶點的GO富集分析,分析條件為Min Lever=3,Max Lever=8;Number of Genes=3,Min Percentage=4.0;Kappa Score=0.4;其余選項選擇默認。

1.5 關(guān)鍵靶點的KEGG通路分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫進行關(guān)鍵靶點KEGG富集分析,物種與背景設(shè)置均為"Homo sapiens";并通過Omicshare軟件(http://www.omicshare.com/tools/index.php/)對富集結(jié)果進行可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 入血成分抗乳腺增生癥靶點篩選

表1為12種入血成分的基本信息。通過PharmMapper服務(wù)器分別得到287、287、291、289、53、171、289、244、92、289、282、289個靶點,合并去重后確定了入血成分的421個靶點。從GeneCards、PubMed、GenCLip 3數(shù)據(jù)庫檢索得到乳腺增生癥靶點2005個,映射得到入血成分抗乳腺增生癥靶點197個,并以此作為桂枝茯苓膠囊治療乳腺增生癥的靶點。

表1 入血成分反向?qū)踊拘畔able 1 Basic information of reverse molecular docking of constituents migrating to blood

2.2 入血成分-乳腺增生癥靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

圖1是桂枝茯苓膠囊入血成分及其抗乳腺增生癥靶點網(wǎng)絡(luò),中間的12個六邊形節(jié)點代表入血成分,外周197個圓形節(jié)點為抗乳腺增生癥靶點,1468條連線表示入血成分對靶點的作用,由圖可見桂枝茯苓膠囊能夠多成分、多靶點治療乳腺增生癥。

圖1 桂枝茯苓膠囊入血成分-靶點網(wǎng)絡(luò)Figure 1 Constituents migrating to blood-targets network of Guizhi Fuling Capsule

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

圖2為蛋白互作網(wǎng)絡(luò),其包括197個節(jié)點(所有靶蛋白均參與)和2580條連線。采用CytoNCA插件分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的拓撲屬性,進而獲得31個關(guān)鍵靶點,見圖3、表2。31個關(guān)鍵靶點包括轉(zhuǎn)錄及凋亡蛋 白AKT1、MAPK1、CASP3、MAPK8、BCL2L1、MDM2、STAT1;信 號 傳 導(dǎo) 蛋 白 SRC、HRAS、HSP90AA1、MAPK14、PIK3R1、MAP2K1、PTPN11;

表2 關(guān)鍵靶點及其拓撲參數(shù)Table 2 Key targets and their topological parameters

圖2 桂枝茯苓膠囊靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 2 PPI network of target protein of Guizhi Fuling Capsule

圖3 關(guān)鍵靶點的篩選策略圖Figure 3 Screening strategy for key targets

血管生成相關(guān)靶點EGFR、MMP2、KDR、NOS3;激素相關(guān)受體IGF1、ESR1、AR、IGF1R;炎癥因子IL2;氧化還原酶CAT和其他,說明桂枝茯苓膠囊可能是通過調(diào)節(jié)以上受體、酶、轉(zhuǎn)錄凋亡蛋白、信號傳導(dǎo)蛋白、炎癥因子,發(fā)揮治療乳腺增生癥的作用。

2.4 GO生物過程富集分析

如圖4所示,關(guān)鍵靶點的GO生物過程富集分析得到142條信息,主要為肌醇脂質(zhì)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、乳腺上皮細胞發(fā)育、細胞對活性氧的反應(yīng)、蛋白質(zhì)在細胞外周定位的調(diào)控、ERBB信號通路、磷脂酰肌醇信號、一氧化氮合酶生物合成過程的正調(diào)控、T細胞共刺激、血管內(nèi)皮生長因子受體信號通路,共計14大類,說明桂枝茯苓膠囊治療乳腺增生癥可能與乳腺細胞增生、氧化反應(yīng)、細胞免疫、血管生成等生物過程有關(guān)。

圖4 GO生物過程注釋餅狀圖Figure 4 Pie diagram of GO biological process

2.5 KEGG通路分析

如圖5所示,根據(jù)P＜0.01,篩得與乳腺增生癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的信號通路共15條,分別為激素相關(guān)的雌激素信號通路、催乳素信號通路、促性腺激素釋放激素信號通路、甲狀腺激素信號通路;血管生成相關(guān)的VEGF信號通路、低氧誘導(dǎo)因子-1信號通路;免疫相關(guān)的T細胞受體信號通路、趨化因子信號通路;炎癥相關(guān)的TNF信號通路、MAPK信號通路;細胞凋亡相關(guān)的凋亡通路、PI3K-Akt信號通路。其中富集因子(richfactor)最大的是催乳素信號通路,富集靶點數(shù)最多的是PI3K-Akt信號通路。

圖5 KEGG信號通路富集分析Figure 5 Enrichment analysis of KEGG signaling pathway

3 討論

乳腺增生癥是最為常見的女性乳腺疾病,好發(fā)于25~45歲中青年女性,臨床以疼痛和腫塊為主要癥狀?，F(xiàn)代醫(yī)學認為體內(nèi)雌、孕激素分泌失調(diào)及雌激素持續(xù)刺激,導(dǎo)致乳腺組織增生而又復(fù)舊不全,是乳腺增生癥發(fā)病的主要原因[6-7]。臨床治療以抗雌激素藥物為主,但此類藥物存在月經(jīng)紊亂、閉經(jīng)等多種不良反應(yīng)[8-9]。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法,明確了桂枝茯苓膠囊12種入血成分治療乳腺增生癥的197個靶點,依據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)中的6個重要拓撲參數(shù),篩選出31個關(guān)鍵靶點,并富集這些關(guān)鍵靶點的GO生物過程及KEGG通路。其中激素方面的關(guān)鍵靶點有雌激素受體α(ESR1)、雄激素受體(AR)、胰島素樣生長因子1型受體(IGF1R)及其配體IGF1;相關(guān)的KEGG通路有雌激素信號通路、催乳素信號通路、促性腺激素釋放激素(GnRH)信號通路等,且催乳素信號通路是所有通路中富集因子最大的。生理情況下,雌激素調(diào)控乳管及管周組織生長;乳腺小葉及腺泡組織發(fā)育為孕激素調(diào)節(jié);而催乳素則發(fā)揮協(xié)同作用。

乳腺組織在各激素的共同作用下發(fā)生周期性變化。當下丘腦-垂體-卵巢內(nèi)分泌軸失衡,患者體內(nèi)雌激素分泌增多,而孕激素分泌不足;同時患者體內(nèi)泌乳素水平升高,其不僅直接刺激乳腺組織,還可抑制黃體期孕酮的分泌,促進雌二醇的合成,從而導(dǎo)致雌孕激素比例失調(diào),在雌激素持續(xù)刺激下最終造成乳腺增生癥[10]。而動物及人體研究均已證實桂枝茯苓膠囊不僅能夠降低乳腺增生大鼠的雌激素,升高其孕激素,進而抑制乳腺增生,還可有效調(diào)節(jié)性激素水平,降低多發(fā)乳腺纖維瘤患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率[11-12]。以上結(jié)果說明,不同于西藥抗雌激素藥物的單純拮抗,桂枝茯苓膠囊主要影響多種性激素的水平或者它們與其受體的作用,通過糾正下丘腦-垂體-卵巢內(nèi)分泌軸的失衡而抗乳腺增生癥。

近年研究還認為乳腺增生癥的發(fā)生、加重、甚至癌變的過程,就是乳腺上皮細胞增殖過度以及凋亡減弱的結(jié)果[13]。我們的預(yù)測分析顯示,桂枝茯苓膠囊抗乳腺增生癥的關(guān)鍵靶點中就包含AKT1、CASP3、BCL2L1、MAPK1、MAPK8、STAT1等多個重要的凋亡調(diào)控蛋白,涉及的通路有凋亡通路、PI3KAkt信號通路等,且多數(shù)關(guān)鍵靶點富集在PI3K-Akt信號通路。明松林等[14]的實驗證實桂枝茯苓湯可以降低Bcl-2蛋白的表達,促進Bax、Caspase-3/9以及Bid蛋白的表達,誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡。吳代陸等[15]則發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt通路與乳腺增生癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其激活后會直接磷酸化下游的mTOR,產(chǎn)生抗凋亡效應(yīng),促進乳腺細胞增殖;而阻斷該通路則可促進乳腺細胞凋亡,發(fā)揮抑制乳腺增生的作用。還有研究表明,胰島素生長因子1(IGF1)、表皮生長因子(EGF)和性激素可通過mTOR通路調(diào)節(jié)乳腺上皮細胞的自噬,使乳腺上皮細胞的增殖與凋亡達到動態(tài)平衡,而本文桂枝茯苓膠囊抗乳腺增生癥的關(guān)鍵靶點就含有IGF1,以及EGF與性激素的受體[16]。由此可見,調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白及通路,促進乳腺細胞凋亡是桂枝茯苓膠囊抗乳腺增生癥的另一主要機理。

此外,增生的乳腺組織常伴有新生血管、氧自由基增多,新生血管越豐富,乳腺增生就越嚴重;而過多的氧自由基使得生物膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),可促進炎癥細胞因子釋放,導(dǎo)致乳腺細胞損傷、增生甚至癌變等[17-19]。我們預(yù)測的桂枝茯苓膠囊抗乳腺增生癥關(guān)鍵靶點還包括血管生成相關(guān)的EGFR、MMP2、KDR、NOS3;以及炎癥因子IL2、氧化還原酶CAT等,涉及VEGF、HIF-1、TNF等信號通路,與乳腺上皮細胞發(fā)育、細胞對活性氧的反應(yīng)、一氧化氮合酶生物合成過程的正調(diào)控、T細胞共刺激等生物過程相呼應(yīng)。張珍珍等[20]發(fā)現(xiàn)桂枝茯苓膠囊可抑制炎性反應(yīng)及細胞因子合成。肖新春等[21]則證實桂枝茯苓膠囊可降低VEGF表達,抑制血管增生。所以,除了調(diào)節(jié)性激素平衡,促進乳腺細胞凋亡外,桂枝茯苓膠囊治療乳腺增生癥機制還可能與抗炎、抗氧化、抗血管生成有關(guān)。

總之,本研究基于桂枝茯苓膠囊的入血成分,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法預(yù)測了其抗乳腺增生癥的作用靶點、生物過程、信號通路,為實驗驗證桂枝茯苓膠囊治療乳腺增生癥的藥理機制指明了方向。